临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用
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4.3多种技术综合
美国雅培 AxSYM MEIA 日本东曹MEIA
时间分辨荧光免疫分析
基本原理
TRFIA
TRFIA是用镧系稀土元素螯合物标记抗体或抗原，检 测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免疫分析检测 仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧 光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定 量分析。
临床免疫分析发展趋势 及化学发光技术应用
- 免疫扩散
- 化学发光 - 荧光偏振 - 微粒子酶放大化学发光 - 电化学发光 - 时间分辨免疫荧光
- 免疫沉淀/免疫凝集
- ELISA - IFA
- RIA
- ICT
- 抗体芯片
- 透射和散射比浊 - 流式细胞技术
免疫学和自动化技术在临床免疫学诊断领域中的应用将大大加速
标记免疫学分析技术发展历程
免疫荧光分析(Coons, 1941)
放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960)
酶联免疫吸附分析 (Engvall, 1971)
金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971)
化学发光免疫分析(Arakawa， 1977)
时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990)
化学发光免疫分析（CLIA）
灵敏度高，检测低限达10-19mol 测定范围宽，可达9个数量级
自动化程度高，操作简单
试剂稳定性好，无污染有效期6－24月
BAYER ACS 180
Elecsys 2010 System
AxSYM
Access® 2 Immunoassay System
吖啶酯 异鲁米诺
鲁咪诺系统 AMPPD系统
辉光型
三联吡啶钌三 丙氨系统
闪光型
荧光免疫分析
荧光素
闪光型
【化学发光免疫分析种类】
1.直接化学发光 A 吖啶酯发光 原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物， 在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可 见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度 RLU 与待测抗原浓度成函数关系。 特点：发光过程在 5 秒内完成，激发发光程序简单，测 试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易 水解，影响试剂稳定性。 代表仪器：拜耳公司的ACS180，雅培Architect。
近代临床免疫诊断技术发展历程
临床免疫诊断技术的发展基本历经了以下三个阶段：
化学发光免疫诊断技术（CLIA）
酶联免疫诊断技术（ELISA） 放射免疫诊断技术（RIA）
20世纪 60年代 70年代 80年代 90年代 2000年 2020年 时间
近代临床免疫诊断技术发展历程
方法 中国
1.兴起于20世纪70年代，现仍普遍 使用于县级以上医院； 2.产品处于衰退期； 3.厂商试剂与仪器共同开发，试剂 基本系列化。 1.兴起于20世纪80年代，现普遍使 用于各级临床机构，为我国临床免 疫诊断的基本方法；2.产品处于成 熟期； 3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂 尚未系列化。
TRFIA
Elecsys 2010 System
电化学发光免疫测定（Electrochemiluminescence immunoassay, ECLI）是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合 的产物。 它的标记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同， 是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包 括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启 动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。 最先进的免疫学分析技术之一 非开放性试剂系统； 试剂价格过高
代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。
罗氏 （Roche Diagnostics）
电化学发光检测技术（ELECSYS 1010 ELECSYS 2010） 原理图
操作步骤
1 结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ + N羟 基琥珀酰胺酯（NHS）的抗-HBs和结合了生物素的抗 -HBs与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟
发光检测方法分类和对比
类型 原理 试剂 发光类型 闪光型
化学发光免疫分析 (CLIA)
化学发光酶免疫分析 (CLEIA) 电化学发光免疫分析 （ELCIA)
化学发光物质直接标 记抗原(体)
在酶免疫分析完成后 加入底物 电致化学发光与电化 学手段相结合
根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗原或抗体标 记上荧光素，制成荧光抗 体，再用这种荧光抗体 （或抗原）作为探针检测 组织或细胞内的相应抗原 （或抗体）
欧美
1.兴起于20世纪60年代，现已基本退 出临床应用； 2.产品生命周期已终结； 3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基 本系列化 1.兴起于20世纪70年代，现仍在临床 应用； 2.产品处于衰退期； 3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基 本系列化。
放射免疫法 （RIA） 酶联免疫法 （ELISA）
化学发光免疫 法（CLIA）
英国强生 VitrosECi（鲁米喏）
VitrosECi（鲁米喏） 原理图
【化学发光免疫分析种类】
3、电化学发光 原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体 复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发 出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强 度RLU与待测抗原浓度成函数关系。 特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程 约需25秒，测试速度慢。
1.导入于20世纪90年代，逐步进入 各大中医院； 2.产品处于快速成长期； 3.正逐步实现试剂和仪器共同开发， 试剂逐步系列化
1.兴起于20世纪80年代，现已被临床 普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱 方法； 2.产品处于成熟期； 3.厂商试剂与仪器共同开发，仪器自 动化程度高，试剂系列化状态好。
Leabharlann Baidu 放射免疫技术（RIA）
技术成熟度高
放射性（125 I）污染和危害
125
I 的半衰期短，试剂有效期短
标记物125 I 的稳定性差，批间、批内 的变异较大
标准曲线有效期短，必须每次定标
操作繁琐，出报告时间长 无法保存备用。
Rosalyn Yalow, 1977
酶免疫分析技术 (EIA)
成本低廉 定性、半定量和定量均可以检测 O.D值在低中浓度范围与酶活性呈线性关系 可以肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果
