CaMK_在脊髓背角LTP中调节AMPA受体GluR1亚单位的磷酸化

脉 插 管 持 续 监 测 动 脉 血 压 １０．６７￣１３．３３ ｋＰａ （８０～ １００ ｍｍＨｇ）。 用 热 反 馈 系 统 使 大 鼠 肛 温 维 持 在 ３７．０￣３７．５ ℃。 脊 髓 背 角 Ｃ 纤 维 诱 发 电 位 的 记 录 方 法 如 文 献 所 述 ［１２］。 用 钨 丝 微 电 极 （ 电 阻 ０．５￣１ ＭΩ） 进 行 细 胞 外 记 录 ， 电 极 深 度 在 脊 髓 表 面 下 １００￣５００ !ｍ。用数／模转换器（ ＤＴ２８２１－ Ｆ－ １６ＳＥ） 以 １０ ｋＨｚ 的速度处理和储存数据。以 Ｃ 纤维诱发电 位 的 幅 度 作 为 参 数 。 单 方 波 （ １０￣２０ Ｖ， ０．５ ｍｓ， １ ｍｉｎ－ １ ） 刺 激 分 离 的 左 侧 坐 骨 神 经 诱 发 脊 髓 背 角 电 位， 强直刺激（ ４０ Ｖ， ０．５ ｍｓ， １００ Ｈｚ， 持续 １ ｓ， 间隔 １０ ｓ， ４ 次） 诱导 Ｃ 纤维 诱 发 电 位 ＬＴＰ。 坐 骨 神 经 的刺激点到脊髓背角的记录点约为 １１ ｃｍ。 １．３ Ｗｅｓｔｅｒ ｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎ ｔｈｅ ＧｌｕＲ１ ｓｕｂｕｉｎｔ ｏｆ ! － ａｍｉｎｏ－ ３－ ｈｙｄｒｏｘｙ－ ５－ ｍｅｔｈｙｌ－ ４－ ｉｓｏｘａｚｏｌｅ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ （ＡＭＰＡ） ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ－ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ （ＬＴＰ） ｏｆ Ｃ－ ｆｉｂｅｒ ｅｖｏｋｅｄ ｆｉｅｌｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｉｎ ｒａｔ ｓｐｉｎａｌ ｄｏｒｓａｌ ｈｏｒｎ， ａｎｄ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ＬＴＰ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｌｕＲ１ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｔ Ｓｅｒ８３１ ａｎｄ Ｓｅｒ８４５ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｍｂａｒ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｓｐｉｎａｌ ｄｏｒｓａｌ ｈｏｒｎ ａｔ ３０ ｍｉｎ ａｎｄ ３ ｈ ｂｙ ｔｅｔａｎｉｃ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ｅｌｅｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 （１） Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭＰＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＧｌｕＲ１ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｄｏｒｓａｌ ｈｏｒｎ ａｔ Ｓｅｒ８３１ ａｎｄ Ｓｅｒ８４５ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｔ ３０ ｍｉｎ ａｎｄ ３ ｈ ａｆｔｅｒ ｔｅｔａｎｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． （２） Ｓｐｉｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＮ－ ９３， ａ ＣａＭＫＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ｂｌｏｃｋｅｄ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ＬＴＰ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｌｕＲ１ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｔ Ｓｅｒ８３１ ａｎｄ Ｓｅｒ８４５． