实验七_黑曲霉发酵柠檬酸

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7 黑曲霉发酵柠檬酸

实验七黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验目的
了解产物发酵生产的机理；了解产物发酵生产的机理；柠檬酸发酵的发酵条件掌握发酵过程步骤
实验原理
柠檬酸的发酵
80%的糖代谢走EMP途径
生产菌中存在TCA的酶系
草酰乙酸的来源不是由TCA 供应，而是由2个CO2固定提供，故C0mL三角瓶）每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠其他灭菌物品（每组1套）小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干，培养皿每组1包（每包不少于6个）
问题与思考影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有哪些？素有哪些？试设计分离筛选酵母菌发酵生产酒精实验并阐述酒精产生机理
实验步骤
菌种获得（纯种）种子液制备无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上，用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制成孢子悬液。液体深层发酵无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上，30℃培养5～6天。
后续实验准备黑根霉的分离培养制作马铃薯培养基平板2块单号组用接种环无菌操作，从酒酿样品中挑取 1环，在1块马铃薯培养基平板上进行划线分离。双号组取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻珠的无菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL，在1块马铃薯培养基平板上进行均匀涂布。另外一块平板置于冷藏柜备用。将划好的培养基平板置于517房间30℃培养箱内正置培养3天，至周一进行结果观察和转接。
柠檬酸发酵的条件：柠檬酸发酵的条件：
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）； 3、合适的pH值； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速 250r/m）； 5、限制重金属离子如Mn2＋、Fe2＋、Zn2＋含量。

黑曲霉产柠檬酸

柠檬酸发酵工艺条件的优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。

可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。

实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。

在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。

结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。

另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。

1. 课题背景1.1柠檬酸简介柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。

柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸.分子式：C6H8O7 （相对分子质量：192.13）物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。

极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。

化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。

加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。

柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。

1.2柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。

另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。

黑曲霉液态发酵陈化稻米生产柠檬酸的研究_周建新

370 2008, Vol. 29, No. 09
食品科学
※生物工程
黑曲霉液态发酵陈化稻米生产柠檬酸的研究
周建新，彭雪霁，姚明兰，尚慧颖，朱晓倩，王晓静
(南京财经大学江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏南京 210003)
摘要：研究了接种量、发酵温度与时间、氮源等因素对以陈化稻米为原料，黑曲霉液态发酵法生产柠檬酸的影响，并优化了工艺。结果表明，陈化稻米粉碎后，经 α- 淀粉酶液化得到合适的发酵培养基，液态发酵柠檬酸的优化工艺为：初始培养基 pH 值为 4、加 1% 氯化铵、接种量 1%、发酵温度 34℃、发酵时间 96h，产酸率最高可达到 13.1%。本研究为可陈化稻米的深度开发提供途径。关键词：陈化稻米；黑曲可霉；液态发酵；柠檬酸；发酵条件
2.6 氯化铵浓度对柠檬酸产量的影响分别以 0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% 氯化铵浓
度做实验，发酵条件同 2.5，测定结果见图 5。由图 5 可知，过高或过低的氯化铵都会影响柠檬酸的产量，当培养基中氯化铵浓度达到 1.0% 时，柠檬酸的产量最大。
3 结论
陈化稻米去壳、粉碎后，配成 16% 的料浆，在恒温水浴锅中加 2% α- 淀粉酶升温至 80℃，维持 20～30min 液化。液化后的米粉浆液经过双层纱布过滤后湿热灭菌 (121℃，30min)，可以得到合适的发酵培养基，基质营养均匀，分散性较好。通过单因素试验，优化发酵工艺为：初始培养基 pH 值为 4，加 1% 浓度氯化铵，接种量 1%，发酵温度 34℃，发酵时间 96h。产酸率最高达到 13.1%。
fermentation medium. The optimum initial pH, concentration of NH4Cl, inoculation size, and temperature and time of fermentation are 4, 1%, 1%, 34 ℃ and 96 h respectively. Under the conditions, the productivity of citric acid is 13.1%. The study offers a good

黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程

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实验七黑曲霉发酵柠檬酸

本和提高生产效率。
需要加强黑曲霉发酵柠檬酸的应用研究，探索其在不同领域
的应用潜力。
感谢您的观看
THANKS
06
结论与展望
本实验的结论
黑曲霉发酵柠檬酸实验表明，在适宜的条件下，黑曲霉能够有效地将葡萄糖转化为柠檬酸。
通过优化培养基成分和发酵条件，可以提高柠檬酸的产量和产率。
本实验为黑曲霉发酵生产柠檬酸提供了理论依据和技术支持，为工业化生产提供了参考。
黑曲霉发酵柠檬酸的应用前景
01
柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域。
柠檬酸的生物合成途径主要涉及糖酵解、三羧酸循环和柠檬酸循环三个过程。
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下生成草酸，草酸进一步被还原成柠檬酸。
ABCD
在糖酵解过程中，葡萄糖被降解为丙酮酸，产生 ATP和NADH。
柠檬酸在三羧酸循环中被氧化成二氧化碳和水，同时释放能量供细胞代谢使用。
影响柠檬酸发酵的因素
溶氧量控制
通过控制发酵罐内的搅拌速度和通气量来调节溶氧量，以确保黑曲霉的正
常生长和代谢。
pH值监测与调节
定期监测发酵液的pH值，并适时添加酸或碱来调节pH值至适宜范围。
泡沫控制
通过添加消泡剂或调节搅拌速度来控制发酵过程中的泡沫。
柠檬酸的提取与测定
提取
发酵结束后，将柠檬酸菌泥与发酵液分离，然后用有机溶剂将柠檬酸提取出来。
01
02
03
营养物质
碳源、氮源、磷源等营养物质的种类和浓度对柠檬酸的产量有显著影响。
温度和pH值
适宜的温度和pH值可以提高黑曲霉的发酵活性和柠檬酸的产量。
溶氧浓度
溶氧浓度对柠檬酸的产量也有影响，过高或过低的溶氧浓度都不利于柠檬酸的积累。

产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选

产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选一、实验目的1.了解和掌握柠檬酸发酵菌种黑曲霉的菌种特性和分离方法。

2.初步掌握菌种筛选方法设计。

二、实验原理柠檬酸主要用于食品工业，作为酸味料广泛用于饮料、果酱、水果糖、冰淇淋等，还用于制药、化工、塑料等工业。

能用于生产柠檬酸的菌种有毛霉、青霉、曲霉，其中尤以黑曲霉产生柠檬酸的能力最强，且能利用多种碳源，是生产中最常见的菌种。

黑曲霉广泛存在于自然环境中，空气、水、土壤中都有该菌存在。

本实验根据野生柠檬酸发酵菌种耐酸性的特点，从土壤中分离纯化以获得柠檬酸发酵的野生菌种。

三、仪器与试剂高压灭菌锅、恒温培养箱、干燥箱、超净工作台、恒温摇床、培养皿、三角瓶、烧杯、接种棒、试管、量筒、滤纸、酒精灯等。

四、方法与步骤指示剂法（变色圈法）（一）菌种分离平板采用察氏-多氏琼脂培养基加入0.04%溴甲酚绿：蔗糖30g NaNO3 2g MgSO4·7H2O 0.5gKH2PO4 1g KCl O.5g FeSO4·7H2O 0.01g溴甲酚绿0.4g 琼脂20g 蒸馏水1000ml PH自然。

土壤浸出液稀释以后，涂在上述培养基制成的平板上，于30℃培养。

由于产酸，菌落周围会出现黄色变色圈。

在变色圈还未互相连成一片时，测量变色圈直径（C）与菌落直径（H）之比。

取C/H比例较大者，并且具有黑曲霉特征的菌落挑出接到斜面上（点接法，点接在斜面中部偏下方），筛选时要考虑菌种耐高温、抗杂菌污染及原料。

（二）初筛一般初筛培养基可进行如下选择和设计（1）薯干粉直接发酵：25%薯干粉蒸煮后，用液化型淀粉酶（如枯草杆菌淀粉酶）液化，升温灭酶灭菌后，加入α-萘粉1mg/1或氯化十六烷基吡啶胺1mg/1.（2）水解糖发酵：水解糖稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO32g/1,MgSO4·7H2O O.5g/1，一氟乙酸钠50mg/1。

（3）葡萄糖母液发酵：母液稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO31～2g/1，一氟乙酸钠50mg/1。

实验24-黑曲霉发酵生产柠檬酸

黑曲霉发酵生产柠檬酸柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。

商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。

另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。

柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。

1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。

1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。

我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。

能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。

至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。

目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。

本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。

柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。

将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。

精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。

5.3.1 柠檬酸发酵 1、实验目的了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。

(完整word版)黑曲霉发酵柠檬酸

黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北)生物技术18083108 陈园园摘要：黑曲霉,半知菌亚门，丝孢纲,丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。