免疫学检验技术发展趋势
阵列芯片
液相悬浮芯片
集成高通量
化学发光
精确灵敏
时间分辨荧光
AlphaScreen 金标免疫层析检测 磁珠免疫层析检测
快速简便
化学发光免疫分析技术及其 在临床诊断中的应用
化学发光免疫分析发展史
CLIA
简史：本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析， 利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超 微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的 常规检测手段。 原理：发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量， 产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同 时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产 额与催化的酶的量成正比,由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质 的含量. CLIA试剂盒国产化程度已经较高，质量与国外产品的差距逐渐减小。 缺乏国产化的自动检测仪器
2
将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵 育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、 抗-HBs连接为一体，形成双抗体夹心法
3
蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁 珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下 面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗-HBs（与 生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出 测量室
原理图
【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光 原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完 成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的 缺点。
代表仪器：德国Byk–Sangtec公司的LIAISON
原理图
【化学发光免疫分析种类】
2、酶促化学发光或持久发光 原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶（ AP) 或辣根过氧化物酶 (HRP)标记在抗体或抗原上，固相抗体或抗原与 AP 或HRP标记的抗原、 抗体复合物在发光底物 AMPPD 或 Luminol 作用下，持续发出可见光， 通过光电倍增管读取光信号。 特点： 碱磷酶体系：水解反应，起光较慢，发光强度较弱，灵敏度 较 高。 辣根酶体系：氧化还原反应，起光较快，发光强度较大。 代表仪器和试剂： 进口品牌：强生 VitrosECi （鲁米喏），美国贝克曼公司的 ACCESS （AMPPD） 。 国产主要厂家：郑州安图（HRP-LUMINOL) 、北京源德（HRPLUMINOL) 、泰格可信（HRP-LUMINOL) 、科美东雅(AMPPD)、威 海威高（HRP-LUMINOL)等
4
蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加 电压，启动ECL反应过程
5
终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室， 准备下一个样品测定
【化学发光免疫分析种类】
4、免疫荧光 4.1时间分辨免疫荧光（TRFIA) 美国 PerkinElmer 芬兰 Wallac 新波 达安基因
4.2光激化学发光（Lica） 博阳
美国雅培 AxSYM MEIA 日本东曹MEIA
时间分辨荧光免疫分析
基本原理
TRFIA
TRFIA是用镧系稀土元素螯合物标记抗体或抗原，检 测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免疫分析检测 仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧 光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定 量分析。
临床免疫分析发展趋势 及化学发光技术应用
- 免疫扩散
- 化学发光 - 荧光偏振 - 微粒子酶放大化学发光 - 电化学发光 - 时间分辨免疫荧光
- 免疫沉淀/免疫凝集
- ELISA - IFA
- RIA
- ICT
- 抗体芯片
- 透射和散射比浊 - 流式细胞技术
免疫学和自动化技术在临床免疫学诊断领域中的应用将大大加速
标记免疫学分析技术发展历程
免疫荧光分析(Coons, 1941)
放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960)
酶联免疫吸附分析 (Engvall, 1971)
金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971)
化学发光免疫分析(Arakawa， 1977)
时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990)
化学发光免疫分析（CLIA）
灵敏度高，检测低限达10-19mol 测定范围宽，可达9个数量级
自动化程度高，操作简单
试剂稳定性好，无污染有效期6－24月
BAYER ACS 180
Elecsys 2010 System
AxSYM
Access® 2 Immunoassay System
吖啶酯 异鲁米诺
鲁咪诺系统 AMPPD系统
辉光型
三联吡啶钌三 丙氨系统
闪光型
荧光免疫分析
荧光素
闪光型
【化学发光免疫分析种类】
1.直接化学发光 A 吖啶酯发光 原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物， 在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可 见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度 RLU 与待测抗原浓度成函数关系。 特点：发光过程在 5 秒内完成，激发发光程序简单，测 试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易 水解，影响试剂稳定性。 代表仪器：拜耳公司的ACS180，雅培Architect。
近代临床免疫诊断技术发展历程
临床免疫诊断技术的发展基本历经了以下三个阶段：
化学发光免疫诊断技术（CLIA）
酶联免疫诊断技术（ELISA） 放射免疫诊断技术（RIA）
20世纪 60年代 70年代 80年代 90年代 2000年 2020年 时间
近代临床免疫诊断技术发展历程
方法 中国
1.兴起于20世纪70年代，现仍普遍 使用于县级以上医院； 2.产品处于衰退期； 3.厂商试剂与仪器共同开发，试剂 基本系列化。 1.兴起于20世纪80年代，现普遍使 用于各级临床机构，为我国临床免 疫诊断的基本方法；2.产品处于成 熟期； 3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂 尚未系列化。
TRFIA
Elecsys 2010 System
