高效液相色谱测定饮料中的咖啡因-研究生
高效液相色谱法测定咖啡因
四、注意事项
1、流动相和样品溶液需过滤后使用。 2、流动相还进样器。 5、实验结束后要冲洗系统和色谱柱。
五、数据处理
1、根据标准溶液色谱图进行咖啡因成分的定性；
2、绘制标准曲线并打印；
2、计算样品中咖啡因含量。
End！
O H3C N CH3 N N CH3
O
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。
二、实验原理
色谱法
利用混合物不同组分在固定相和流动相中 分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不
同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，
实现分离的分析方法。
色谱法分类
色谱法
气体
超临界流体
液固色谱 （LSC）
液体
液液色谱 （LLC） 胶束电动色谱 （MEKC）
气固色谱 超临界流体色谱 （GSC） (SFC) 气液色谱 （GLC）
键合相色谱 亲和色谱 吸附色谱 (BPC) (AC) （LSC） 尺寸排阻色谱 离子交换色谱 毛细管电色谱 (SEC) (IEC) (CEC)
进样口 高压泵
色谱柱 检测器
流动相溶剂
仪器分析实验
高效液相色谱法测定饮料中的 咖啡因
主要内容
一、实验目的 二、实验原理
三、实验步骤
四、注意事项
五、数据处理
一、实验目的
1、学习高效液相色谱法分离咖啡因的原理。
2、练习高效液相色谱仪的基本操作。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析
的基本方法。
二、实验原理
咖啡中含咖啡因约1.2～1.8%，茶叶中含2.0～4.7%，可 乐饮料和APC药片中均含有咖啡因。 其分子式为C8H10O2N4，结构式：
废液
饮料中咖啡因的高效液相色谱分析
实验21 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因【实验目的】1. 熟悉反相色谱法的工作原理和应用；2. 学习液相色谱仪的基本结构和基本操作；3. 掌握高效液相色谱法定性、定量分析的原理和方法。
【实验原理】1. 基本原理色谱法的实质是一种物理化学分离、分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，经过反复多次的分配实现组分分离。
根据各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性分析；测量各峰的峰面积或峰高，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。
高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱理论，并在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器从而实现分离分析的方法。
根据使用的固定相及分离机理不同，高效液相色谱法分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
（1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱。
（2）反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物，被分离组分按极性从大到小的顺序流出。
液-液分配色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。
反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
2. 咖啡因咖啡因又称咖啡碱，由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，被广泛应用于食品、饮料的生产工艺中，成为各种功能性饮品的重要成分之一。
饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析
实验八饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析一、实验目的1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。
2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。
3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。
二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。
可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：NN N NOO3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。
反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。
本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。
三、实验仪器和试剂1.岛津LC-20A高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。
3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。
（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。
4. 试样市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm1. 色谱柱（XDB-C182. 流动相甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min3. 检测器紫外光度检测器，270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1.制备所需的流动相，有机溶剂用0.45µm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45µm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物 。
