植物液泡膜Na+／H+逆向转运蛋白的研究与应用
植物中液泡膜H+—PPase的研究进展
植物中液泡膜H+—PPase的研究进展摘要液泡膜H+-PPase是一种广泛存在于很多生物体内的H+转运酶，主要介绍近年来该酶在植物抗逆性以及植物生长的调节作用上的研究进展。
Abstract The Vacuolar-Type H+-Pyrophosphatase widely exists in many organisms as a H+ transport enzyme.The recently research progress on the plant resistance and the effect of the regulation of plant growth in the Vacuolar-Type H+-PPase were introduced.Key words Vacuolar-Type H+-PPase；plant resistance；auxin；gluconeogenesis植物体中存在Ⅰ型（A VP 1类）和Ⅱ型（A VP 2类）2种类型的H+-PPase，其中Ⅰ型H+-PPase定位在液泡膜上，而Ⅱ型H+-PPase定位在高尔基体膜上[1]。
笔者将定位于植物液泡膜上的H+-PPase称为液泡膜H+转运无机焦磷酸酶（H+-pyrophosphatase，H+-PPase，EC 3.6.1.1）。
液泡膜H+-PPase是一类与膜结合的不可溶酶类，广泛存在于植物和少数藻类、原生动物、细菌以及原始细菌中[2]。
在高等植物中，液泡膜H+-PPase结构相似并且以二聚体形式存在[3]。
早在20世纪80年代初期，Chuichill和Sze就利用燕麦根制备的膜微囊制剂检测到了PPase的活性与质子跨液泡膜转运的关系，发现了PPi的水解驱动质子跨膜转运。
现在人们普遍认为植物中液泡膜H+-PPase可与同在液泡膜上的H+-ATPase一起形成H+跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质（如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等）分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力[4]。
Na_H_逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展
( Z ygosaccha rom yces roux ii) 。这些研究表明质膜 Na +/ 此外 ,从蓝藻中克隆的质膜 Na +/H +逆向转运蛋白
H +逆向转运蛋白基因是酵母在酸性环境中耐盐的一个 基因 S ynN haP, 可以恢复大肠杆菌 N haA, N haB , ChaA
关键基因 。
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 26 No. 5 2006
逆 向 转 运 蛋 白 的 基 因 也 被 克 隆 , 分 别 为 : SOD2 向转运蛋白具有很高的同源性 。拟南芥 SOS1 突变体
( S ch izosaccha rom yces pom be ) , Z 2SOD2 和 Z 2SOD 22 对盐超敏感 ,表明 SOS1在植物耐盐性中起重要作用 。
向转运蛋白 。该蛋白与细菌和真菌的质膜 Na +/H + 逆
表 1 已克隆的质膜 Na +/ H +逆向转运蛋白基因 (括号内为 GenBank登陆号 )
Table 1 A set of pla sma m enbrance Na +/ H + an tiporter have been cloned
2006, 26 (5)
陈观平 等 : Na +/H +逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展
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因 (ApNhaP)在淡水生长的藻青菌中过量表达发现 ,表 持植物的生长 。
达 ApNhaP的藻类能够在含 0. 5mol /L NaCl的培养液中 2. 1 液泡膜 Na + / H +逆向转运蛋白基因的克隆
1. 3 质膜 Na +/ H +逆向转运蛋白的转基因工程研究 过 量 表 达 质 膜 Na +/H + 逆 向 转 运 蛋 白 实 验 表 明 , Na +/H +逆向转运蛋白对 Na + 的外排 , 维持胞质内的低
液泡膜阳离子转运蛋白在植物抗逆过程中的功能研究进展
液泡膜阳离子转运蛋白在植物抗逆过程中的功能研究进展作者：高天歌马翠敏王锁民来源：《安徽农业科学》2020年第21期摘要液泡是细胞内一种可以储存多种营养物质以及代谢产物的细胞器。
为了抵御高盐、干旱和重金属毒害等非生物胁迫，植物可以通过将细胞质中过量积累的Na+、K+、Ca2+和其他金属阳离子区域化至液泡中，以此来维持正常的细胞膨压并提高植物的抗逆性。
液泡膜阳离子转运蛋白种类丰富，能够调控细胞中不同无机离子的转运和区域化。
鉴于此，对定位于液泡膜的不同阳离子转运蛋白在植物响应逆境胁迫中的作用进行了简要概述。
关键词液泡膜转运蛋白;阳离子;抗逆性;功能中图分类号 Q945 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）21-0001-05Abstract Vacuole is a kind of organelles that can store a variety of nutrients and metabolites in cells.In order to resist the harsh environments such as salinization， drought and heavy metal pollution， plants can change the turgor and improve its stress resistance by compartmentalizing the excess ions， such as Na+， K+， Ca2+ and other metal cations， in the cytoplasm into vacuoles.There are many tonoplastcation transporters regulated the transport and compartmentalization of different ions.In view of this， we mainly summarized the roles of different tonoplast cation transporters in plants responding to stresses in this review.Key words Tonoplast transporters;Cation;Stress tolerance;Function逆境胁迫是对植物生长发育造成不利影响的各种环境因素的总称，可分为生物胁迫和非生物胁迫[1]。
农杆菌介导的拟南芥液泡膜Na～+-H～+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)转化烟草和马铃薯的研究
农杆菌介导的拟南芥液泡膜Na～+-H～+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）转化烟草和马铃薯的研究农杆菌介导的拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）转化烟草和马铃薯的研究引言：盐胁迫是全球范围内影响作物产量和品质的主要因素之一。
高盐环境会导致土壤中钠离子（Na+）浓度增加，进而影响植物的正常生长和发育。
在适应高盐环境的进化过程中，植物进化出了一套复杂的离子调控机制。
其中，液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白（sodium hydrogen exchanger，NHX）被认为在植物耐盐机制中起着重要作用。
材料与方法：本文以拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtNHX1基因为研究对象，通过农杆菌介导的遗传转化方法将其转化到烟草（Nicotiana tabacum）和马铃薯（Solanum tuberosum）中。
转基因植株通过PCR和Southern blot等分子生物学技术进行鉴定。
结果：经PCR验证，成功构建了携带AtNHX1基因的表达载体，并将其转化到烟草和马铃薯中，获得了转基因植株。
Southern blot结果进一步证实，在转基因植株的基因组DNA上能够检测到与AtNHX1基因特异性探针相互匹配的带。
进一步研究发现，转基因烟草和马铃薯在高盐条件下显示出了更好的耐盐性，与野生型植株相比，转基因植株的生长情况更加健壮，并且与转基因植株相比，野生型植株在高盐环境下的生长状况明显受到抑制。
此外，转基因植株的根系和叶片中Na+离子的积累量显著降低，叶片中钾离子（K+）积累量增加。
这表明，AtNHX1基因的表达增加了植物对外界盐胁迫的适应能力，并调节了细胞内Na+/K+离子平衡。
讨论：AtNHX1基因的成功转化到烟草和马铃薯中，为进一步研究该基因在其他作物中的功能和应用提供了基础。
同时，本研究的结果也揭示了AtNHX1基因调控植物耐盐性的机制，即通过调节细胞内Na+/K+离子平衡来减轻外界高盐环境对植物生长发育的负面影响。
拟南芥液泡膜Na_H_逆向转运蛋白研究进展.