电化学发光免疫测定（Electrochemiluminescence immunoassay, ECLI）是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合 的产物。 它的标记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同， 是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包 括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启 动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。 最先进的免疫学分析技术之一 非开放性试剂系统； 试剂价格过高
代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。
罗氏 （Roche Diagnostics）
电化学发光检测技术（ELECSYS 1010 ELECSYS 2010） 原理图
操作步骤
1 结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ + N羟 基琥珀酰胺酯（NHS）的抗-HBs和结合了生物素的抗 -HBs与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟
发光检测方法分类和对比
类型 原理 试剂 发光类型 闪光型
化学发光免疫分析 (CLIA)
化学发光酶免疫分析 (CLEIA) 电化学发光免疫分析 （ELCIA)
化学发光物质直接标 记抗原(体)
在酶免疫分析完成后 加入底物 电致化学发光与电化 学手段相结合
根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗原或抗体标 记上荧光素，制成荧光抗 体，再用这种荧光抗体 （或抗原）作为探针检测 组织或细胞内的相应抗原 （或抗体）
欧美
1.兴起于20世纪60年代，现已基本退 出临床应用； 2.产品生命周期已终结； 3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基 本系列化 1.兴起于20世纪70年代，现仍在临床 应用； 2.产品处于衰退期； 3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基 本系列化。
放射免疫法 （RIA） 酶联免疫法 （ELISA）
化学发光免疫 法（CLIA）
英国强生 VitrosECi（鲁米喏）
VitrosECi（鲁米喏） 原理图
【化学发光免疫分析种类】
3、电化学发光 原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体 复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发 出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强 度RLU与待测抗原浓度成函数关系。 特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程 约需25秒，测试速度慢。
1.导入于20世纪90年代，逐步进入 各大中医院； 2.产品处于快速成长期； 3.正逐步实现试剂和仪器共同开发， 试剂逐步系列化
1.兴起于20世纪80年代，现已被临床 普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱 方法； 2.产品处于成熟期； 3.厂商试剂与仪器共同开发，仪器自 动化程度高，试剂系列化状态好。
Leabharlann Baidu 放射免疫技术（RIA）
技术成熟度高
放射性（125 I）污染和危害
125
I 的半衰期短，试剂有效期短
标记物125 I 的稳定性差，批间、批内 的变异较大
标准曲线有效期短，必须每次定标
操作繁琐，出报告时间长 无法保存备用。
Rosalyn Yalow, 1977
酶免疫分析技术 (EIA)
成本低廉 定性、半定量和定量均可以检测 O.D值在低中浓度范围与酶活性呈线性关系 可以肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果
免疫学检验技术发展趋势
阵列芯片
液相悬浮芯片
集成高通量
化学发光
精确灵敏
时间分辨荧光
AlphaScreen 金标免疫层析检测 磁珠免疫层析检测
快速简便
化学发光免疫分析技术及其 在临床诊断中的应用
化学发光免疫分析发展史
CLIA
简史：本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析， 利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超 微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的 常规检测手段。 原理：发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量， 产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同 时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产 额与催化的酶的量成正比,由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质 的含量. CLIA试剂盒国产化程度已经较高，质量与国外产品的差距逐渐减小。 缺乏国产化的自动检测仪器
2
将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵 育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、 抗-HBs连接为一体，形成双抗体夹心法
3
蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁 珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下 面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗-HBs（与 生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出 测量室
原理图
【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光 原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完 成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的 缺点。
代表仪器：德国Byk–Sangtec公司的LIAISON
原理图
【化学发光免疫分析种类】
2、酶促化学发光或持久发光 原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶（ AP) 或辣根过氧化物酶 (HRP)标记在抗体或抗原上，固相抗体或抗原与 AP 或HRP标记的抗原、 抗体复合物在发光底物 AMPPD 或 Luminol 作用下，持续发出可见光， 通过光电倍增管读取光信号。 特点： 碱磷酶体系：水解反应，起光较慢，发光强度较弱，灵敏度 较 高。 辣根酶体系：氧化还原反应，起光较快，发光强度较大。 代表仪器和试剂： 进口品牌：强生 VitrosECi （鲁米喏），美国贝克曼公司的 ACCESS （AMPPD） 。 国产主要厂家：郑州安图（HRP-LUMINOL) 、北京源德（HRPLUMINOL) 、泰格可信（HRP-LUMINOL) 、科美东雅(AMPPD)、威 海威高（HRP-LUMINOL)等
4
蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加 电压，启动ECL反应过程
5
终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室， 准备下一个样品测定
【化学发光免疫分析种类】
4、免疫荧光 4.1时间分辨免疫荧光（TRFIA) 美国 PerkinElmer 芬兰 Wallac 新波 达安基因
4.2光激化学发光（Lica） 博阳