实验七_黑曲霉发酵柠檬酸

本小组所得结果为：
CNaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3 C柠檬酸 = ━━━━━━━━━━━━ × 192 3 × 10 ×10-3 =0.832g/l
柠檬酸的结晶
步骤： 1.20℃水浴加热 2.加碳酸钙至PH为6.0-6.5之间 3.将溶液过滤，取滤渣，用清水洗净至白色，并将滤渣放入 小烧杯中 4.向滤渣中加水，85℃水浴加热 5.向烧杯中加入10%硫酸，边加边摇至反应彻底至没有气泡 产生 6.将液体过滤，收集滤液，置电炉上加热煮沸浓缩即产生白 色晶体，此为柠檬酸钙
•柠檬酸发酵的条件
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）； 孢子培养基 ：要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，所 以营养不要太丰富； 发酵培养基 ：既要使菌体能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又 要使长好的菌体能迅速合成所需产物 ； 3、合适的pH值，黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵糖，产物以柠檬酸为 主；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/m）； 5、限制重金属离子，如Mn2＋缺乏促进EMP途径畅通， 控制Fe2＋含量使 顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累 。
实验一 柠檬酸发酵及其 控制
实验目的
了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理；
柠檬酸发酵的发酵条件
掌握发酵过程步骤
•基本原理
•1.柠檬酸结构式：
柠檬酸分子式：C6H8O7 •2. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且 酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发 酵时，培养液以pH2~3为宜。 用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发 酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。在一般发酵中， 均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称 为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发 酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及 比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。本试验用 中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。 •2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O
•液体深层发酵 在转速为200rpm旋转摇床上，30℃培养5～6天。
摇床培养 培养24h后测PH，PH=7 48h后测PH及加糖，如 此持续五天左右即可
时间 0h 24h 48h 72h 96h
菌丝形态 无 少，不明显 少，丝绒状 多，丝绒状 多，小球状
PH值 7.0-8.0 6.0-7.0 4.0-5.0 3.0-4.0 3.0-4.0
讨论：问题与思考
•影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有 哪些？ ①菌种②发酵培养基（碳源、氮源） ③纯种发酵与灭菌④无机添加剂⑤pH 对微生物生长的影响⑥溶氧的影响⑦ 温度对微生物生长的影响
实验步骤
•菌种获得
•孢子悬液制备 将购买的孢子与培养液振荡数下制成孢子悬液，放置在25℃的恒温箱培养24h。 •制备柠檬酸发酵培养基 原料：土豆200g，硝酸铵2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.25g，蔗糖150g，水 1000ml
将上述制备的三个培养基（分别为100ml的培养液）放入高压灭菌锅灭菌，待第 二天在其中两个培养基中各加入50ul孢子悬浮液，另一瓶作为对照组。
发酵液预处理
1取发酵液经过滤 将培养瓶中培养液过滤， 菌丝用蒸馏水略加洗涤后放入冰箱保存。
柠檬酸含量的初步测定
酸度滴定法： 将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角 瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH滴定酸度。对照亦按 同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(g ／L)的大约数。 计算公式： CNaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3 C柠檬酸 =ห้องสมุดไป่ตู้━━━━━━━━━━━━ × 192 3 × 10 ×10-3 式中 C柠檬酸――柠檬酸的浓度(g／L) CNaOH――NaOH标准溶液浓度(mol／L) V滴定发酵液――滴定发酵液所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积 (m1) V滴定对照――滴定对照所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)