土壤盐渍化是个世界性问题,目前,世界上约20%的耕地和近50%的水田遭受高盐胁迫,随着世界范围土地盐化、次生盐渍化的不断加剧,研究植物对盐胁迫的适应性,以提高植物的耐盐能力,对于农业的健康发展具有重要的意义。
拟南芥(Arabidopsis thaliana 液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白(AtNHX1是拟南芥中最丰富的Na +/H +逆向运输蛋白,它在影响细胞pH 值的维持、离子动态平衡及调节蛋白质运输方面起着重要的作用[1]。
在高盐浓度下,植物可利用液泡膜H +-ATPase 及PPiase 产生的驱动力,利用Na +/H +逆向转运蛋白把Na +在液泡中区隔化以消除Na +毒害,从而达到耐盐的目的[2]。
因此,拟南芥液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白(AtNHX1在耐盐中起到重要作用,对培育耐盐农作物尤为重要。
简要综述了AtNHX1基因及Na +/H +逆向转运蛋白AtNHX1的特征,AtNHX1的耐盐机制以及植物耐盐基因工程改良等方面的研究进展。
1AtNHX1基因及Na +/H +逆向转运蛋白AtNHX1的特征液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白的活性首先是在甜菜(Beta vulgaris 贮藏组织的液泡膜囊泡检测到的[3]。
随后,Gaxiola 首次从拟南芥中克隆出与啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae NHX1非常相似的液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白基因AtNHX1,该基因拟南芥液泡膜Na +/ H +逆向转运蛋白研究进展李志亮1,2黄丛林2王刚3吴忠义2*(1邯郸学院生物科学系,邯郸056005;2北京农业生物技术研究中心,北京100089;3河北师范大学生命科学学院,石家庄050016摘要:盐分是植物生长发育的主要限制因素之一,而离子在胞内区室之间的选择性运动对提高植物耐盐性是至关重要的。
来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana 的AtNHX1基因可编码Na +/H +逆向转运蛋白,而Na +/H +逆向转运蛋白AtNHX1可将细胞质中多余的Na +排进液泡来消除Na +的毒害,维持细胞的渗透平衡,提高植物的耐盐性。
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植物跨膜离子转运蛋白与其耐盐性关系研究进展西北植物,2OO6,26(3):0635--0640ActaBot.Borea1.一Occident.Sin.文章编号:1000—4025(2OO6)03—0635—06植物跨膜离子转运蛋白与其耐盐性关系研究进展王景艳,张高华,苏乔,安利佳,刘兆普h(1南京农业大学资源与环境科学学院,南京210095;2大连理工大学基因工程实验室,辽宁大连116024)摘要:盐胁迫下植物吸收过多的Na,使植物体内的离子平衡受到破坏,为了维持其正常生长细胞内的各种离子就必须保持平衡.而这一过程主要是由位于质膜和液泡膜上的离子转运蛋白完成的,并在植物耐盐性方面起关键作用.本文主要对响应盐胁迫的几种跨膜转运蛋白如:K/Na离子转运蛋白,Na/H逆向转运蛋白以及与其相关的H一ATPase等,在植物耐盐分子生物学方面的研究进展进行综述.关键词:盐胁迫;跨膜离子转运蛋白;K/Na离子转运蛋白;Na/H逆向转运蛋白;H一ATPase;耐盐性中图分类号:Q945.78文献标识码:A ResearchAdvancesabouttheRelationbetweenMembrane—spannedIonTransporterandSaltToleranceinPlantsW ANGJing—yan,ZHANGGao—hua,SUQiao,ANIA—jia,LIUZhao—pu'(1CollegeofResourcesandEnvironmentalScience,NanjingAgricuhuralUniversity,Nanji ng,210095,China;2GeneEngineeringIJab.DalianUniversityofTechnology,Dalian116024.China)Abstract:Undersaltstress,planttakeupexcessiveNaSOasmaketheionequilibriuminsideth eirbodieslosebalance,andinordertomaintaintheirgrowth,theyneedmaintainthisequilibrium;Thispr ocessisper—formedbyiontransportersonplasmlemmaandvacuolemembraneandplaysacrucialroleinpl antsalttol—erance.Thepapersummarizedtheresearchadvancesinplantsalttolerancebiologyaboutsev eralmem—brane—spannediontransporters.suchasK/NaJ.transportersandNa/Hanti—portersandtheirrelatedH一ATPase,whichrespondtosaltstress.Keywords:saltstress;membrane—spannediontransporter;K/Natransporter;Na/Hanti—porter;H一ATPase:salttolerance盐分对植物的伤害主要包括两方面:其一,土壤中较高的溶质浓度导致的水分亏缺;其二,植物吸收水分的同时吸收了过多的盐离子所带来的离子毒害,特别是Na毒害.高浓度Na可置换质膜和细胞内膜系统所结合的Ca,膜所结合的离子中Na/Ca比增加,膜的通透性增大,同时,植物体内活性氧代谢系统的平衡受到影响,活性氧含量增加,而活性氧清除剂(s()D等)活性及含量降低,膜脂过氧化或膜脂脱脂作用被启动,而导致膜的完整性被破坏,差别透性丧失,电解质及某些小分子有机物大量渗漏,细胞物质交换平衡破坏,进而导致一系列生理生化代谢紊乱,使植物受到伤害.植物降低Na的毒害的主要策略有离子外排和区域化,这两方面都与植物跨膜离子转运蛋白有着密切的关系.收稿日期:2005—09—15;修改稿收到日期:2006—01—21基金项目:国家863海洋生物技术资助项目(2003AA627040)作者简介:王景艳(1982一),女(汉族),在读硕士生.*通讯联系人Correspondenceto:IAUZhao—pu.E—mail:************.cn636西北植物1植物K+,Na+转运蛋白与耐盐性的关系钾是植物正常生长所必需的大量元素之一,参与植物许多生理生化过程包括酶活性调节,蛋白质合成皮渗透调节等,对植物生长起着非常重要的作用].因此保持胞质内较高的K/Na比对于植物生长非常必要.但在植物受到盐害时,这种高的K/Na比值往往由于Na含量的增加而降低,这主要是因为K和Na具有相似的水合离子半径,使得部分运输K的载体亦有运输Na的功能].一般认为植物对K的吸收主要有两种系统:系统1为低亲和性K吸收系统,在外界K浓度较高(1～10mmol/I)时介导K的吸收,是一种被动的K吸收过程,需要消耗能量,主要靠K通道来完成;系统2为高亲和性K吸收系统,在外界K浓度较低(0.001～O.2mmol/I)时介导K的吸收,主要由K载体完成l_l1].1.1低亲和性K通道已确定的K通道大致可分为3种类型:内向整流K通道(Kinwardrectifyingchannels,KIRCs),外向整流K通道(Koutwardrectifyingchannels,K()RCs),电压不依赖型阳离子通道(volt—ageindependentcationchannels,VICs).内向整流K通道(KIRCs)是对K浓度敏感的,依赖电压的,对K亲和力低的通道l3],如拟南芥的AKT1l5],主要存在于细胞的质膜上,具有特殊的电势依赖性,在细胞膜超极化(hyperpolarization)的电压条件下被激活打开,即在跨膜电势很低时被打开,引起胞外的K流入胞内].