广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。

大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力,而黑曲霉的产酸能力更强。

黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。

黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤,了解产物提取的几种方法,学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理,掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。

关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂:样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处)培养基:查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0。

1M NaOH 、0.1M H2SO4实验器材:无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1。

黑曲霉的分离培养①土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。

编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。

一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

②制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0。

2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。

③制备土壤稀释液：1。

称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。

2。

另取无菌离心管2支,用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水.取10－1的土壤稀释液，吸取0。

1mL加入第一只离心管中,并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。

一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法

一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法在工业生产中，柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域。

而黑曲霉是目前最主要的柠檬酸生产微生物，因其高效、高产等优点而备受青睐。

然而，对于黑曲霉发酵生产柠檬酸的方法，如何提高其产量一直是一个备受关注的问题。

本文将从深度和广度的角度，探讨一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。

一、原理解析在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，关键的生产环节是发酵过程。

而要提高柠檬酸的产量，需要从以下几个方面进行优化：发酵菌株的选取、培养基的配方、发酵条件的控制等。

1. 发酵菌株的选取在选择发酵菌株时，需要考虑其对柠檬酸产量的影响。

一般来说，通过筛选高产菌株，可以有效提高柠檬酸的产量。

选择某些高柠檬酸产量的黑曲霉菌株，能够在一定程度上提高发酵产酸量。

2. 培养基的配方培养基的配方是影响柠檬酸产量的重要因素之一。

通过优化培养基的氮源、碳源、矿物盐等成分比例，可以为黑曲霉提供更适宜的生长环境，从而增加柠檬酸的产量。

添加适量的葡萄糖、氨基酸等营养物质，可以刺激黑曲霉的生长，提高柠檬酸的产量。

3. 发酵条件的控制发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件的控制对柠檬酸产量也有着重要的影响。

合理的温度和pH值可以促进黑曲霉的生长和柠檬酸的产生，而充足的氧气供应则能提高发酵效率，进而增加柠檬酸的产量。

二、实践应用上述原理虽然看似简单，但在实际应用中却需要综合考虑各个因素，并进行合理的优化。

在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，可以通过以下方法来提高产量：1. 优化菌株选取首先需要对已有的黑曲霉菌株进行筛选，选择出高产柠檬酸的菌株。

这需要借助研究机构或者实验室的支持，通过采用分子生物学技术等手段进行筛选和改良。

2. 调整培养基配方针对不同菌株、不同生产条件，可以优化培养基的配方，以满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。

在生产实践中，可以根据具体情况进行调整，以获得最佳效果。

3. 控制发酵条件在实际生产过程中，通过精确控制发酵过程中的温度、pH值和氧气供应，可以更好地满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。

柠檬酸发酵

柠檬酸发酵【实验目的】 1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。

2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。

黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。

【实验用品】1. 实验主要仪器摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；分析天平；蒸发器；分光光度计；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。

取A液20mL，B 液80mL混合，静置48 小时后使用2. 材料菌种黑曲霉【方法步骤】1.柠檬酸发酵菌种培养基1升（蔗糖合成培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g，麦芽汁20ml，用水定溶至1000ml）分装、灭菌。

1.4 接种活化的黑曲霉孢子（约0.5%）接种入培养基中，在33-36℃，200-300r/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。

黑曲霉发酵提取柠檬酸

黑曲霉发酵提取柠檬酸实验一黑曲霉保藏菌的复苏实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。

实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。

目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。

发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。

产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。

实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH2、黑曲霉复苏培养基的配制（1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。

（2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2（3）、牛皮纸包扎，灭菌3、保藏菌的活化扩增（1）配制5ºBe’麦芽琼脂培养基（2）20℃麦芽汁，糖度为5（3）加0.7%的琼脂（4）加热，使其沸腾（5）分装与试管中，每管约3ml（6）包扎灭菌，制成斜面培养基（7）在超净工作台上划菌，包扎（8）置于28~30℃培养箱中培养实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。

并加注参考文献。

实验二黑曲霉一级种子的制备实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。

实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。

通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。

实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。

2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。

黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程

黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程1.首先，选择适当的黑曲霉菌种作为发酵的起始种。

First, choose the appropriate Aspergillus Niger strain as the starting culture for fermentation.2.将黑曲霉菌种接种到含有适量碳源和氮源的发酵基质中。

Inoculate the Aspergillus Niger strain into a fermentation medium containing suitable amounts of carbon and nitrogen sources.3.确保发酵基质的pH值在合适的范围内，通常为3.0至6.0。

