人类疾病的基因治疗

潍坊教育学院学报一九九六年第二期总第期人类疾病的基因治疗王庆忠摘要本文简要介绍了基因治疗的基本概念和基本原理,并就目前处于试验或临床应用中的各种基因治疗方法作了概述。关键词基因治疗,基因转移,目的基因表达基因治疗是通过遗传操作,在基因水平治疗由基因变异引起的遗传性疾病或后天获得性疾病及癌症的最新临床治疗方法。所谓遗传操作,是指利用基因工程技术向病变细胞或机体细胞导入外源性正常基因,并使其产生正常基因产物以校正或弥补患病细胞基因缺陷,达到治疗疾病目的的技术过程。外源基因导人受体细胞的过程称为基因转移,外源性正常基因称为目的基因。随着医学遗传学的发展和基因工程技术的不断更新,基因治疗在跨人九十年代始业已从幻想走向了现实,并在最近几年取得了巨大进展,治疗范围也扩展到了几乎人类所患所有疾病。根据基因治疗靶细胞的不同,基因治疗分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗两条途径。将正常外源基因引人生殖细胞进行治疗的方法称为生殖细胞基因治疗。很明显,能使生殖细胞中的缺陷基因得到纠正,就能使遗传性疾病在患者当代以及其后代得到根治。但生殖细胞基因治疗涉及一系列伦理学问题,并存在稍有差错将危及后代的潜在治疗危险,因而暂时还未用于人类。目前的基因治疗还只限于体细胞治疗范畴,它以体细胞为治疗对象。概括地说,进行体细胞基因治疗有四个基本策略原位修正缺陷基因。即用基因转移的方法把正常外源基因导人带有缺陷基因的细胞中,经同源重组取代缺陷基因,这是一种精确的原位修正,不会影响邻近的基因序列而导致其它基因异常但由于重组效率低且还有许多实际问题尚待解决,因而尚处于研究之中重新开放功能类似的基因。这是通过操纵人体基因以关闭致病基因或开放功能基因的一种治病方法。研究较多的是通过激活功能相似的胚胎基因以替代有缺陷的成年基因,从而达到基因治疗之目的在人体发育过程中,仅在胚胎时期开放的基因称为胚胎基因,胚胎基因关闭后,由另一些功能相似的基因开放而继续发挥作用,这些基因称为成年基因。当成年基因由于突变而失去正常功能时,可以设法激活功能相似的胚胎基因以替代缺陷的成年基因重新发挥作用。由于人类的基因组成及疾病的分子发病机理远未弄清,因而这一治疗手段离实际应用还有一定距离。利用反义抑制疾病基因表达。反义是一些能与特异的互补的分子,反义与其互补的通过碱基互补形成双链结构后,就可阻止的翻译。因此,利用人工合成的或生物体合成的特定的反义或其化学修饰产物就可抑制或封闭致病基

因表达,达到治疗目的。反义技术能在翻译水平上调节基因的表达,利用这一技术进行基因治疗,方法较为简便。我们只需分离出致病基因的转录产物,来合成反义,再将其导人患者细胞即可抑制致病基因的表达,因而反义技术成为月前最具吸引力和有广阔应用前景的基因治疗手段协基因替代疗法,又称基因添加法·它是利用基因转移方法给病变细胞或个体基因组添加外源性正常基因,以弥补异常基一因的功能缺陷此法是目前已应用于临床实际的体细胞基因治疗的基本方法实现这一疗法的前提条件是要有弥补缺陷基因的外源性正常基因,即目的基因两个基本步骤包括目的基因的转移和目的基因的表达此外,在将基因治疗技术正式应用于人体试验之前,还必须确保转移‘,表达系统绝对安全,使靳基因在靶细胞内表达后不危害细胞和人体自身一、目的基因的转移‘间接基因转移法这是指先将目的基因导人离体的受体细胞中介细胞,经离体培养后再输回体内的方法·在基因治疗中常用的有化学法·如,七十年代初创立的磷酸钙微量沉淀法但对于基因治疗来说,这一方法不是十分有效的,物理法。如,显微注射法、电击穿透法等。病毒介导法。常用逆病毒,如小鼠白血病毒姚载体系统和腺病毒载体系统进行基因重组脂质体介导法。可选择的中介细胞包括骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、角化细胞、肌肉细胞及血管内皮细胞等逆转录病毒载体是目前基因治疗中应用最广、效果最好的载体,美国用于临床试验的近印个基因治疗中绝大部分都是以逆转录病毒作为载体系统的如,由肝内低密度脂蛋白受体基因缺陷引起的家族性高脂血症的基因治疗已获准进人临床实验,其疗法就是通过逆病毒载体将受体基因转导人患者的离体肝细胞中,经离体培养后输回患者静脉,使其在患者体内表达受体蛋白,以降低患者的胆固醇水平·以逆病毒作为基因转移载体在基因治疗中虽然已被广泛使用,但这种基因转移方法也存在一定的局限性,如,它只能整合人增殖分裂的细眠能容纳的外源基因较小小于,以及转导基因的精确调节仍存在问题等。腺病毒载体是近年来构建的基因转移系统,与逆病毒载体相比有其独特的优点腺病毒能感染分裂期的非复制细胞,拓宽了基因治疗中介细胞的采用范围,并且缺陷型重组腺病毒载体导入宿主细胞后不能单独增殖,也不插人受体细胞的基因组,因而安全性高于逆病毒介导的基因治疗此外,腺病毒还具有携带大片段目的基因的潜力,因而近年来格外引人重视,与逆病毒载体一样成为间接基因转移的主要方法直接基因转移法直接基因转移不需要中介细胞,而是直