而拟南芥AKT1缺失突变体与野生型对盐分所表现出的相似敏感性表明:AKT1没有或极少有运输Na的功能I.外向整流K通道(KORCs)在质膜去极化时开放,介导K外排及Na内流].通过膜片钳技术已从许多植物品种和组织中鉴定到K()RCsE.从大麦根中分离出的KORCs具有较高的K/Na选择性,而从拟南芥根细胞中得到KORCs却对Na有较高的选择性|】¨.这些通道中有一种无选择性外向整流通道(nonselectiveoutwardrectifyingcon—ductance,NORC)对阳离子吸收没有特殊选择性,胞质内Ca离子浓度上升即可将其激活.许多研究表明,植物细胞质膜上还存在电压不依赖型阳离子通道(voltageindependentcation channels,VIC),这些通道比电压依赖型通道(KIRC和K()RC)具有较高的Na/K选择性|1.1998年Amtmann和Sandersl】提出了不同阳离子通道的简单模型并认为电压不依赖型通道是高盐环境中Na吸收的主要途径.1.2高亲和性K载体目前从植物根中分离的高亲和性K运输载体有两种,其一为与细菌(Achromobacter)和酵母(Satha7一omycescerevisiae)同源的KUP—HAK基因家族(K—uptaketransporter—highaffinityK transporter)[;其二为HKT1(highaffinityK transporter)运输体,即高亲和性K运输体HKT～.在拟南芥中已发现6个编码KUP—HAK高亲和K运输载体的同源基因,大麦中也发现HK1和AvHAK2基因l】.HAK运输体通过K/H协同作用发挥效应并有较高的K选择性,Na一可在毫摩尔浓度范围内竞争性阻碍HAK运输K.,且大麦AvHAK1在毫摩尔Na浓度下可介导Na一吸收.小麦TaHKT1是第一个从植物中鉴定的编码HKT1蛋白,在微摩尔Na浓度下为Na/K协同运输体,在毫摩尔Na浓度下为Na单向运输体..而拟南芥AtHK7'1只运输Na",水稻HKT有2个基因编码,OsHK7'1类似AtHK7'1为Na运输体,而OsHK7'2类似'nHK了'1可作为Na一/K协同运输体或单向运输体,OsHK7'1基因转录活性在低外界K浓度下增加而在高外界Na浓度下降低l2.Rus纠等的研究结果进一步表明HKT1蛋白在Na'吸收中的重要作用.盐胁迫条件下,拟南芥hktl—sos3双突变体植株Na含量明显降低,甚至比野生型还低,而K含量明显高于野生型.由此可见AtHK7'1不只是K运输系统,它也控制Na内流,是Na和K内流系统调节者(regulator),同时也可能控制Na进入木质部进而控制Na向地上部分的运输.以上结果可以看出,部分吸收和运输K的转运蛋白确实有吸收和运输Na的功能,但其具体的3期王景艳,等:植物跨膜离子转运蛋白与其耐盐性关系研究进展!吸收机制和调控机制仍不清楚.2植物Na+/H+逆向转运蛋白与耐盐性的关系Na/H逆向转运蛋白(NaH'.antiporteror exchanger,NHAorNHE)是酵母,藻类,动物以及高等植物膜系统上普遍存在的一种转运蛋白,是一种依赖跨膜的Na,H浓度梯度而产生的电中性的Na/H1:1跨膜转运蛋白_2.高等植物质膜和液泡膜上的Na/H逆向转运活性分别以质膜上的P 型H一ATPase和液泡膜上的V型HATPase,H一PPiase建立的跨膜质子梯度作为驱动力,驱动Na运出细胞或运进液泡.2.1植物液泡膜Na/n逆向转运蛋白目前研究较多的是液泡膜Na/H逆向转运蛋白,主要有拟南芥的AtNHX1,水稻的OsNHX1_2],小麦的TaNHX1_2,柑橘的cN—HX1[,番杏TtNHX1[3ol,玉米ZmNHX[],碱蓬的SsNHX1(AF370358),北滨藜的AgNHX1_3以及盐角草的SeNHX(AY131235)等.它们都有高度保守的氨氯吡嗪咪结合位点(即?FF??LIPPI).Na对液泡膜Na/H逆向转运蛋白基因的诱导作用因部位不同而有差别.在NaC1胁迫下,拟南芥的AtNHX1mRNA水平在叶中是对照的4倍,而在根中几乎与对照无差异【3.盐胁迫能促进北滨藜的根和叶中AgNHX1mRNA的转录及蛋白产物的增加_3.水稻幼苗用100mmol/INaC1处理24h后,地上部的0sⅣHX1基因的转录水平比根中高,且地上部和根中分别是对照的2.3和1.8倍, 证明0sⅣHX1经盐诱导后的表达增强且具有器官特异性_2.但无论在正常生长条件下还是在盐分胁迫下,液泡膜Na/H逆向转运蛋白活性和表达的调控机制还不十分清楚.对于植物液泡膜Na/H逆向转运蛋白基因的遗传转化研究发现,转单一的Na/H.逆向转运蛋白基因能够明显提高作物的耐盐性.ApseC等对转AtNHX1基因的拟南芥植株进行了分析, 过量表达Na/H逆向转运蛋白的转基因拟南芥植株在200mmol/LNaC1中能正常生长发育;免疫印迹表明,从转化植株叶片中提纯的液泡比从野生型中具有更多的AtNHX1的基因表达产物,液泡膜上Na/H逆向转运蛋白活力增强.将北滨藜的AgNHX1转入水稻中发现,转化植株的耐盐性是对照植株的8倍,且可以在300mmol/L的NaC1胁迫下存活3d.Zhang等m将拟南芥的AtNHX1基因转入番茄中,发现过量表达液泡膜Na/H逆向转运蛋白的转基因番茄在200mmol/LNaC1胁迫下能够正常生长,开花和结实,且叶片中Na浓度较高,而番茄果实中Na浓度却很低.2.2植物质膜Na/H逆向转运蛋白相对于植物液泡膜Na/H逆向转运蛋白来说,质膜Na/H逆向转运蛋白(SOS1,saltoverly sensitive)的研究较少.2002年美国亚利桑那大学植物科学系Zhu等以拟南芥为研究材料,通过快中子轰击(fastneutronbombardment),T—DNA诱变或化学突变(如EMS诱导)等分析手段,筛选盐敏感SOS突变体(saltoverlysensitive),从而鉴定了5个耐盐相关基因,即:0S1,S02,S03,SOS4和SOS5e.～.01基因编码一个含有1146个氨基酸残基,分子量为127kD的多肽(SOS1).它的N端具有高度疏水性,并含有12个跨膜结构域;亲水性的C端较长(约700个氨基酸残基),残留在细胞质中, SOS1蛋白N端的12个跨膜结构域与动物或微生物的Na'./H逆向转运蛋白(antiporter)结构域相当相似.Na/H逆向转运同源蛋白的进化树分析表明,拟南芥SOS1与其它植物,细菌和真菌质膜Na/H逆向转运蛋白,如裂殖酵母(f^Dsnff^n—romycesp017lbe)的SOD2,啤酒酵母(Schizosaccha—romycescerevisiae)的NHA1以及假单胞杆菌(Pseudomonaasaeruginosa)的NhaP等的亲源关系较近,而与动物质膜和植物液泡膜Na/H逆向转运蛋白关系较远,如NHE6,AtNHX1等.因此, SOS1很可能就是拟南芥质膜上的Na/H逆向转运蛋白,在功能上起到把Na排出细胞外的作用.Northern分析检测SOS1基因在盐胁迫下的表达情况【d:在没有盐胁迫因子存在的情况下,检测到0S1mRNA;盐胁迫因子正调控SOS1 mRNA,这个调控是针对NaCI的,它不发生在脱落酸或冷害处理的条件下,SOS1mRNA在拟南芥的根部的含量比在枝叶中多,在根部和地上部SOS1 的表达都是由NaCI胁迫因子正调节的,这个正调控是与SOS1耐Na离子的作用相一致的.638西北植物以上实验结果表明,Na/H逆向转运蛋白活性的有无和高低与植物的耐盐性密切相关,在高盐浓度下植物可以分别通过质膜和液泡膜上的Na/H逆向转运将Na运出细胞和将Na区域化在液泡构,维持细胞质内Na稳态和K/Na比相对稳定,以适应盐渍环境.3植物H+一ATPase与耐盐性的关系盐胁迫使植物质膜受到破坏,大量Na涌入细胞,从而也破坏了植物体内原有的电势平衡.植物质膜H一ATPase,液泡膜H一ATPase和Ht_PPase均具有维持细胞质内的pH值的稳定,为细胞吸收和转运营养物质及离子提供质子驱动力(PMF:pro—tonmotiveforce)l一蛇等生理功能,Na的外排和区隔化也都依赖跨膜电化学势梯度提供能量.最近对拟南芥质膜H一ATPase的研究结果表明,质膜H一ATPase可能决定植物的耐盐性".拟南芥编码质膜H一ATPase的AH4基因主要在根内皮层和花中表达,H4的缺失突变体(aha421)植株在NaCI胁迫下,根及地上部的Na/K比对照增加4～5倍,表明HA4可调控Na跨内皮层流动.