菌种与种子扩大培养共37页文档
二章节菌种与种子扩大培养精品资料
现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。
（6）毒性试验
自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。
5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；
中圈医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所，成都：新 抗生素菌种。
华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种 6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）； 农业部兽医药品监察所，北京。
（二）菌种的衰退与复壮
（3） IAM （Institute of Applied Microbiology）， University of Tokyo，Japan。
日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。
（4） IFO （Institute for Fermentation）， Osaka， Japan。
发酵研究所，日本大阪。
在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970午7月在国家 科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作 会议，在会上成立了中国微生物菌种保减管理委员会 （CCCMS）委托中国科学院负责担负全国菌种保臧管理业务， 下设六个菌种保藏管理中心。
l）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）；
中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。
实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
菌种与种子扩大培养
菌种与种子扩大培养2008-05-11 15:12:43| 分类：默认分类阅读337 评论0 字号：大中小订阅1.1 微生物工业用菌种1.1.1 发酵工业对生产菌种的要求1)能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高（目标产物的产量尽可能接近理论转化率）。
目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。
2)发酵条件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。
3)菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。
发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。
4)根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株（微生物菌种缺少或丧失了合成某种或多种必需生长因子的能力）或调节突变菌株或野生菌株。
5)抗杂菌、抗噬菌体能力强。
6)菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。
菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
7)菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保证安全。
使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，如早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。
1.1.2 工业上常用的微生物微生物的共同特性1)个体小、构造简单；2)容易培养、易于代谢；3)生长旺盛、繁殖迅速；4)适应性强、容易变异；5)分布广泛、种类繁多工业上常用的微生物发酵工业上常用的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌四大类群。
要求复习微生物知识，掌握工业上常用微生物的基本形态。
此处介绍其中具有工业价值的主要微生物。
细菌细菌是自然界中分布最广、数量最多、与人类关系最为密切的一类微生物，也是发酵工业上使用最多的一种单细胞生物。
细菌的一般结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体及内含物几部分；特殊结构是某些细菌所特有的，如荚膜、鞭毛、芽胞等，它们在细菌的分类鉴定中有重要的意义。
发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌大肠杆菌等。
菌种保藏及种子扩大培养
2. 菌种性能的改变
(1) 菌种的外在特征改变
异核现象导致微生物群体发 生变异
自发突变导致菌种遗传性 能改变
回复突变 降低(衰；2退代) 菌谢菌株能种的力特降的点低生：；个发理体酵状或周况群期体延改特长变征；发抗生不变良化环；境生能产力能降力低。
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3 . 防止菌种衰退的措施
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Байду номын сангаас
一、 种子扩大培养阶段
A： 实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)
原始菌种
斜面试管
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28°C ，4~14天
成熟
（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 °C冰箱保存）
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e.g. （ Glutamic acid-producer ）
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复壮的措施
• 通过分离达到复壮 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混 合培养再分离，达到—菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到—细胞纯
• 通过寄主体达到复壮 将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮 。
•202淘0/5/2汰8 已衰退的个体达到复壮
三、菌种保藏（strain preservation）
保藏应注意的问题：
菌体状态：休眠体
基质：营养贫乏
操作过程：不应对细胞造成伤害
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国内外菌种保藏机构
• 中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM ）
1979年成立，下设6个菌种保藏管理中心 CCGMC 普通微生物菌种保藏管理中心 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 CVCC 2020/5/28 兽医微生物菌种保藏管理中心
第一章菌种与种子扩大培养
溶解氧、渗透压等）
（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短 （4）单产高 （选择野生型、营养缺陷型或调节
突变株）
（5）抗病毒能力强 （6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物
活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素）， 保证安全
四、防止菌株衰退的措施
菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降 低、发酵产品的得率降低
1、衰退的可能原因 （1）、保藏不当 （2）、不能满足生长
2、防止菌种衰退的方法
A、从菌种选育方面考虑 B、尽量减少传代次数 C、创造良好的培养条件 D、利用不易衰退的细胞传代 E用的微生物
微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、 食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化 工等方面。
微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用 于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶 有近千种，而工业上用的不过40－50种。微生 物具有巨大的潜力可挖掘。
工业上常用菌种举例：
（二）菌种选育
1、选育的目的 改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、
降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等 2、选育的方法： A、自然选育； B、生产选育；
C、诱变育种； 1、常用的诱变剂：
2、诱变育种中需要考虑的若干因素 (1)选择合适的出发菌株 产量高、对诱变
剂的敏感性大、变异幅度广 （2）复合诱变剂的使用 单一诱变剂重复使用后突变的效果不好， 可用复合诱变剂来扩大诱变幅度，提高诱 变效果。
曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接 入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入 盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适 用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。
生物工业菌种与种子的扩大培养
第四章生物工业菌种与种子的扩大培养第一节工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏一、微生物菌种的衰退⒈ 菌种衰退的原因菌种衰退的原因有两个方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。
此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。
菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。
由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化，与处于休眠状态的菌种相比，细胞的自发突变率要高得多。
因此，菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。
⒉ 菌种性能的改变⑴ 菌种遗传特性的改变从菌种遗传机理这一微观角度来看，菌种遗传特性的改变主要有如下三个原因。
① 异核现象导致微生物群体发生变异。
② 自发突变导致菌种遗传特性改变。
③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型（亦称遗传型）的个体。
⑵ 菌种生理状况的改变⒊ 防止菌种衰退的措施⑴ 菌种的分离⑵ 菌种的复壮狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。