高效液相色谱法测定饮 料中咖啡因的含量
2020年8月1日星期六
102.2 实验原理
• 咖啡又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 为l,3,7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或咖啡中提取而得的 一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡 中含咖啡因约为l.2%～1.8%，茶叶中约为2.0%～4.7%。 可乐饮料、APC药片均含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4, 结构式为：
•102.4 注意事项
• （1）钢瓶的工作压力，一定要控制在所规定范围 内，不得超压工作。必须切记，保障安全。 • （2）实验结束后，检查仪器是否正常，关闭是否 正确。
•102.5 问题讨论
•
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
•102.6 参考答案
• 5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（ 1NJECT0位，同时按标记钮(MARKER)，使在记录纸上打 开进样信号。 • 6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续 操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。 • 7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作 ，使每一种标准样获得3个数据。 • 8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或 取5 mL茶液放入50 mL容量瓶中），分别用流动相稀释 至刻度。 • 9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶） 。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量在日常生活中，饮料是我们常见的饮品之一。
而咖啡因作为许多饮料中的一种重要成分，其含量的测定具有重要的意义。
高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的技术，它能够准确、快速地测定饮料中咖啡因的含量。
咖啡因，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，是一种天然存在于咖啡、茶、可可豆等植物中的生物碱。
由于其具有兴奋神经中枢、提高警觉性和缓解疲劳等作用，被广泛添加到各种饮料中，如咖啡、茶饮料、可乐等。
然而，过量摄入咖啡因可能会对人体健康造成一定的影响，如失眠、焦虑、心悸等。
因此，准确测定饮料中咖啡因的含量对于保障消费者的健康和权益至关重要。
高效液相色谱法是一种基于液体流动相和固定相之间的分配作用来分离混合物中各组分的方法。
它具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，适用于各种复杂样品的分析。
在测定饮料中咖啡因的含量时，高效液相色谱法通常采用反相色谱模式，即以非极性的固定相和极性的流动相进行分离。
首先，样品的前处理是测定的关键步骤之一。
对于饮料样品，一般需要进行适当的稀释和过滤，以去除其中的杂质和颗粒物，避免对色谱柱造成堵塞和污染。
对于一些含有较多色素和糖分的饮料，可能还需要进行萃取或固相萃取等净化处理，以提高分析的准确性和可靠性。
在进行高效液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相、检测波长等条件。
常用的色谱柱有 C18 柱，其具有良好的分离性能和稳定性。
流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）组成，并添加适量的酸（如磷酸、乙酸）来调节 pH 值，以改善色谱峰的形状和分离效果。
检测波长一般选择在 270 280nm 之间，因为咖啡因在这个波长范围内有较强的吸收。
仪器设备方面，高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统和数据处理系统组成。
输液系统负责输送流动相，使其以稳定的流速通过色谱柱；进样系统用于将样品准确地引入色谱柱；色谱柱是分离的核心部件；检测系统用于检测分离后的组分，并将其转化为电信号；数据处理系统则对检测信号进行采集、处理和分析，最终给出样品中咖啡因的含量。
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。
可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为：N N3H 3COO NNCH 3定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。
用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。
如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪或上海通微EasySepTM －1010液相色谱仪。
2、色谱柱：Kromasil C18，5µ 150×4.6mm 。
3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。
4、 000mg/L 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。
准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。
5、 测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
6、 平头微量注射器。