盐胁迫能够激活植物液泡膜H一ATPase活性和质子泵的H转运能力,主要包括蛋白丰度的提高,动力学特征的改变,亚基成分的变化及表达调控的改变等.对盐生植物碱蓬液泡膜H十_ATPase的研究表明,NaCI胁迫明显增加了碱蓬液泡膜H十_ ATPase的水解活性和酶活性,促进了其A,B,H,e亚基的转录及蛋白表达产物的增加.植物液泡膜H一PPase主要负责H向液泡内的转运,控制胞质pH值稳定及焦磷酸代谢.过量表达拟南芥液泡膜H一PPase转基因植株的Na/H逆向转运蛋白活性增强,明显提高了其耐盐性和抗旱性.4结语在盐胁迫下,植物维持体内离子的平衡是植物对盐胁迫适应及耐盐性的关键因素.目前研究较多的是Na'的区隔化,即对植物液泡膜Na/H逆向转运蛋白及相关H一ATPase的研究,Na的吸收及外排机制却还并不清楚.因此,随着分子生物学技术的不断发展,关于植物Na的吸收,外排,K/Na选择性及其调控机制,以及各种机制之间关系将成为今后的研究热点,这对今后植物耐盐新品种的培育及盐碱地的利用都有着重大意义.参考文献:[1]刘友良,汪良驹.植物对盐胁迫的反应和耐盐性[A3.余叔文,汤章诚.植物生理-j 分f-*t-:物学i-M].北京;科学出版社,1998:752—767.E23潘瑞炽,董愚得.植物生理学(第三版)[M].北京:高等教育出版社,2000:29—3(). 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Na^＋／H^＋逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展
Na^＋／H^＋逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(5):101～106Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展术陈观平王慧中h(1杭州师范学院生物化学与分子生物学杭州市重点实验室杭州施农农陈受宜3100362中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101)摘要NaVH逆向转运蛋白与植物的耐盐性有密切的关系.在高等植物体内,主要存在两种NaVH逆向转运蛋白,分别为位于细胞质膜上的逆向转运蛋白SOS1,以及存在于液泡膜上的AtNHX1.质膜Na+/H逆向转运蛋白主要负责Na的外排,液泡膜NaVH逆向转运蛋白主要负责把Na区隔化入液泡.过量表达质膜Na+/H逆向转运蛋白SOS1或液泡膜NaVH 逆向转运蛋白AtNHX1能够明显提高植物的耐盐性.对植物中NaVH逆向转运蛋白及其与植物耐盐性之间的关系最新研究进展作一概述.关键词转基因植物耐盐性NaVH逆向转运蛋白中图分类号Q816土壤盐渍化是造成农作物产量下降的重要原因之一,盐害可以造成植物体离子失衡和渗透胁迫,并引发植物的氧化伤害,使植物生长减缓甚至死亡.在盐胁迫下,植物的三种耐盐活动是非常重要的:第一,减轻盐胁迫带来的伤害;第二,建立新的稳态;第三,维持生长_lJ.为了能够适应高盐环境,植物必须维持胞质内较低的Na离子水平.植物可以通过三种方式来减轻Na在胞内对植物造成的毒害作用,即Na的外排,Na的区隔化以及Na的分泌作用【.研究表明,在高盐浓度下植物可以通过质膜和液泡膜上的Na+/H逆向转运蛋白,逆Na浓度梯度将Na运出细胞或将Na区隔化在液泡内,以维持细胞质Na稳态和Na/K比相对稳定,减少Na对胞质中细胞器的毒害.同时,通过液泡膜上的Na+/H逆向转运蛋白把Na区隔化入液泡,又降低了细胞的渗透势,促使细胞从外界胁迫环境中吸水以继续维持渗透平衡,具有调节细胞质内pH值和Na浓度的功能_3J,因此成为其增强植物适应盐胁迫的原因.转Na+/H收稿日期:2005.12-29修回日期:2006-03-01十国家自然科学基金资助项目(30370132)和浙江省自然科学基金资助项目(302061)十十通讯作者,电子信箱:*************逆向转运蛋白基因能够明显提高植物的抗盐性[,.一些重要植物中质膜和液泡膜Na+/H逆向转运蛋白基因相继被克隆,为其在农业上的应用提供了可能性.本文对质膜和液泡膜Na+/H逆向转运蛋白在耐盐方面的研究进展作一概述.1质膜Na+/H逆向转运蛋白植物Na+/H逆向转运蛋白活性首次在大麦中发现_4J,并将其定位于质膜,质膜Na+/H逆向转运蛋白主要与植物对Na的外排有关,是植物抗拒盐离子毒害的首个屏障.在植物体内,质膜H.ATPase利用水解ATP的能量把H从细胞质中泵出细胞,产生跨膜的H电化学势梯度,提供能量,驱动质膜上的Na+/H逆向转运蛋白,使H顺其电化学势进入细胞.同时Na逆其电化学势排出细胞,以维持胞质内的低Na水平.1.1质膜Na+/I-I逆向转运蛋白基因的克隆在酵母中首次克隆了质膜Na+/H逆向转运蛋白基因.Banuelos【J和Prior等_6_在筛选NaC1耐性酵母时,发现在酸性条件下啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)利用质膜Na+/H逆向转运蛋白把Na排出细胞外,以此适应盐环境.后来他们成功克隆到编码102中国生物工程杂志ChinaBiotechn010g)rV o1.26N0.52006 该蛋白的基因NHA1.目前,酵母中编码其他Na+/H逆向转运蛋白的基因也被克隆,分别为:SOD2 (Schizosaccharomycespombe).Z—SOD2和Z—SOD22 (Zygosaccharomycesrouxii).这些研究表明质膜Na+/H逆向转运蛋白基因是酵母在酸性环境中耐盐的一个关键基因.在植物中,Zhu等[]从拟南芥中克隆了SOS1基因(SaltOverlySensitivity1),它编码一个质膜Na+/H逆向转运蛋白.该蛋白与细菌和真菌的质膜Na+/H逆向转运蛋白具有很高的同源性.拟南芥SOS1突变体对盐超敏感,表明SOS1在植物耐盐性中起重要作用.此外,从蓝藻中克隆的质膜Na+/H逆向转运蛋白基因SynNhaP,可以恢复大肠杆菌NhaA,NhaB,突变体的盐敏感性表型_8J,说明SynNhaP对在质膜上的Na+/H交换,及对增强植物耐盐性可能具有重要作用.表1已克隆的质膜NaVH逆向转运蛋白基因(括号内为GenBank登陆号) Table1AsetofplasmamenbranceNa+/Hantiporterhavebeencloned物种基因水稻(Oryzasativa)拟南芥(Arabidopsisthaliana)接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)蓝藻(Synechocystis)小立碗藓(Physcomitrellapatens)OsNHX(SOS1)(AY785147)AtNHX(SOS1)(AF256224)SOD2(AJ872204),Z—SOD2(D43629),ZSOmEp(AB010106),SOD2—22(AJ252273) NHA1(Z73311)SynNhaP(NC000911)PpNHX(SOS1)(AJ564258)1.2质膜Na+/H逆向转运蛋白的结构特征及其表达的调节SOS1定位于叶和根的质膜上,它的分子量为127kDa.在SOS1和其他质膜Na+/H逆向转运蛋白氨基酸序列中,均存在一个非常保守的Na结合区,没有发现氨氯吡脒(Na通道阻断物)结合位点.其N末端为一个疏水结构,可能由10～12个跨膜结构域组成,跨膜区和微生物,动物的Na+/H逆向转运蛋白序列类似.SOS1序列的另一个特征是它有个长的亲水尾部,将近700个氨基酸,尾部面向细胞质,这样就有更多机会跟那些调控逆向转运蛋白活性的诸多蛋白相互作用,以此达到调节Na+/H运输,适应盐环境的目的_9J,见图1.图1SOS1结构示意图.示跨膜区的疏水结构及C尾的亲水结构'1Fig.1ProposedtopologicalmodelofSOS1.Theboxesindicateputativehydrophobictransmembranedomains,andthehydrophibicC-terminaltail1.3质膜Na+/H逆向转运蛋白的转基因工程研究过量表达质膜Na+/H逆向转运蛋白实验表明,Na+/H逆向转运蛋白对Na的外排,维持胞质内的低Na浓度水平,对植物在盐渍环境中的生长起着非常重要的作用.