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｌｕＲ１ ａｔ Ｓｅｒ８３１ ａｎｄ Ｓｅｒ８４５ ｉｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｔｅｔａｎｕｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＣａＭＫＩＩ．
可 能 是 通 过 ＣａＭＫＩＩ 来 实 现 的 。
关 键 词 ： 钙 调 依 赖 性 蛋 白 激 酶Ⅱ； 长 时 程 增 强 ； ＧｌｕＲ１； ＫＮ－ ９３； 磷 酸 化 作 用 ； 脊 髓 背 角
中 图 分 类 号 ： Ｒ３３８．２
文献标识码： Ａ
文章编号： １６７２－ ３５５４（２００７）０３－ ０２４１－ ０５
脊 髓 背 角 Ｃ 纤 维 诱 发 电 位 ＬＴＰ 与 海 马 ＬＴＰ 和中枢敏感化有相同的机制［１１］。然而， 在脊髓 ＬＴＰ 中， 目前还没有证据显示 ＧｌｕＲ１ 哪一个位点被激 活 ， 我 们 先 前 的 研 究 已 经 发 现 ＣａＭＫ ＩＩ 在 脊 髓 ＬＴＰ 的诱导和维持 起 关 键 作 用 ， 但 ＣａＭＫ ＩＩ 是 否 也影响 ＡＭＰＡ 受体的磷酸化水平［５］， 这依然不太清 楚。因此， 本研究将检测（ １） 脊髓背角 ＬＴＰ 期间， ＧｌｕＲ１ 可 能 被 激 活 的 位 点 ； （ ２） 强 直 刺 激 后 ， 脊 髓 局 部 应 用 ＣａＭＫ ＩＩ 选 择 性 抑 制 剂 ＫＮ－ ９３ 是 否 抑 制 ＧｌｕＲ１ 磷酸化水平的升高。
长时程增强（ ｌｏｎｇ－ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ＬＴＰ） 是突 触传递效率的长时程增强， 海马 ＬＴＰ 被认为是学 习和记忆的突触模型［１］， 由于 Ｃ 纤维与脊髓背角浅
层神经元形成突触联系传导伤害感受信 息［２］， 因 此 电刺激 Ｃ 纤维或者是神经损伤引起的脊髓背角 ＬＴＰ 被 认 为 是 痛 记 忆 的 一 种 形 式 ［３］， 一 些 在 海 马
ＣａＭＫ ＩＩ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｌｕＲ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＡＭＰＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓ ｉｎ Ｌｏｎｇ－ Ｔｅｒ ｍ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ－ Ｆｉｂｅｒ Ｅｖｏｋｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｄｏｒ ｓａｌ Ｈｏｒ ｎ
信文君 １， 许继田 ２， 宫庆娟 １， 魏绪红 １， 张 彤 １， 李永勇 １， 刘先国 １ （ １． 中 山 大 学 中 山 医 学 院 生 理 教 研 室 ， 广 东 广 州 ５１００８９； ２． 郑 州 大 学 医 学 院 生 理 教 研 室 ， 河 究 钙／钙 调 素 调 依 赖 性 蛋 白 激 酶 ＩＩ（ ＣａＭＫＩＩ） 在 大 鼠 脊 髓 背 角 Ｃ 纤 维 诱 发 电 位 长 时 程 增
ＡＭＰＡ 受 体 是 ＧｌｕＲ１～ＧｌｕＲ４ ４ 个 亚 单 位 组 成 的多聚体， 在海马 ＬＴＰ 中介导快速的突触电流［８］。 在 所 有 的 ＡＭＰＡ 受 体 亚 单 位 中 ， ＧｌｕＲ１ 对 于 成 熟 动物海马 ＬＴＰ 的建立非常重要 ［９］。ＧｌｕＲ１ 有两个主 要的磷酸化位 点 ， Ｓｅｒ８３１ 和 Ｓｅｒ８４５， 它 们 的 磷 酸 化 作 用可改变 ＡＭＰＡ 受体的功能。体外研究已经证实， ＣａＭＫ ＩＩ 可 以 使 ＧｌｕＲ１ Ｓｅｒ８３１ 发 生 磷 酸 化 ， 而 ＰＫＡ 可磷酸化 Ｓｅｒ８４５ 位点［１０］。
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中 山 大 学 学 报（医 学 科 学 版）