Ensure that the pH of the fermentation medium is within the appropriate range, typically between 3.0 and 6.0.4.控制发酵温度在25°C至35°C之间，提供适宜的温度条件。

Control the fermentation temperature between 25°C and 35°C to provide suitable conditions for growth.5.确保发酵过程中的通气充足，以促进微生物的生长和代谢活动。

Ensure adequate aeration during the fermentation processto promote microbial growth and metabolic activity.6.在发酵过程中定期监测黑曲霉的生长情况和产酸量。

Regularly monitor the growth of Aspergillus Niger and the production of citric acid during the fermentation process.7.当黑曲霉的生长达到高峰并且产酸量稳定时，进行收获。

实验七_黑曲霉发酵柠檬酸

摇床培养培养24h后测phph748h后测ph及加糖如此持续五天左右即可时间菌丝形态ph值0h无708024h少不明显607048h少丝绒状405072h多丝绒状304096h多小球状3040发酵液预处理1取发酵液经过滤将培养瓶中培养液过滤菌丝用蒸馏水略加洗涤后放入冰箱保存
实验一柠檬酸发酵及其控制
实验目的
了解利用的发酵条件
掌握发酵过程步骤
•基本原理
•1.柠檬酸结构式：
柠檬酸分子式：C6H8O7 •2. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。本试验用中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。 •2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O
发酵液预处理
1取发酵液经过滤将培养瓶中培养液过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后放入冰箱保存。
柠檬酸含量的初步测定
酸度滴定法：将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH滴定酸度。对照亦按同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(g ／L)的大约数。计算公式： CNaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3 C柠檬酸 = ━━━━━━━━━━━━ × 192 3 × 10 ×10-3 式中 C柠檬酸――柠檬酸的浓度(g／L) CNaOH――NaOH标准溶液浓度(mol／L) V滴定发酵液――滴定发酵液所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积 (m1) V滴定对照――滴定对照所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)

利用黑曲霉发酵产生柠檬酸

利用黑曲霉发酵生产柠檬酸摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。

目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。

80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。

随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。

柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。

常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。

关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环1、柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。

另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。

它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。

柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。

2、黑曲霉黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。

广泛分布于世界各地。

食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。

3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC）又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。

黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺的优化

黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。

可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。

实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。

在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。

关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶AbstractCitric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in fermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35℃,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammonium sulfate1. 课题背景1.1柠檬酸简介[1]柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。

黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸

黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸() 清华大学学报自然科学版15ƒ34 ()Jo u rna l o f T singh ua U n ive r sity Sc i & T ech 第 6 期第 52, 55 页 1998 年第 38 卷黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸石忆湘,刘祖同清华大学生物科学与技术系, 北京 100084文摘用紫外线和亚硝基胍诱变相结合的方法, 从野生黑使得一些柠檬酸生产企业无法承受。

而玉米粉资源曲霉菌株出发, 经多次诱变筛选, 得到一株能够较好地利用丰富、价格低廉, 完全可能代替薯干进行发酵。

用玉玉米淀粉生产柠檬酸的黑曲霉菌株. 95。

对. A n ig e r A n ig e r 米淀粉生产柠檬酸受到各方面的密切关注。

95 在摇瓶和发酵罐上用玉米淀粉发酵产生柠檬酸的适宜条1 材料和方法件作了详细研究。

经过比较, 认为摇瓶产生柠檬酸的适宜培( 养基配方及发酵条件为: 玉米淀粉 20% 均为质量分数, 下1. 1 材料)() 同、2% 、012% 、70. r N H 4 SO 4 KH 2PO 4 M gSO 4 H 2O 出发菌株本实验室保存的野生黑曲霉0. 05% , 甲醇 3% , 初始。

接种液体种子 5% , 30? 200 3. 0pH () 菌株。

其柠檬酸产酸率不超过 A sp e rg illu s n ige r发酵 7 , 柠檬酸产量 1018% 。

在 6. 6 的2 型ƒ?rm in dL B io f lo 2% 。

发酵罐上设定30 ?, 500, 600 ƒ, 2. 5, 4. 0, 1. 2rm in pH 培养基斜面培养基、种子培养基: 麦芽汁培ƒ的通气量, 发酵 132 , 柠檬酸产量为 913% 。