而广义的复壮应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高，所以，这实际上是一种利用自发突变(正突变)从生产中不断进行选种的工作。
⑶ 提供良好的环境条件⑷ 用优良的保藏方法⑸ 定期纯化菌种二、菌种的复壮⑴ 纯种分离⑵ 通过寄主体进行复壮⑶ 淘汰已衰退的个体三、菌种的保藏⒈ 菌种保藏的原理⒉ 菌种保藏方法⑴ 斜面低温保藏法⑵ 液体石蜡封存保藏法⑶ 固体曲保藏法⑷ 砂土管保藏法⑸ 冷冻干燥法⑹ 液氮超低温保藏法⒊ 菌种保藏的注意事项⑴ 菌种在保藏前所处的状态⑵ 菌种保藏所用的基质⑶ 操作过程对细胞结构的损害第二节工业微生物菌种的选育一、自然选育自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。
第二章 菌种与种子扩大培养
3.同步培养
(1)温度 最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适 宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适 宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可 获得同步细胞。
3.增殖培养
收集到的样品，如含所需菌种较多，可直接 进行分离。 如果样品含所需菌种很少，就要设法增加该 菌的数量，进行增殖(富集)培养。 所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利 于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条 件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分 离它们。
增殖培养（培养基）
例如：筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳
挑选出
2、菌种的纯化选优
微生物容易发生变异和染菌。 一般丝状菌的野生菌株多数为异核体。 生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易 产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然产生突 变株等。 以上会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不 稳定。 如果一个菌种遗传背景复杂，既不稳定，用诱变剂处 理后的变株中，负变率将增加。 特别对诱变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，效果 很差，发酵单位反而变得更低。
③生长圈法
通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌. 工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。 将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物 的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养 物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。 如：嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合 倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生 长圈的菌落为嘌呤产生菌。 同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌，都可 采用营养缺陷型作为工具菌通过生长圈法筛选。
基因工 程
生产用菌种
第二章 菌种与种子扩大培养
3、菌种保藏的方法
菌种保藏的方法很多，一般有下面几种： A 斜面冰箱保藏法（酵母）
斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种Байду номын сангаас，置最适条 件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个 月到六个月。
B 石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面
b 操作方法及步骤
（1）安瓿管要求 由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿 管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用95料或GCl7的玻璃 管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。
（2）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过 程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为10％甘油。用保护剂 制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为 0.2－1mL。
这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特 制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后 将安瓿管真空熔封，并低温保藏。
保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代 替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂 还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。牛奶可以离心或加热的方法脱脂。
D真空冷冻干燥保减法（细菌，防线菌 ）
真空冷冻干燥保臧法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度 下（－15℃），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。 在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。
因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备， 要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外 都已较普遍地应用。
教学课件：第一章-菌种与种子扩大培养
保持菌种的优良性状
在菌种扩大培养过程中，菌种 经过多次传代，但仍能保持其 优良性状，这对于发酵生产的 稳定性和产品质量具有重要意 义。
提高发酵效率
通过菌种与种子扩大培养，可 以获得具有较高活性的微生物 细胞或种子液，从而提高发酵 效率，降低生产成本。
缩短发酵周期
在种子扩大培养过程中，通过 控制培养条件和种子质量，可 以缩短发酵周期，提高生产效 率。
解决方案
采用自动化控制技术，如传感器和控制系统，实时监测和调 整培养条件，确保菌种和种子扩大培养的稳定性和可靠性。
污染问题
污染问题
菌种和种子扩大培养过程中容易受到 杂菌和有害微生物的污染，影响培养 效果。
解决方案
采用严格的消毒措施，如使用高锰酸 钾、紫外线消毒等手段，对培养基、 培养器皿和操作环境进行消毒，同时 选择具有抗性或耐性的菌种进行培养。
学习目标
掌握发酵过程的基本原理和影响因素，理解动力学模型在 发酵过程中的应用，掌握发酵过程的优化与控制策略，了 解实验设计在发酵过程研究中的应用。
THANKS
感谢观看
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菌种与种子扩大培养ຫໍສະໝຸດ 应用在工业生产中的应用发酵工业
菌种与种子扩大培养是发酵工业 的基础，通过培养获得大量微生 物菌体或代谢产物，用于生产酒
精、抗生素、酶制剂等产品。
生物农药
利用菌种与种子扩大培养技术生产 生物农药，如微生物杀虫剂、杀菌 剂等，具有环保、高效的特点。
生物肥料
通过菌种与种子扩大培养技术制备 微生物肥料，能够提高土壤肥力、 促进植物生长。
定义
菌种扩大培养
是指将保藏的菌种经过一定时间、一 定数量的增殖，获得足够数量、具有 一定活性的微生物细胞的过程。
微工第1章菌种与种子扩大培养
第一章 菌种与种子扩大培养
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2021/4/6
保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便
保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生 化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征 及生化指标)。
第一章 菌种与种子扩大培养
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2021/4/6
方法 定期移植低 温保藏法 液氮超低温 保藏法
甘油低温保 藏法 沙土保藏法
箱中保藏。 超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。一
些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。
第一章 菌种与种子扩大培养
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2021/4/6
第一章 菌种与种子扩大培养
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超 低 温 冰 箱
2021/4/6
冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液 中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌 种长期保藏的非常有效的方法之一。
第一章 菌种与种子扩大培养
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2021/4/6
菌种保藏
目的：保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生 产性能。
基本原理：根据菌种的生理生化特点，创造条件使菌种的 代谢活动处于不活泼的状态。
基本原则：选用优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的 环境。
休眠环境：微生物生长繁殖和代谢受抑，不易突变的环境， 一般要求低温、缺氧、缺营养、添加保护剂、干燥等。
*复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件
第一章 菌种与种子扩大培养
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2021/4/6
*2 种子扩大培养
将保存在沙土管、冷冻干燥管中处休眠状态 的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或 摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和 质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
第一章 菌种与种子扩大培养