接把逆病毒或质粒作载体的外源基因重组体、脂质体包裹的外源基因或裸露的等直接注人体内,并使其在细胞内表达外源基因产物。注人途径,据治疗目的及外源基因的情况而选定。已有实验表明,通过骨骼肌心肌、肝、脾、皮下组织、腹膜、静脉壁、动脉壁等注人的外源基因均得到了表达。如,将胰岛素基因用‘脂质体包裹后注人小鼠静脉,可在小鼠肝脾内检出人的胰岛素表达。美国研究人员注射脂质体包裹的一,基因于恶性黑色素瘤患者体内,实验观察到了肿瘤的萎缩甚至梢失·科学家认为,在把目的基因导人细胞方面,脂质体是比病毒更为安全的。尽管如此,逆病毒仍不断被用于直接基因转移血友病乙,是由于患者细胞内缺乏凝血因子基因所致前不久,美国科学家用逆转录病毒作载体将因子基因片段直接注人狗的肝脏内,发现该狗的凝血时询缩短了,而因子的分泌持续仑个月之久。基因枪技术既可用于间接基因转移‘又可用于直接基因转移该技术利用高压放电使重组的基因包被的钨或金颗粒高速射人靶细胞内,在短时间内完成整个导人过程,不仅传递效率高,而且克服宁现有各种基因转移技术的许多缺陷,其应用前景非常广阔用此法对实验动物体内肝、胰、孤骨骼肌等组织进行的外源基因转移,均得到了不同程度的表达’二’目的基因的表达当目的基因被导人受体细胞中并与受体重组后,如何使整合的发挥正常功能就成为基因治疗成败的关键问题由于基因的表达调控机理复杂,目的基因与受体的整合在很大程度上是随机的,因而目的基因的表达还难以有效地人为控制用逆病毒作载体进行的基因治疗中,目的基因的转录可受控于病毒自身的转录信号,但完全依赖病毒自身的启动基因表达,转导的目的基因表达效率并不高在某些基因治疗实验中,把目的基因和它的外加启动子一起拼接到受体上,或将目的基因与某些应答激素基因的启动子相连接,通过给予适当的激活素主动调控目的基因的转录,提高了外源基因表达的精确性例如,美国科学家已成功地将胰岛素基因和它的启动子所谓的基因开关一起导人患者的离体细胞内,经培养后再输回患者体内,此后患者通过服用特制的药物来开启或关闭胰岛索基因以调节胰岛素的分泌,达到治疗糖尿病之目的。现在,许多谬织专一性表达淀向表达的调节片段我们已经明确,可利用这些调节手段来启动基因治疗中目的基因的定向表达‘等用磷酸烯醇式丙酮酸狡激酶启动子与牛生长因子基因重组人逆病毒载体,克隆后经腹腔注射人子宫感染鼠胎肝或注人门静脉并切除部分肝,证实前病毒整合人了肝细胞基因组,并持续表达了个月之久,而且牛生长因子