四、实验内容1、 标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80μg·mL -1的标准系列溶液。
2、谱仪器条件：泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10μL；柱温：室温。
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因摘要：目的研究了高效液相色谱法直接测定饮料中咖啡因的新方法。
方法采用Hypersil ODS 柱，以甲醇+乙酸铵（0.02mol/L）=15+85 作流动相，流速 1.0mL/min，检测波长207nm，柱温30℃。
结果6min 内将咖啡因与基体分离，咖啡因含量与峰面积在10～200μg/mL 范围呈线性关系，相关系数r=0.9998；回收率范围为97.4％～101.4%。
结论该法准确，样品处理简单。
咖啡因在我们的日常生活中并不少见，它被作为食品添加剂而广泛地应用于饮料中。
除咖啡外，含咖啡因的饮料非常多，其中一类是饮料中天然存在的咖啡因，如可可、茶，另一类是将咖啡因添加在饮料中，如某些汽水、果汁。
1、咖啡咖啡有提神醒脑的效果，因为其中含有咖啡因。
在美国，差不多75％被服用的咖啡因是来自咖啡。
一般来说，市场上一杯普通中杯装即磨咖啡，含有150至200毫克咖啡因，一袋速溶咖啡中咖啡因约为66毫克。
2、茶我们常喝的各种绿茶、红茶、乌龙茶等，都含有咖啡因。
茶中咖啡因含量与泡茶方法、时间有关，绿茶的咖啡因含量从每杯（约227克）30毫克至50毫克不等。
红茶平均每杯含咖啡因约47毫克。
3、汽水很多汽水饮料以及功能性饮料都含有咖啡因，一罐330毫升的可乐咖啡因含量约有33毫克。
由于某些功能性饮料含有咖啡因，会刺激中枢性神经，因此不是所有人群都适宜喝功能性饮料，儿童尤其应注意。
4、巧克力巧克力中的咖啡因含量相对较少，以至于人们常常将其忽略。
一块约40克的牛奶巧克力含有相当于6毫克的咖啡因，另外，巧克力味及咖啡味的牛奶、雪糕、乳酪等也可能含有咖啡因。
咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7—三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%~1.8%，在茶叶中约为2.0~4.7%。
可乐饮料、止痛药等含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：饮料中咖啡因含量的测定方法一般有紫外分光光度法和高效液相色谱法两种。
超高效液相色谱测定饮料中咖啡因的含量
咖啡 因（ Ｃ ａ ｆ ｆ ｅ ｉ ｎ ｅ ） 又称咖 啡碱 ， 属黄嘌呤衍 生物 ， 化学名称 １ ， ３ ， 液， 经微 孔滤膜过滤 ， 滤液 待上机分析 。 １ ． ５色谱 分析 条件 ７ 一 三 甲基黄嘌 呤 ， 为 白色无臭味苦的发亮针丝状或粉末结晶。 熔点 为２ ３ ４ － ２ ３ ８ ℃， １ ７ ８ ℃升 华 ， 能溶于 乙醚 、 丙酮 、 氯仿 、 水， 微溶于 石油 色谱柱 ： ＡＣ Ｑ ＵＩ Ｔ Ｙ—ＵＰ ＬＣ ＢＥ Ｈ Ｃ １ ８ １ ． ７ ｕ ｎ， ｒ 柱温 ： ４ ０ ＂ Ｃ， 醚。 是从 茶叶、 咖啡果 中提炼 出来的一种生物碱 ， 适度地使用有祛除 流速０ ． ３ Ⅱ Ⅱ ／ Ⅱ ｌ ｉ ｎ ， 检测波 长： ２ ８ ６ ｎ ｍ， 进样 量 ： ５ ｕ ｌ ， 流动相为 甲醇 ： 水 疲劳 、 兴奋神经的作用 ， 临床上 用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。 小量 ＝１ ０ ： ９ ０ ， 到３ ａｉ ｒ ｎ， 甲醇 由１ ０ ％ 增 加到９ Ｏ ％， 到４ ａｉ ｒ ｎ ， 再变成 甲醇 ： 水
２结果 与 讨论
１实验 部 分
１ ． １试 剂与 材料
在 同一样品 中添加浓度为２ ０ ｍｇ ／ Ｌ ， ５ ０ ｍｇ ／ Ｌ 进行 回收率试验 ， 同一样品重复进行６ 份测定 ， 观察峰面积 ， 统计数据 的重复性 ， 结果
甲醇 ： 色谱纯 。 亚铁氰 化钾溶液 ： 称取 １ ０ ６ ｇ 亚铁氰 化钾【 Ｋ Ｆ ｅ 得 出回收率和Ｒ Ｓ Ｄ均在允许范 围之 内（ 如表 １ ） 。 （ ＣＮ） ． ３ Ｈ， Ｏ】 加水至 １ Ｏ ０ ０ ｍｌ 。 乙酸 锌溶 液 ： 称取２ ２ ０ ｇ乙酸锌 ３结 语
（ ２ ） 咖啡因标准使用液 ： 准确吸取不同体积咖啡因标准储备液 ， 将 ［ １ ］ 中华人 民共和 国国家标准， Ｇ Ｂ ／ Ｔ ５ ０ ０ ９ ． １ ３ ９ － ２ ０ ０ ３ ， 饮料 中咖啡因的 其稀释成咖啡 因含量分别为ｌ ｕ ｇ ／ ｉ ｎ ｌ ， ｌ Ｏ ｕ ｇ ／ ｍＩ ， ２ ０ ｕ ｇ ／ ｍｌ ， ５ ０ ｕ ｇ ／ ｍ ｌ ， 测定． １ Ｏ Ｏ ｕ ｇ ／ ｍｌ ， ２ ０ ０ ｕ ｇ ／ ｍｌ 的标 准使用液 。 ［ ２ ］ 华东理工大学， 成都科技大 学． 分析化学（ 第四版） ［ Ｈ ］ ． 北京： 高等教 １ ． ３仪 器 与设 备 育 出版 社 。 ｌ ９ ９ ５ ： ３ ２ ４ ．
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
• 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光 度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他 组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配 制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在
色谱图上的保留时间tR（或保留距离）或峰面积A后，可 直接用tR定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.6 参考答案
• （1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。 • 答：反相柱n-C18,是将非极性物质n-C18烷（正构
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.3 操作流程