从耐盐的藻青菌中克隆的Na+/H逆向转运蛋白基2006,26(5)陈观平等:NaVH逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展103因(ApNhaP)在淡水生长的藻青菌中过量表达发现,表分,维持植物的生长.达ApNhaP的藻类能够在含0.5mo~LNaC1的培养液中2.1液泡膜Na/H逆向转运蛋白基因的克隆生长[.这表明ApNhaP为藻青菌耐盐的关键基因.NaVH逆向转运活性首次被发现是在甜菜根部贮从耐盐酵母(Zygosaccharomycesrouxii)中克隆了质藏组织的液泡膜上[J,之后,许多具有液泡膜NaVH膜Na+/H逆向转运蛋白基因ZrSOD2和质膜H一交换活性的植物陆续被发现,如:甜菜(Betavulgaris),冰ATPase基因ZrPMA1,两者在酵母中共表达发现,当pH叶日中花(Messembryanthemumcrystallinum)以及拟南芥为5.0时,它对NaC1的耐性有轻微的增加,而对LiC1的(Arabidopsisthaliana)等.表2列举了近些年来克隆的耐性则非常明显.但当pH为6.5时,它对NaC1的耐性液泡膜Na/H逆向转运蛋白基因.不如转单一ZrSOD2基因,而对LiC1的耐性几乎消失.已经克隆的植物液泡膜上Na+/H逆向转运蛋白基这揭示了酵母中NaVH逆向转运蛋白的活性可能与因有拟南芥的AtNHX1,水稻的OsNHX1,北滨藜的pH值有关[].AgNHX1,柑橘的cNHX1,盐地碱蓬的SsNHX1,小麦的Zhu等【l3J用CaMV35S启动子驱动拟南芥TaNHX1,番茄的LeNHX1等. (Arabidopsisthaliana)质膜Na+/H逆向转运蛋白SOS1从玉米中克隆的6个全长基因,ZmNHX1-6,与液泡基因,并使它在拟南芥中过量表达,发现它显着提高了膜NaVH逆向转运蛋白具有很高的同源性,而与质膜拟南芥的耐盐性.与对照相比,转基因植物生长状况良NaVH逆向转运蛋白的同源性不高_l.发育分析表好,且只在木质部和芽中积累少量的Na.明:ZmNHX1,2,6与拟南芥的AtNHX1,2,水稻的2液泡膜H逆向转运蛋白'等Nass等【HJ在筛选酵母cnbl突变体的抑制子时,发源性.现了1个与耐盐性有关的新基因NHX1,它编码Na+/Ohnishi等_l7_从矮牵牛中克隆了1个液泡膜Na+/H逆向转运蛋白,定位于液泡膜上负责将Na区隔化H逆向转运蛋白基因InNHX2,他们发现开花前入液泡.将Na的区隔化入液泡,是酵母及植物降低胞12hlnNHX1在花中表达,但几乎不在根,茎,叶中表达和质内Na水平的另一条途径,它一方面减少了Na在细不受盐处理的诱导,而InNHX2则不同,它受盐处理诱导胞质内对细胞器的毒害作用,另一方面也降低了植物细后在根茎叶中都有表达,而且在开花前短期也有较高的胞的渗透势,有利于植物在高盐低渗的环境下吸收水表达量.表2已克隆的液泡膜Na~/H逆向转运蛋白基因(括号内为Genebank登陆号) Table2AsetoftonoplastNa+/Han廿porterhavebeendoned物种基因拟南芥(Arabidopsisthaliana)水稻(Oryzasatlva)小麦(Triticumaestivum)玉米(Zeamays)油菜(Brassicanapus)番茄(Lycopersiconesculentum)牵牛(1pomoeanil)柑橘(Carusparadisi)滨藜(J4￡lexgmelini)盐地碱蓬(Suaedasalsa)J4￡M1(AF007271),AtNHX2(AC009465),J4￡(AC0011623),AtNHX4(AB015479),J4￡^(AC005287),J4￡^(AC010793)M1(AY324877),M(AY360145)M1(AY040245),^(AY040246),(AY296910)M1(AY270036),ZmNHX2(AY270037)Zm^(AY270038),^(AY27oo39)ZmNHX5(AY270040),ZmNHX6(AY270041)nⅣ删1(AY189676)M1(AJ306630),LeNHX2(AJ306631)^r月1(AB033989),Ⅳ删2(AB194065)dV^1(AY028416)AgNHX1(AB038492)ssNHX,(261806,2.2液泡膜Na+/H逆向转运蛋白的结构特征及其表达的调节酵母液泡膜上的NaVH逆向转运蛋白(NHX1)是一个内在蛋白,它的N端结构域含有12个跨膜的片104中国生物工程杂志ChinaBiotechno1og)rV o1.26No.52006 段,由633个氨基酸组成.拟南芥的Na+/H逆向转运蛋白(AtNHX1)与酵母的NHX1结构相似,由538个氨基酸组成J.拟南芥液泡膜Na+/H逆向转运蛋白可以分为9个跨膜结构域和一个亲水C端结构域.跨膜区为疏水,呈螺旋状,含有Na结合的重要残基.这些区域含有阳离子运输的结构,其中的3个疏水区为非跨膜结构,而与液泡膜显示出一定的关联[【8].其N端处于胞质中,而几乎整个的C端亲水区处于液泡膜内(图2).AtNHX1的转录水平受NaCI,KCI和ABA的诱导,但不受冷,旱诱导.且AtNHX1可能对特定细胞中pH值的调节和K+的稳态起着重要作用.研究发现,去掉Na+/H逆向转运蛋白的亲水c端后,极大的增加了对Na+/H的运输.Na/K的运输比率也为完整AtNHX1的两倍,这种变化是由于相对减少的对K/H的运输和大量增加的对Na+/H的运输所导致.这显示液泡膜Na+/H逆向转运蛋白的调节机制跟它的c端亲水区的选择性调控存在很大的关系Ll引.图2AtNHX1结构示意图,示跨膜区的疏水结构及C尾的亲水结构Fig.2ProposedtopologicalmodelofAtNHX1.Theboxesindicateputativehydrophobic transmembranedomains,andthehydrophilicC-terminaltail2.3液泡膜Na+/H逆向转运蛋白转基因工程研究Apse等…在拟南芥中,Zhang等[J在油菜和番茄中过量表达来自拟南芥液泡膜的Na+/H逆向转运蛋白基因AtNHX1,发现转基因拟南芥,油菜和番茄均能够在200mmolfLNaCI存在条件下生长,开花和繁殖.在水稻中过量表达来自滨藜(Atriplexgmelini)液泡膜的Na+/H逆向转运蛋白基因AgNHX1发现,转基因液泡膜Na+/H逆向转运蛋白活性是非转基因的8倍,转基因水稻能够在300mmolfLNaCI条件下存活3天.在小麦中过量表达来自拟南芥液泡膜的Na+/H逆向转运蛋白基因AtNHX1,发现在100～150mmolfL的NaCI条件下,转基因株系比非转基因株系叶中Na累积少,而K多.在严重的盐胁迫下,转基因小麦的植物生长水平,萌发率明显要比非转基因的强.这些结果显示,在盐胁迫环境下,可以通过过量表达Na+/H逆向转运蛋白基因AtNHX1来提高小麦的耐盐性和粮食的产量【.在Na-A TPase和Na+/H逆向转运蛋白缺陷型的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中过量表达水稻的液泡膜Na+/H逆向转运蛋白基因发现,水稻Na+/H逆向转运蛋白系统不仅能够作用于Na,也能够对Li,K,Rb起作用.Zhang等[]在玉米中过量表达拟南芥液泡膜的Na+/H逆向转运蛋白基因AtNHX1,得到了22.8%的阳性植株.耐盐性鉴定得出的几个株系及它们后代的耐盐性都有了提高,且一些株系的种子能够在0.8%～1.0%的NaCI中发芽生长.过量表达液泡膜Na+/H逆向转运蛋白对植物的耐盐性起着非常重要的作用,植物通过液泡膜Na+/H逆向转运蛋白实现Na的区隔化入液泡,从而既维持了胞质内的低Na浓度水平,减少其对细胞器的毒害,又降低了细胞的渗透势,实现植物在胁迫环境下的较好生长.3Na+/H逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系过高的钠离子浓度将对植物器官造成伤害,故植2006,26(5)陈观平等:NaVH逆向转运蛋白与植物耐盐性关系研究进展105 物体内形成了一系列的调节适应机制来减轻盐胁迫带来的危害.耐盐棉花品系ZM3受盐诱导后,GhNHX1mRNA转录水平分别是盐敏感品系ZMS17和ZMS12 的3倍和7倍,且盐胁迫和ABA能够强烈诱导棉花种子中的GhNHX1转录产物的积累【.用高浓度NaC1 和KC1处理水稻,发现在根和芽处,OsNHX1的表达有了很大的提高[.这都揭示了Na+/H逆向转运蛋白在植物的耐盐中起着非常重要的作用.