的表达量受食物刺激信号的调节旖将。启动子与卜‘抗胰蛋白酶基因的一、片段融合驱动人苯丙氨酸狡化酶基因伍,使在肝内专一性表达,为苯丙酮尿症的基因治疗奠定了一定基础等用肌肝激酶调控片段使肌萎缩蛋白在鼠肌肉内得到高效表达,从而避免了采用一般逆病毒启动子表达肌萎缩蛋白效率低、治疗效果差的缺憾,为杜氏肌营养不良综合症的基因治疗另辟了新路但是,更多的、更有效的组织专一性表达的调节片段及其调控机理还未弄清,因而选择能使某目的基因靶向表达的启动片段以及构建有效的表达载体,仍是深人研究的重要问题三、基因治疗展望七十年代初,和应用分子生物学原理把外源片段插人细菌细胞质粒中获得了外源基因表达产物,首开基因转移之先河年,血提出,由于酶的缺失而引起的遗传病可通过向患者的基因组输人正常的遗传信息指导酶的合成,从而进行治疗的基因治疗设想年,美国医生·首次对地中海贫血患者施行基因疗法试验,遗憾的是试验没有取得成功年月日,美国国家卫生院的科学家对一例由腺昔脱氨酶缺乏引起的免疫缺陷综合症咖岁女孩施行基因治疗,首获成功,从而打开了基因治疗时代的大门近几年来,基因治疗的基础研究异常活跃,、临床应用日趋增多,某些遗传病已成为可治之症年,美国有关部门批准了颇基因治疗临床试验年,已批准及正在进行的基因治疗临床试验已达项去年,英国科学家用基因疗法成功地治愈了囊性纤维变性患者,我国也已将血友病和刀一一地中海贫血症列为基因治疗首选对象·’基因治疗被认为是攻克癌症的重要手段早在年,美国的助’·就对晚期转移性黑色素瘤患者进行了较为成功的基因治疗。他们随后于年,对例该病患者实施用肿瘤坏死因子玛修饰的肿瘤浸润胞沙基因治疗方案即从患者体内取出细胞,向其导人基因,然后输回患者体内,结果有半数左右的患者症状出现某种程度的缓解。我们知道,痛的发生与转移是与致癌基因、抑瘤基因、肿瘤转移相关基因和肿瘤转移抑制基因四类基因密切相关的‘在人类细胞中,已发现的致癌基因就达哆种,如氏基因等其中,基因与三分之一的癌症有关能够阻止基因表达,就有可能治愈的癌症患者反义技术用于癌症治疗已取得长足进展将反义一基因重组逆病毒转染肝癌细胞,可阻断一基因表达,抑制肝癌细胞生长反义一基因重组表达质粒转染人早幼粒细胞白血病细胞,可抑制肿瘤细胞增殖并诱导其分化,癌的发生发展还与癌细胞抑制了人体免疫功能有关,因此,许多研究人员正探索通过基因工程技术组建能增强人体免疫功能的疫苗或增强机体免疫力的细胞克隆美国科学家还利用“基因枪

”把编码增强机体免疫力的蛋白质基因射人物深的皮层细胞内,以增强机体的免疫抗癌作用。试验结果表明,一。的鼠肿瘤缩小了。总之,在癌症基因治疗方面,目前正从阻止致癌基因转录、抑制癌基因表达、增强机体免疫抗癌机能等诸方面出发进行治疗,某些治疗方案正在进行临床试验基因治疗将成为获得性疾病的重要治疗手段,这是毫无疑问的,尽管目前在这方面还处于基础研究阶段风湿性关节炎的临床基因治疗已获得美国有关方面的批准,首次实验性治疗对象是名女性患者·动物实验表明,移植神经生长因子玛转基因细胞可加速创伤愈合,促进神经组织生长,为创伤恢复和预后打下了基础将转基因细胞导人模式小鼠脑’组织·可明显缓解早老性痴呆症状。各种基因工程细胞株的构建和应用,将使创伤、感染、传染病等获得性疾病的治疗更为有效,使艾滋病句的根治成为可能科学家早就提出利用反义抑制艾滋病毒的基因表达或通过遗传操作建立阻止病毒复制的转基因细胞株的治疗设想,并且反义抑制病毒繁殖的体外实验已有成功的报道另外,构建有效的转基因疫苗以通过它阻止病毒繁殖或杀伤病毒的研究近年来格外引人注目·人类基因组图谱正在制作之中预计幼年将完成整个制作任务·这一计划的完毕将使人类基因组的大约一万个结构基因被编列定序,从而彻底揭示人类遗传奥秘和遗传病的分子发病机理随着分子生物学的发展,基因治疗技术将日臻完善在不远的将来,我们就可依据人类基因组图谱“按图索卿地分离目的基因,运用技术进行体外扩增,获得目的基因克隆卜选择理想的基因转移方法把目的基因导人受体细胞或患者体内,并有效地控制目的基因在患者体内的表达,达到理想的基因治疗效果,从根本上消除遗传性疾病乃至其它人类疾病参考文献、、,以吴应积等基因治疗前景生物科学动态》,年第期第一页〔幻薛京伦基因治疗遗传》,年第卷期第一页一〔范幕贞人类疾病的基因治疗《百科知识》,年第期第一页孔秀等等·基因治疗·《生物学杂志,年第蝴·第一页·〕赵立平用逆病毒载体技术进行基因治疗《生命的化学》,邻年第卷确第一页〔〕王向丽反义技禾生物学杂志》,年第期,第一页〔王立群基因治疗中自的基因靶向表达的研究注生命的化学》,年第卷期,第一页〔〕章静波血友病乙的基因治疗沈光明日报》,年月日〔永兴美科学家探讨痛症的基因疗法《中国科学报》,年月乐曹曹神经疾病基因治疗进展《生命的化学》,年第卷期第一页