• 1．标准储备液的配制：准确称取25.0 mg咖啡因标准试 剂，用配制的流动相溶解，转入100 mL容量瓶中，稀释至刻 度。 • 2．用标准储备液配制质量浓度分别为25 g/mL，50 g/mL，75 g/mL，100 g/mL，125 g/mL系列标准溶液。 • 3．启动泵，打开检测器，设置泵的流速为2.3 mL/mm， 检测器的灵敏度设在0.08 AUFS，打开记录仪，将纸速设在1 cm/min。当流动相通过色谱柱约5～10 min．记录仪上基线稳 定后，开始进样。 • 4．将进样阀放在半截（LOAD）位时，用注射器取25 L 浓度最低的标准样（比进佯阀上定量管多5 L以上)，注入进 样阀中。
实验一高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
实验一高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因咖啡因(caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。
为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200 mg/L，我国到目前为止咖啡因仅允许加入到可乐型饮料，其含量不得超过150 mg/kg，为了加强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。
高效液相色谱法(HPLC)是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量的测定方法，简单、快速、准确。
HPLC法检出限:可乐型饮料为0.72mg/L;茶叶、咖啡及其制品为1.8 mg/100g。
一、实验原理咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。
二、试剂1 甲醇HPLC试剂2 乙腈HPLC试剂3 三氯甲烷分析纯（必要时需重蒸）4 超纯水18. 2 M5 无水硫酸钠分析纯6 氯化钠分析纯7 咖啡因标准品纯度98%以上三、仪器和设备1 液相色谱：型号2 色谱柱Bondapak TMC 18 (30 cm X 3.9 mm id)3 预柱RESA VETMC184 超声清洗器(CQ250)5 混纤微孔滤膜四、分析步骤1 试样处理（1）可乐型饮料a 脱气：试样用超声清洗器在40℃下超声5 minb 过滤：取脱气试样10.0 mL，通过混纤微孔滤膜过滤，弃去最初的5mL，保留后5mL备用。
（2）咖啡、茶叶及其制成品：称取1g已经粉碎且小于30目的均匀试样或液体试样放入100 mL烧杯中，先加2 mL～3 mL超纯水，再加25 mL三氯甲烷，摇匀，在超声处理机上萃取1 min(30 s二次)，静置30 min，分层。
将萃取液倾入另一100 mL 烧杯。
在试样中再加20 mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并二次萃取液，加入少量无水硫酸钠和5 mL饱和氯化钠，过滤，滤入50 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至50 mL。
实验四_高效液相色谱分析饮料中的咖啡因
实验四高效液相色谱分析饮料中的咖啡因
一、实验目的
1、掌握高效液相色谱的工作原理及基本结构；
2、了解高效液相色谱色谱柱及检测器的类别；
3、掌握用高效液相色谱进行定量和定性分析的原理；
二、实验原理（预习《仪器分析教程》第十五、十七章，根据下面纲要完成
实验原理的预习）
高效液相色谱是一类应用广泛的现代仪器分析技术，属于分离分析方法。
高效液相色谱主要由：高压输液系统、进样系统、分离系统－色谱柱、检测系统四部分组成。
利用保留时间可以进行定性分析，根据色谱峰高或者峰面积可以进行样品的定量分析。
三、仪器试剂
1、仪器：Agilent 1100高效液相色谱分析系统；C-18反相色谱柱；紫外可见吸
收单波长检测器；手动六通阀进样器；液相色谱用微量进样注射器；
2、试剂：咖啡因系列标准溶液；色谱纯水和甲醇；可口可乐；
四、实验步骤
1、仪器构造和原理讲解；
2、开机用洗脱剂平衡色谱柱半个小时；
3、依次测定系列咖啡因标准溶液的色谱流出曲线；绘制标准工作曲线；
4、测定可乐样品的色谱流出曲线，计算出可乐中咖啡因的含量。
五、数据处理及结果讨论
对实验数据进行分析和讨论。
六、思考题
1、高效液相色谱的流动相为什么要预先除气，常用的除气方法有那些？
2、反相柱的固定相和流动相分别具有什么特征？
3、如何提高色谱柱的柱效？。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因和含量
液 相
色
行校正，这就是校正因子的意义。由于校正因子f′与色谱
谱 法
测
操作条件有密切关系，不易准确测定（不是一个定植），因
定 饮
料
此，在色谱分析中采用相对校正因子fi，既被测物质i和标
中 咖
啡
准物质s绝对校正因子的比。
因 的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
高 效
液
构式为：
相 色
谱
法
测
定
饮
料
中
咖
啡
因
的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光
用 化
度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他
学 实
组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配
验 技
制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 术
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
用
102.6 参考答案
化 学
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
实 验
答：反相柱n-C18,是将非极性物质n-C18烷（正构
技 术
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 8/9
高
动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单
料
中
咖
啡
因
的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