盐胁迫下Na十/H逆向转运蛋白活性增加,原因有二:一是诱导了Na+/H逆向转运蛋白的合成,二是激活了原有的无活性的Na*/H逆向转运蛋白.位于质膜和液泡膜的Na+/H逆向转运蛋白共同作用,维持胞内Na及细胞渗透势的稳定,使植物细胞器不受盐离子的毒害以及不会在高盐环境下失水.盐敏感的植物主要依靠质膜上Na+/H逆向转运蛋白对Na的外排,而耐盐植物则在液泡中积累大量的Na,从而使细胞质内Na保持在较低水平.相对而言,液泡中Na的区域化集中对植物耐受或抵抗高盐胁迫所起的作用是非常大的.从植物整体而言,植物体根部是直接接触高盐环境的器官,因此根部的排盐和植物体地上部分细胞对盐的区域化集中是植物耐盐性的重要决定因素.4展望植物中质膜和液泡膜Na+/H逆向转运蛋白基因相继被克隆,这为其在农业上的应用提供了可能性.在植物体内过量表达质膜Na+/H逆向转运蛋白(例如SOS1)及液泡膜Na+/H逆向转运蛋白(例如AtNHX1)都能明显提高植物的耐盐性,这是近来基因工程提高作物抗盐的两个重要策略.继Blumwald等【J 转AtNHX1基因的油菜和番茄成为第一批具有实用价值的耐盐农作物之后,利用基因工程培育出抗盐的转基因作物新品种,对植物的耐盐遗传工程起着越来越重要的指导作用.我国淡水资源严重匮乏,且农业的发展面临着人口增多,可耕地减少的挑战,因此,充分利用盐碱地及培育一批耐盐作物尤为重要.利用分子生物学手段,把植物中的Na/H逆向转运蛋白转移到非抗盐的经济作物中,培育出耐盐的转基因作物新品种,使其在盐渍化的土壤中正常生长,这将对我国5亿多亩盐渍地利用做出贡献.参考文献[1]ZhuJK.Plantsalttolerance.TrendsPlantSci,2001,6(2): 66～71[2]ZhangHx,JoannaNHodson,JohnPWilliams,eta1. 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KeywordsTransgenicplantSalttoleranceNa7Hantiporter。
农杆菌介导的拟南芥液泡膜Na～+H～+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)转化烟草和马铃薯的研究
农杆菌介导的拟南芥液泡膜Na～+/H～+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）转化烟草和马铃薯的研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白可使Na~+区隔化进液泡,从而对细胞质内Na~+解毒和细胞渗透调节起作用,是盐生植物和耐盐甜土植物抵御盐胁迫所必需的。
本研究利用拟南芥液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因——AtNHX1首先进行模式植物——烟草的遗传转化,以确定该蛋白的功能,然后进行目标作物——马铃薯的遗传转化,创造马铃薯耐盐种质资源,为耐盐品种的培育奠定基础。
已取得的研究结果如下:1.烟草遗传转化体系的优化:(1)卡那霉素选择压的确定:CV87品种为转化受体材料时,叶片分化和茎段根再生时的卡那霉素浓度应为50mg/L。
T12品种作为转化受体材料时,叶片分化时的卡那霉素筛选浓度应为100mg/L,根形成时的卡那霉素浓度为200mg/L;(2)头孢类抗生素对烟草叶片分化的影响及对根癌农杆菌的抑菌效果:不同浓度的6种头孢类抗生素(头孢曲松钠、头孢噻肟钠、头孢哌酮钠、头孢唑啉钠、头孢拉定和头孢他啶)对烟草叶片分化的影响不大,分化率均在85%以上;200mg/L头孢曲松钠和头孢噻肟钠就能对根癌农杆菌LBA4404起到较好的抑菌效果,并可使继代3次(60d)的烟草转化植株脱菌;(3)遗传转化条件的确定:叶片无需预培养、农杆菌OD600值0.3~0.5、侵染时间8~10min、共培养3d;2.烟草转化植株的获得:(1)对经卡那霉素筛选生根的烟草进行特异引物的PCR扩增,获得了1617bp的特异性片段,表明AtNHX1基因已导入烟草基因组中;(2)转基因烟草植株的耐盐性表现:转基因植株耐盐性明显提高,表现在含1.0%NaCl的MS培养基上可正常生长,在含1.5%NaCl的MS培养基上可发出根系,未转基因植株则不能正常生长;3.(1)马铃薯试管薯的诱导:液体培养法诱导效果最好,平均每株结薯3个。
诱导方法为:将接于MS液体培养基~+3%蔗糖上的试管苗茎段,在25±1℃、2500Lx连续光照下培养,25天后倒出培养基,加入MS液体培养基~+8%蔗糖~+5.00mg/L6-BA ~+0.15%活性碳,2500Lx连续光照下培养2天,再放入25±1℃黑暗下培养8周;(2)马铃薯转化外植体及培养基的确定:试管薯薄片是较茎段转化率明显高的外植体,适宜的分化培养基为MS~+1.00mg/LIAA~+0.20mg/LGA3~+2.00mg/LZT~+0.50mg/L 6-BA;(3)马铃薯遗传转化体系的优化:1)卡那霉素选择压的确定:分化阶段和生根阶段的卡那霉素浓度均为50mg/L;2)遗传转化条件的确定:试管薯薄片无需预培养,农杆菌OD600值0.5,侵染时间8~10min,共培养2d;4.马铃薯转化植株的获得:(1)对经卡那霉素筛选生根的马铃薯转基因植株进行特异引物的PCR扩增,获得了1617bp的特异性片段,表明AtNHX1基因已导入马铃薯基因组中;(2)转基因马铃薯植株的耐盐性表现:转基因马铃薯植株的耐盐性明显提高,表现在含0.6%浓度的NaCl MS培养基上,转基因植株能正常生长,未转基因。
利用DNA家族改组技术创制植物强耐盐Na~+H~+逆向转运蛋白基因
利用DNA家族改组技术创制植物强耐盐Na~+/H~+逆向转运蛋白基因土壤盐渍化是影响植物生长发育和农作物产量的重要非生物胁迫因素。
为了避免Na+对细胞的毒害作用,植物特别是盐生植物抵御盐胁迫的有效策略之一就是通过液泡膜上的Na~+/H~+逆向转运蛋白将细胞质中过多的Na+区域化到液泡中。
同时,Na+又可作为一种有益的渗透调节剂来降低细胞的渗透势,从而使植物能更好的适应盐渍环境。
在不同植物中过量表达液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因均可显著提高转基因植物的耐盐性,说明液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白是一种重要的耐盐决定因子。
然而,目前已克隆的液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白存在转运活性相对较低,耐盐性不高的问题。
因此,对已有比较耐盐的Na~+/H~+逆向转运蛋白基因进行改造,然后将此耐盐基因转入到作物中,进而培育耐盐新品种对于农业生产具有重大实践意义。
DNA家族改组(DNA family Shuffling)技术是一种应用于酶、蛋白质和单克隆抗体等体外定向进化的快速高效的分子生物学方法,该技术在提高酶活性和稳定性以及改变底物特异性等方面具有广泛的应用前景。
本研究以盐生植物碱蓬和盐角草的液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(SsNHX1和SeNHX1)为模板,利用DNA family shuffling技术进行定向进化,并结合酵母突变体表达系统进行筛选,成功获得了一个新的耐盐性显著增强的改组基因,命名为SseNHX1。
序列比较分析发现,SseNHX1较亲本SsNHX1有14个氨基酸的突变,其中有12个突变的氨基酸来自于另一亲本SeNHX1序列。
酵母功能互补试验显示,SseNHX1表达的Na~+/H~+逆向转运蛋白较SsNHX1和SeNHX1基因的表达产物耐NaCl能力分别提高了1.4和1.2倍。
与亲本基因比较,表达SseNHX1的酵母转化子液泡中富集更多的Na+,表明其耐盐性的增强是通过离子转运来实现的。
植物Na^＋-H^＋逆向转运蛋白NHX及其生物学功能