可用价格 L m in h)(养基。

其他培养基的配方见表 1 为质量分数。

w 低廉、来源丰富的玉米淀粉代替传统的薯干, 作为发酵生产柠檬酸的原料, 为实际生产奠定了基础。

黑曲霉发酵柠檬酸合成途径与代谢调控

黑曲霉发酵柠檬酸合成途径与代谢调控摘要:柠檬酸是微生物发酵法生产的重要有机酸,用途极为广泛。

我们厂柠檬酸发酵采用的是黑曲霉深层发酵技术，所以对黑曲霉发酵的过程的了解和分析有利于我们实现对发酵的控制和对发酵现在出现的问题从根本上找到解决的途径。

关键词:柠檬酸;黑曲霉合成途径; 黑曲霉代谢调控发酵有机酸以柠檬酸为主,它占酸味剂市场的70 %左右。

柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。

化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。

无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。

一、柠檬酸发酵菌黑曲霉积累柠檬酸的机理1、黑曲霉柠檬酸生物合成途径上面的生物反应可以通过化学方程式来表示：（1）C6H12O6→2CH3COCOOH+2ATP+2NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）葡萄糖通过酵解生成分子的丙酮酸（2）CH3COCOOH+CO2+ATP→C4H4O5+ADP+Pi丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下氧化脱掉一个COOH（羧基）生成草酰乙酸（3）CH3COCOOH＋CoA＋NAD＋→CH3C0-CoA＋NADH＋＋CO2丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下脱氢生成乙酰coa（即活化的乙酸：CH3COOH）（4）C4H4O5+ CH3COOH→C6H8O7草酰乙酸和乙酰coa缩合成为柠檬酸黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸,其生物合成途径现普遍认为是:葡萄糖经EMP、HMP 途径降解生成丙酮酸,丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA ,另一方面经CO2 固定化反应生成草酰乙酸,草酰乙酸与CoA 缩合生成柠檬酸。

(1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。

(3)由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。

黑曲霉的次级产物的提纯

淮北师范大学信息学院07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤：筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化一、菌种的筛选：1、土壤采样：采样人：万纹纹王磊陈晨夏柱宝采样时间：采样地点：环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。

应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。

2、倒平板：将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。

PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然3、制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、310-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。

4、涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上410-、510-和610-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由410-、510-和610-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。

5、培养：将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.6、挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。

孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。

产柠檬酸用黑曲霉的选育

产柠檬酸用黑曲霉的选育产柠檬酸用黑曲霉的选育摘要：利用已有菌种进行分离复壮、斜面培养、麸曲培养，然后发酵，检测产生柠檬酸的量，选择产酸能力较高的菌种，在选出菌种的基础上重复此步骤，挑选出产酸能力最大的菌种，通过实验结果，表明第二次选育的菌种的产酸能力比第一次选育出的种子能够提高75.88％。

关键词：黑曲霉薯粉柠檬酸菌种选育引言柠檬酸又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。

早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。

我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至20世纪70年代中期，已初步形成了生产体系。

柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。

1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。

产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变(induced mutation)筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。

中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。

在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优化菌种的产酸能力。

李文玲等也曾经用Co<sup>60</sup>～γ射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了很大的成果。

欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实力比较雄厚，一般都是集技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。

本文研究的育种方法从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。

黑曲霉产柠檬酸菌种最优发酵条件探究_胡恺夫

实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ｋ1 Ｋ
2
Ｋ3 ｋ1 ｋ2 ｋ3 Ｒ
表 3 第 1次正交实验结果分析
ＡＢＣＤ 2112产酸量 /( )
1
1
1
1
1.5 6
1
2
2
2
0.8 7
1
3
3
3
3.8 0
2
1
2
3
2
2
3
1
0.7 6 0.7 6
2
3
1
2
0.9 9
3
1
3
2
1.2 9
3
2
1
3
1.0 1
3
3
表 4 第 2次正交实验 2112培养基Ｌ9(34)的因素水平表
Ａ淀粉水平
Ｂ(ＮＨ4 )2ＳＯ4
ｐＨ
/( )
/( )
麸皮 /( )
1
22
0.3
3.5
0.6
2
19
0.2
4.0
0.4
3
16
0.1
4.5
0.2
第 7卷第 6期
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
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表 5 第 2次正交实验 2112结果及极差分析
择各因素的相应水平 , 设计正交实验表 , 进行多次出 , 实验室保藏的 11株产柠檬酸菌种在玉米淀粉
正交实验以探索菌种产酸的最优条件。
水解糖培养基中的产酸量均高于葡萄糖和蔗糖的 ,
3.3.3 发酵稳定性实验
选取产酸率较高的 2112菌株为正交实验用菌种。
对获得的菌种及其最优发酵条件进行多次发酵 3.2 正交实验