用
102.5 问题讨论
化 学
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
仪器分析-高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量
反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量前言：本次实验报告在前言中简单阐述HPLC 基本原理，介绍HPLC 仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法。
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC 药片中均含有咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式：N N N NCH 3CH 3CH 3OO一、仪器与试药高效液相色谱仪（日本岛津）。
咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司）。
二、方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：C18（4.6x150mm ，5µm ），流动相：甲醇:水=30:70，测定波长280nm ，柱温30℃，流速：1ml/min ，进样量：10μL 。
2.2 系统适用性实验 取供试品20µL 进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留时间为 4.253 min ，各峰与相邻峰的分离度为 ，拖尾因子为 ，符合药典规定，理论塔板数按咖啡因峰计算大于2000。
对照品及供试品的色谱图如下：⑴ 对照品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0510152025303540455055mVDetector A Ch1:280nm1.4981.6104.3005.112⑵ 供试品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min01234567891011121314mVDetector A Ch1:280nm 0.8001.5182.1582.3284.3425.1022.3 溶液制备精密称取咖啡因对照品10mg ，加甲醇定容至10ml 。
高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因
咖啡 因 ，很 多 自然 来 源 的咖啡 因也含 有 多种 其他 黄 嘌呤 生 物碱 ，包括 强 心剂 茶碱 、可 可碱 以及其 他 物质 ，例 如
红 茶饮 料
购 自超市 ；甲醇 、乙腈
均为 色谱 纯 。
１ ． ２ 仪器与 设备 Ｗａ ｔ ｅ ｒ ｓ ｅ ２ ６ ９ ５高 效 液 相 色 谱 仪 ；ＤＯＳ色 谱 柱 为
检测 条件 为 ： 波长 ２ ７ ３ ｎ ｍ， 流动相 乙腈 ： 水＝ ２ ０： ８ ０ ， 柱温 ２ ０ ￣ Ｃ， 流动相流速 ｌ ｍＬ ／ ｍｉ ｎ 。 在０ ～ ２ ０ ｍＬ的浓度范围内 线性关 系良好 ， 加标 回收率为 ９ ９ ． ６ ９ ％。建立 的方法 能够 准确 的测定茶饮料 中的咖啡因含量。 关键词 ：高效液色谱法 ； 饮料 ； 咖啡 因； 测定
Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃａ ｆ ｆ ｅ ｉ ｎ ｅ ｉ ｎ Ｔｅ ａ Ｄｒ ｉ ｎｋ ｓ ｂ ｙ ＨＰ ＬＣ
ＨＵＡＮＧ Ｘｉ ａ ｎ ・ ｑ ｉ ｎ ｇ
（ Ｈ ｅ ｎ ａ ｎ ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ４ ５ ０ ０ ０ ２ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
１ 材料与方法
ＡＰ Ｃ药 片 中均 含 有咖 啡 因。有 咖啡 因成 分 的咖啡 、茶 饮
高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
饮料中的咖啡因的高效液相色谱分析院（系）生化系年级 10化工姓名学号2课程名称基础化学实验报告实验日期 2012年12月27日实验地点 3# 5楼指导教师夏湘黄玉老师一．实验目的（1）熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用；（2）掌握外标定量法。
二．实验原理咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%-1.8%，在茶叶中约为2.0-4.7%。
可乐饮料、止痛药等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，用紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中咖啡因的峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
三．实验用品仪器：高效液相色谱仪、恒流泵、超声波清洗仪、紫外光检测器等。
试剂：甲醇（分析纯）、咖啡因（分析纯）、二次蒸馏水咖啡因标准溶液的配制：（1）标准储备液配制含咖啡因1000ug/mL的甲醇溶液，备用。
（2）标准系列溶液用上述备用液配制含咖啡因20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、320ug/mL的甲醇溶液，备用。
试样市售的可口可乐和百事可乐。
四．实验条件（1）色谱柱长150mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合物，颗粒度10μm 的固定相（2）流动相甲醇-水（60：40），流量0.6m/mim（3）紫外光度检测器测定波长254mm，灵敏度0.08（4）进样量 10μL五．实验步骤（1）将配制好的流动相置于超声波清洗仪上脱气15min；（2）根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，色谱工作六站或记录仪的基线呈平直，即可进样；（3）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，并记录各色谱仪的数据；（4）分别将约20mL的可口可乐和百事可乐试样置于25mL的容量瓶中，用超声波清洗仪脱气15min；（5）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，记录各色谱仪的数据；（6）试验结束后，按要求关好仪器。