第 ２８ 卷
ＬＴＰ中起关键作用的细胞内信号转导途径， 如蛋白 激 酶 Ａ（ ＰＫＡ） 、蛋 白 激 酶 Ｃ（ ＰＫＣ） 、钙 调 依 赖 性 蛋 白激酶 ＩＩ（ ＣａＭＫ ＩＩ） 等， 在脊髓背角 ＬＴＰ 中也有作 用［４， ５］。由于 ＣａＭＫ ＩＩ在中枢神经系统中分布广泛， 且在与记忆有关的海马脑区密度非常高， 因此 ＣａＭＫ ＩＩ被认为是与ＬＴＰ和记忆最为密切的激酶［６］。 ＣａＭＫ ＩＩ 的 磷 酸 化 对 于 海 马 ＬＴＰ 是 非 常 关 键 ， 它 的激活可导致细胞内 Ｃａ２＋ 浓度升高， 且抑制剂可 阻止 ＬＴＰ 诱导。ＣａＭＫＩＩ 的激活能够磷酸化 ＡＭＰＡ 受体［７］， 从而提高它的单通道电导性。
第 ２８ 卷 第 ３ 期 ２００７ 年 ５ 月
·基础研究·
中 山 大 学 学 报（医 学 科 学 版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＵＮ ＹＡＴ－ＳＥＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）
Ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２００７
ＣａＭＫ ＩＩ 在脊髓背角 ＬＴＰ 中调节 ＡＭＰＡ 受体 ＧｌｕＲ１ 亚单位的磷酸化
Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｃａｌｃｉｕｍ／ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ⅱ ； ｌｏｎｇ－ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ； ＧｌｕＲ１； ＫＮ－ ９３； ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ； ｓｐｉｎａｌ ｄｏｒｓａｌ ｈｏｒｎ．
［Ｊ ＳＵＮ Ｙａｔ－ ｓｅｎ Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ Ｓｃｉ）， ２００７， ２８（３）：２４１－ ２４５］
Ｓｅｒ８３１ 和 Ｓｅｒ８４５ 磷 酸 化 水 平 明 显 增 加 。 脊 髓 背 角 局 部 给 予 ＫＮ－ ９３， 阻 断 了 ＬＴＰ 的 诱 导 并 且 也 阻 止 了 ＧｌｕＲ１ 亚
单 位 Ｓｅｒ８３１ 和 Ｓｅｒ８４５ 磷 酸 化 水 平 的 增 加 。 【结 论 】强 直 刺 激 可 导 致 ＧｌｕＲ１ 亚 单 位 Ｓｅｒ８３１ 和 Ｓｅｒ８４５ 激 活 且 它 的 激 活
Ｓｅｒ８３１ 和 Ｓｅｒ８４５ 位 点 磷 酸 化 水 平 ， 同 时 在 强 直 刺 激 前 ， 脊 髓 局 部 给 予 ＣａＭＫＩＩ 特 异 性 抑 制 剂 ＫＮ－ ９３， 检 测 ＧｌｕＲ１
亚 单 位 Ｓｅｒ８３１ 和 Ｓｅｒ８４５ 磷 酸 化 水 平 变 化 。 【结 果 】 强 直 刺 激 后 ３０ ｍｉｎ、３ ｈ， 脊 髓 背 角 ＡＭＰＡ 受 体 ＧｌｕＲ１ 亚 单 位
方 法 如 文 献 所 述 ， ［５， １３］ 分 离 大 鼠 Ｌ４～Ｌ６ 段 脊 髓， 取刺激同侧脊髓 背 角 ， 于 ｐＨ ７．６、１５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ 的裂解液中匀浆， 裂解液成份见文献， 冰 上 超 声 。４ ℃， １３ ０００ ×ｇ 离 心 １５ ｍｉｎ ， 取 上 清 。 加 样 于 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 凝 胶 上 ， ２００ Ｖ 电 泳 ４５ ｍｉｎ， 后 １００ Ｖ、１ ｈ 转至 ＰＶＤＦ 膜上， 室温封闭 １ ｈ， 一 抗 孵 育 １ ｈ （ １ ∶１ ０００， ｐｈｏｓｐｈｏ－ ＧｌｕＲ１ ａｔ Ｓｅｒ８３１ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏ－ ＧｌｕＲ１ ａｔ Ｓｅｒ８４５ ａｎｔｉｂｏｄｙ） ， 漂洗 ３ 次， 用耦合辣根过氧化物酶的二抗孵育 １ ｈ， 漂 洗 ３ 次， ＥＣＬ 显色 １～３ ｍｉｎ， 曝光。计算机灰度扫 描， 定量分析。 １．４ 统计学处理