植物Na^＋-H^＋逆向转运蛋白NHX及其生物学功能第24卷第6期2o08年11月科技通报BULLETINOFSCIENCEANDTECHN0LOGYV o1.24No.6NOV.2008植物Na+/H+逆向转运蛋白NHX及其生物学功能刘佳,崔继哲,付畅(哈尔滨师范大学生命科学与技术学院,哈尔滨150025)摘要:植物Na~/H逆向转运蛋白NHX是一类重要的离子转运体,在调节液泡pH 值,维持细胞质中低Na浓度和离子的动态平衡及其发育中起着重要的作用.本文主要对植物NHX蛋白的分类地位.NHX基因的表达调控及NHX蛋白的生物学功能进行了综述.关键词:Na+/H逆向转运蛋白;NHX分类;离子稳态;耐盐性中图分类号:Q74文献标识码:A文章编号:1001—7119(2008)06—0785—07 NHXNa+/H+AntiportersinPlantsandTheirFunctionsLIUJia,CUIJiz胁,刚Chang(CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150025,China) Abstract:NHXNa~/Hantiportersarethemajoralkalicationexchangers,andplaycriticalrole sintheregulationofvacuolarpH,maintenanceofalowcytosolicNaconcentration,cellularionhomeostasisandd evelopmentalprocessesinplants.ThispapersummarizedtheclassofNHX,theregulationofNHXgeneexpressionandth eirfunctions.Keywords:Na+/Hantiporter;NHXphylogeny;ionhomeostasis;salttoleranceNa+/H逆向转运蛋白位于细胞的质膜或液泡膜上,依赖PM—ATPase或V—ATPase和V—PPase产生的跨膜H+梯度,将细胞质内的Na+夕},排或将Na区隔化到液泡中,具有调节细胞内pH值和Na的浓度及维持细胞内离子稳态等多种功能.拟南芥中的SOS1基因和AtNHX1基因是植物中最早克隆的编码质膜和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的基因,随后在多种植物中相继克隆得到它们的同源基因,现在GenBank数据库中已有6O多种植物中编码NHX蛋白的DNA序列登录.关于植物Na+/H逆向转运蛋白研究的进展,国内陆续有多篇综述[1_7]发表,这些文献[,7]较全面地介绍了质膜和液泡膜上这两类Na~/H+逆向转运蛋白的研究现状.但多集中于耐盐性的相关内容上.目前Na+/H逆向转运蛋白已成为国内外植物逆境分子生物学研究领域的热点之一.本文以细胞内膜的Na+/H逆向转运蛋白NHX,重点是液泡膜Na~/H+逆向转运蛋白为对象.力求从收稿日期:2007—09—07基金项目:黑龙江省科技攻关计划项目(GAOrB103—7)资助.作者简介:刘佳(1982一),女,黑龙江哈尔滨人,硕士研究生.}通讯作者:崔继哲(1962一),黑龙江哈尔滨人,教授,博士.E—mail:shiccclC~786科技通报第24卷NHX的系统关系,基因的表达调控,分子特征及生物学功能方面概述有关研究的最新进展.1Na+/H+逆向转运蛋白NHX的分类最近的系统学研究[8,93认为.植物NHX属于Na~/H+逆向转运蛋白NHE/NHX亚家族的成员, 为阳离子逆向转运蛋白(cation:protonantiporter一1,CPA1)家族的一个亚类.植物质膜上的SOS1蛋白则归属于CPA1家族NhaP/SOS1亚家族,其中包括拟南芥的SOS1(曾被重命名为AtNHX7) 和AtNHX8.本文对此不作讨论.基于蛋白质中氨基酸序列的相似性,NH,E/NHX亚家族蛋白根据其亚细胞定位可以分为两大类,一类位于质膜上(plasmamembrane,PM),另一类位于细胞内部(intra.cellular,IC).植物NHX蛋白都属于IC类,可以进一步分为两类,I类蛋白定位于液泡膜上.在IC类群下形成一支独立的进化分支:11类蛋白定位于内膜囊泡上,在动物,真菌内膜上存在相应的同源蛋白.全基因组序列已知的拟南芥和水稻的NHX基因家族大小相当,拟南芥NHX蛋白家族有6个成员(AtNHX1一AtNHX6),水稻有5个(OsNHX1. OsNHX5).AtNHX1.AtNHX4和OsNHX1. OsNHX4为I类蛋白,AtNHX5,AtNHX6和OsNHX5为Ⅱ类蛋白.玉米的ZmNHX1一ZmNHX6,大麦的HvNHX1和HvNHX2,大豆的GmNHX1,牵牛的InNHX1和InNHX2及番茄的LeNHX1也都是定位于液泡膜的I类蛋白,而番茄的LeNHX2是Ⅱ类蛋白,同类蛋白间相似性较高,表现为I类蛋白54%～87%,Ⅱ类蛋白72%～79%,而两类蛋白间的相似性仅为21%一23%.2Na+/H逆向转运蛋白基因NHX的表达调控Na+/H逆向转运蛋白既有组成型表达也有诱导型表达.盐胁迫冰叶日中花植株后,无论是处理植株还是未处理植株,都可检测到该蛋白的活性,不过处理植株的蛋白活性较高.为未处理植株的2.1倍.甜菜,番杏,盐角草,拟南芥等也都为组成型表达.大麦,向日葵等的NHX1则属于诱导型表达[.Ⅳj的表达具有组织特异性.AM1在除根尖外的所有组织中表达[101;RNA原位杂交显示["],AtNHX1在果荚,茎,叶和花,特别是花瓣的表皮细胞中表达较多,韧皮部周围细胞也显示出较强的杂交信号:长角果中外珠被,胚.茎的皮, 层组织都显示出杂交信号:在叶中维管组织的杂交信号强于表皮和薄壁组织;雄蕊,花药杂交信号都非常强,而子房没有检测到杂交信号.RT—PCR与原位杂交[121发现,AtNHX2在花,根中表达丰度相当,但叶中较少,而在茎中几乎检测不到;AtNHX3表达量低,转录物几乎全部位于花和根中.特异性表达于萼片,花托薄壁组织和花药中:仅在根中检测到AtNHX4表达.在苗期E]33, AtNHX1和AtM2mRNA高丰度存在于拟南芥的叶和根中,在叶和根中也有低丰度的AtNHX5mRNA;AtNHX3主要在根中表达;而￡ⅣJ4,AtNHX6仅通过RT—PCR检测到.在转基因拟南芥中.￡ⅣJ啊1启动子活性受NaC1,KC1或ABA的上调,表明盐,ABA对AtNHX1表达调控发生在转录水平上.NaC1对A￡Ⅳj1转录水平的上调作用在1—1,一l和一l突变体中有所下降,而在SOS1,sos2,sos3突变体中与野生型相似,ABA诱导的AtNHX1表达在n6il一1中也下降.表明NaC1诱导AtNHX1转录水平的上调是由ABA介导.部分依赖于ABA信号转导途径中的ABI1分支途径.Y okoi等B]的研究显示,AtNHX在苗期都活跃转录;经NaC1或山梨醇处理后.AtNHX1和AtNHX2转录水平提高;在ABA处理下,AtNHXl和AtNHX2转录产物累积更多,表明这两个基因的渗透调节作用依赖于ABA,可能这两个基因是对高渗透压做出应答而并非对Na毒害的应答.M5的转录受NaC1而不受山梨醇或ABA的诱导,表明AtNHX5是对离子胁迫做出应答的.AtNHX1,AtNHX2,AtNHX5在拟南芥SOS突变中转录水平均有不同程度的上调.表明SOS途径对AtNHX的转录有负调控的作用.在拟南芥一1突变体中,NaC1处理没有使AtNHX1和AtNHX2的转录水平发生上调.在加入外源的ABA后两个基因的转录水平得以恢复,表明盐诱导AtNHX1和AtNHX2的转录依赖于ABA.分析AtNHX1和AtNHX2启动子序列[13].发第6期刘佳等.植物Na+/H逆向转运蛋白NHX及其生物学功能787 现含有与MYC/MYB转录因子互作的AACNG/CACGTG保守序列,因此推测,AtNHX1和AtNHX2对盐胁迫的反应是由一些转录因子如RD22等激活的ABA依赖途径调控.而AtNHX5对盐胁迫的应答不依赖于ABA途径.3Na+/H逆向转运蛋白NHX及其生物学功能B3.1Na+/H逆向转运蛋白NHX分子特征Na+/H逆向转运蛋白是一类跨膜蛋白,分子量具有一定的差异,从20kD到170kD不等. AtNHX1为47kD[H].而甜菜的BvNHX1[153为170kD.亲水性图谱分析推测AtNHX1具有12个亲水区,而不同的拓扑分析软件显示AtNHX1是一个具有9—12个跨膜结构域的蛋白.Y amaguchi等I16]对AtNHX1进行了拓扑学分析. AtNHX1的整体结构与哺乳动物NHE1相似.但又有不同:它包括9个跨膜结构域(transmembrane domainsTM)和1个亲水的C一端,还有3个疏水域没有横跨液泡膜.