高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量
分析检测高效液相色谱法测定茶饮料中的咖啡因含量宁 炜（山西省检验检测中心(山西省标准计量技术研究院)，山西太原 030012）摘 要：建立了高效液相色谱法测定茶饮料中咖啡因含量的分析方法。
试样经预处理后，过0.45 μm微孔水相滤膜，经Promosil C18色谱柱分离，以甲醇和纯水为流动相，等度洗脱，二极管阵列检测器检测。
结果表明，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL与4.91～196.30 μg/mL时线性关系良好，线性系数均大于0.999，加标回收率为96.43%～103.31%，方法的重复性RSD为1.56%，检出限为0.059 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg。
该方法前处理简便，定性定量准确，可用于茶饮料中咖啡因含量的批量快速检测。
关键词：咖啡因；茶饮料；高效液相色谱法Determination of Caffeine in Tea Drinks by HPLCNING Wei(Shanxi Inspection and Testing Center Shanxi Institute of Standard Measurement Technology, Taiyuan030012, China)Abstract: The method for the determination of caffeine in tea beverage by high performance liquid chromatography was established. After pretreatment, the sample passes 0.45 μm microporous aqueous phase filter membrane, separated by Promosil C18 chromatographic column, eluted with pure water and methanol as mobile phase, and detected by diode array detector. The results showed that caffeine ranged from 0.059～1.960 μg/mL and 4.91～196.30 μg/mL, the linear relationship within was good, the linear coefficients were greater than 0.999, the recovery was 96.43%～103.31%, the repeatability RSD of the method was 1.56%, the detection limit was 0.059 mg/kg, and the quantitative limit was 0.2 mg/kg. The method is simple in pretreatment, accurate in qualitative and quantitative analysis, and can be used for rapid batch determination of caffeine in tea drinks.Keywords: caffeine; tea drinks; high-performance liquid chromatography咖啡因，又称咖啡碱，是一种从咖啡或茶叶中提取的黄嘌呤生物碱化合物，具有使人体中枢神经系统兴奋的作用，适度使用可以祛除疲劳、振奋精神，然而长期或超剂量摄入会对人体肝肾功能造成损害，而且其具有成瘾性，停用后会出现身体疲乏、精神不振等症状[1-4]。
饮料中咖啡因的高效液相色谱分析
实验21 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因【实验目的】1. 熟悉反相色谱法的工作原理和应用；2. 学习液相色谱仪的基本结构和基本操作；3. 掌握高效液相色谱法定性、定量分析的原理和方法。
【实验原理】1. 基本原理色谱法的实质是一种物理化学分离、分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，经过反复多次的分配实现组分分离。
根据各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性分析；测量各峰的峰面积或峰高，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。
高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱理论，并在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器从而实现分离分析的方法。
根据使用的固定相及分离机理不同，高效液相色谱法分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
（1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱。
（2）反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物，被分离组分按极性从大到小的顺序流出。
液-液分配色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。
反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
2. 咖啡因咖啡因又称咖啡碱，由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，被广泛应用于食品、饮料的生产工艺中，成为各种功能性饮品的重要成分之一。
实验三、饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析
实验三、饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析――外标法定量一、实验目的1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。
2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。
3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。
二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。
可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：NN N NOO3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。
反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。
本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。
三、实验仪器和试剂1. Agilent 1100 和Agilent 1200 高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。
3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液，备用。
（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因20 ug/mL，40 ug/mL，80 ug/mL，160 ug/mL，320 ug/mL的甲醇溶液，备用。
4. 试样市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件1. 色谱柱（XDB-C18）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm2. 流动相甲醇: 水= 60 : 40，流量1 mL/min3. 检测器紫外光度检测器，270 nm4. 进样量10 uL五、实验步骤1. 将流动相甲醇和水分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.3. 接通仪器和电脑电源，打开计算机，自动出现并运行Bootp Server程序（1200 LC 没有出现此界面）。
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HPLC 法测定饮料中的咖啡因
一、实验目的
1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。
3、掌握高效液相色谱分析条件的选择
4、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、实验原理
咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。
可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为：
N N
3
H 3C
O
O N
N
CH 3
咖啡因的含量可使用反相高效液相色谱法测定。
三、仪器和试剂
1、高效液相色谱仪：Agilent 1100。
2、色谱柱：ODS ， 250×4.6mm 。
3、 流动相：甲醇-水。
4、 咖啡因标准贮备液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。
准确称取0.1000g 咖啡因，用二
次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。
5、 测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
四、实验内容
1、 用标准贮备液配制质量浓度分别为25、50、75、100、125μg·mL -1的标准系列溶液。
2、 色谱仪器条件：泵的流速：1.0mL/min ；检测波长：275nm ；进样量：20μL ；
柱温：室温。
3、 样品处理：
（1）将约100mL 可口可乐置于一250mL 洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min 或用超声波脱气5min ，以赶尽可乐中二氧化碳。
（2）准确称取0.25g 速溶咖啡，用蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
（3）准确称取0.30g 茶叶，用20mL 蒸馏水煮沸10min ，冷却后，将上层清液转移至100mL 容量瓶中，并按此步骤再重复两次，最后用蒸馏水定容至刻度。
将上述三种样品溶液分别进行干过滤，弃去前过滤液，取后面的过滤液。
再分别吸取上述三份样品滤液25.00mL于125mL分液漏斗中，加入1.0mL饱和氯化钠溶液，1mL lmol·L-1 NaOH溶液，然后用20mL氯仿分三次萃取（10mL、5mL、5mL）。
将氯仿提取液分离后经过装有无水硫酸钠的小漏斗（在小漏斗的颈部放一团脱脂棉，上面铺一层无水硫酸钠）脱水，滤液用25mL容量瓶接收，最后用少量氯仿多次洗涤无水硫酸钠小漏斗，将洗涤液合并至容量瓶中，定容至刻度。
（4）将上述三份样品用0.45µm的过滤膜过滤后，注入干燥的样品管中备用。
4、工作曲线的绘制：待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液20μL，记
录下个浓度下咖啡因的保留时间t R和峰面积A，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。
5、样品测定：分别注入样品溶液20μL，根据保留时间t R确定样品中咖啡因色谱峰的位置，
记下咖啡因色谱峰面积A x。
根据样品的峰面积，由工作曲线计算可口可乐、咖啡、茶叶中咖啡因的含量（分别用mg·L-1，mg·g-1和mg·g-1表示)。
五、结果处理。