而是结合在膜上;AtNHX1的N一端位于胞质,C一端位于液泡腔内,TM3含有氨氯吡嗪咪结合位点(FFIYLLPPI);AtNHX1的TM1,TM2,TM10和TM12与相对应的NHE1的TM2,TM3,TM11,TM13在方向上相一致;而与NHE1的TM5,TM8,TM9相对应的TM4,TM7,TM8是以反方向插入到液泡膜中的.值得注意的是,TM3,TM5,TM6没有穿过液泡膜,这意味着这3个结构域的方向可能决定着离子运动的方向(如图1,A).Sato和SakaguchiI"]对AtNHX1特性的分析得到了不同的结果:虽然A.tNHX1没有信号肽,但是AtNHX1与hNHE1有相同的拓扑结构. hNHE1和AtNHX1在N一端存在着差异,AtNHX1 没有与hNHE1的TM1相对应的疏水片段.但其它的片段都很相似:序列比对也显示除了TM1 外,AtNHX1都存在与hNHE1相应的片段.利用报告域(reporterdomain)RL与疏水片段融合,并在非细胞体系中表达显示,当RL与TM1融合时,融合蛋白具有不定的拓扑结构,据此认为TM1片段不可能起I型信号锚定作用.当RL与TM1一TM2融合时,TM1一TM2以唯一的拓扑结构整合到膜上,尽管没有信号肽,但两端都位于内A_'¨{_1234567S9101112AlNHX1图1AtNHX1的两种拓扑结构模型Fig.1ProposedtopologicalmodelsofAtNHX1A:Y amaguchi等提出的AtNHX1拓扑结构[16]:N一端位于胞质,C一端位于液泡腔内;有9个跨膜片段,TM3,TM5, TM6没有穿过液泡膜.B:Sato和Sakaguchi提出的AtNHX1拓扑结构_l7]:N一端位于液泡内腔,C一端位于细胞质,有l1个跨膜片段.质网内腔.这一拓扑结构与hNHE1的TM2一TM3是一致的.将RL分别同与hNHE1的TM9,一H10,一TM1O同源的TM8,一TM9,一TM10相融合显示.TM8可以整合到内质网上并形成Ncyt/C~um的拓扑结构.并且存在着二糖基化形式;TM9拓扑结构的形成起始于TM8,并依赖于TM10终止:TM9的两端都位于内质网腔内,形成类似于膜环的结构:TM10为跨膜结构.这些定位特性都说明AtNHX1与hNHE1具有相同的拓扑模型,并提示Na+/H+逆向转运蛋白家族可能具有普遍一致的拓扑结构(如图1,B).整体来讲.这两种拓扑模型都与人hNHE1的结构相似,但又各有不同.前一模型认为TM1N一端位于细胞质侧,并且为Nl岫/Ccyt的拓扑结构.这一模型的建立是基于对氨基酸序列进行分析后,将一系列带有3xHA标签的AtHNX1转化酵母,利用蛋白酶保护试验,分析其产物的分子量大小而建立的.而后一个模型是通过在酵母中表达重建AtNHX1分子,经蛋白酶处理液泡后,分析产物电泳迁移率的改变而建立的.后一试验结果似乎更可靠.但酵母内源蛋白酶的作用使蛋白降解或高疏水多肽的迁移率都会使分析结果受影响.788科技通报第24卷3.2Na+/H+逆向转运蛋白NHX的生物学功能3.2.1维持离子的动态平衡经盐处理后大麦根部液泡膜囊泡仅检测到Na~/H逆向转运蛋白活性,而无其它单价阳离子如K+,Li+,Cs+,Rb+等的逆向转运活性.过表达AtNHX1的拟南芥液泡Na+/H交换活性远高于对照,而KVH+的交换活性不受影响[141;但随后的研究发现,过量表达AtNHX1的番茄在液泡囊泡中AtNHX1还介导K的转运N8]:AtNHX1具有Na+/H和K+/H的转运活性在重组的脂质体中也得到了证实:在存在pH梯度的条件下, AtNHXl以相同的亲和性催化Na+,K的逆向转运,还可以以低亲和性催化Li,Cs的转运,但是不能催化有机阴离子的转运.水稻ⅣJ71转化酵母nhxl突变体可以功能性恢复NaC1,KC1耐性.日本牵牛InNHX1和InNHX2E都同时具有Na+,I(+的转运活性,在棉花,向13葵根部也检测到了相同的Na+,K逆向转运活性.Y amaguchiE等将全长AtNHX1,C一端或N一缺失的AtNHX1转化到酵母表达.检测其交换活性的变化,发现,N一端缺失AtNHX1交换活性没有太大的改变.而C一端缺失导致Na+/H+交换活性升高,K+/H交换活性降低,使NaVH转运比率升高两倍.说明AtNHX1的C一端具有阳离子选择性.Y amaguchiE丝等利用酵母双杂交和免疫沉淀技术鉴定出一种钙调素类蛋白(AtCaM15),它与AtNHX1的C～端特异性互作.通过一系列的删除试验发现.AtNHX1的Arg一496至Gly一518一段氨基酸序列可以形成亲水的仪一螺旋,为CaM靶位点的普遍结构.显示此段区域为AtNHX1C一端与AtCaM15结合的位点.AtNHX1与AtCaM15 的结合依赖于Ca和pH,随着pH的升高,这种结合会受到抑制.同时,AtNHX1与AtCaM15的结合改变了AtNHX1对NaVK的选择性,降低了NaVH的转运活性.在拟南芥中过量表达AtNHX1显示出Na+/H交换活性升高rI4J.并且这种交换活性的升幅大于AtNHX1蛋白丰度的增加.据此,Apse等]认为在正常生长条件下.AtNHX1的活性受到抑制,过量表达AtNHX1可以克服内源的抑制机制.因此推测[,在野生型植株中AtCaM15与AtNHX1结合抑制了AtNHX1的Na+/H交换活性,而转基因植株中AtNHX1蛋白量增加,就会提高NaVH+的交换活性.同时,盐胁迫条件下,液泡内pH升高,由此导致AtCaM15与AtNHX1的C一端解离.使内源AtNHX1激活.从而进一步增强NaVH交换活性,使Na在液泡中得到累积.对Ⅱ类定位于内膜囊泡上的NHX蛋白转运活性的研究主要集中在番茄LeNHX2[.它的氨基酸序列与AtNHX5同源性很高.LeNHX2定位于前液泡和高尔基体上,可以抑制酵母nhxl突变体盐敏感和潮霉素敏感表型,它影响细胞间隔区K十的累积.AtNHX5与LeNHX2一样也对K有较高的亲和性[n].综上所述,不同定位的NHX蛋白有不同的离子转运活性,并执行不同的生理功能.在正常生长条件下.I类NHX蛋白介导Na+,在液泡中的累积,以进行渗透调节并产生细胞体积增大必需的膨压.而在盐胁迫条件下,则通过对NHX蛋白C端的调节,优先将Na区域化至液泡中,以减轻Na+的毒害.Ⅱ类NHX蛋白具有较专一的离子选择性,可能是由于内膜系统依赖于K+/H的交换来调节pH以避免Na在内膜系统中的累积而造成毒害.3.2.2调节细胞内pH细胞中执行各种功能,参与各种代谢途径的酶都需要有适当的pH环境.生物或非生物胁迫都会导致细胞内pH的改变.以开启不同的适应性代谢途径.NHX蛋白调节细胞内pH最典型的例子就是日本牵牛花色的转变[21].由花芽时期的红紫色转变成开花时的蓝色,这种颜色的转变是由于花青素在细胞液泡中累积,并在不同pH下呈现不同颜色所造成的.伴随着花色由红色变为蓝色,花瓣细胞液泡内pH由6.6转变为7.7.在花色转变,液泡pH升高的同时,InNHX1表达量及其活性提高.液泡内pH升高是InNHX2与InNHX1共同作用的结果,InNHX1插入突变会阻碍花色变化.3-3.3对其它基因表达的影响Sottosanto等利用DNA微列阵技术比较了AtNHX1野生型和nhxl突变型植株在无盐胁迫下基因表达水平的差异.发现两种材料基因表达水平几乎无重叠现象,说明AtNHX]作为植物盐胁迫应答机制中的一个成员在正常生长条件下还有着不同的功能.此外他们还对比了nhxl第6期刘佳等.植物Na~/H逆向转运蛋白NHX及其生物学功能789 突变株在有盐和无盐胁迫下基因表达水平的改变,发现AtNHX1可能还参与多种细胞途径.包括细胞结构的构建,蛋白质的运输和定位,能量的平衡等,这些作用可能是通过调节液泡内pH实现的.随后,Sottosanto等又分析了拟南芥野生型AtNHX1,插入突变体nhxl和功能恢复型NHX1::nhxl三种植株在短时间(12h和48h)和长时间(1周和2周)盐胁迫条件下基因转录差异.有147个盐应答基因转录受AtNHX1影响,在nhxl突变体中除了一些编码与代谢有关的基因表达下调,大部分(69%)基因表现为转录上调,还有一个基因表现为盐胁迫一周转录上调,两周后转录下调.在受AtNHX1影响的147个基因中,有13个基因编码盐应答的信号元件, 其中包括5个钙调素(CaM)结合蛋白;有2O个基因编码DNA结合元件,其中大部分为转录因子;有25个是与代谢和能量转换有关的基因,与大部分基因的表达水平不同,这些基因都是以低丰度表达.说明盐胁迫条件下,突变体植株代谢变得缓慢;有13个基因参与细胞壁的合成和细胞生长,他们大多数在盐胁迫2d或更长时间后才表现为转录上调:此外还有l4个基因编码参与蛋白质加工和运输的蛋白.由于I类NHX蛋白不仅具有Na的转运活性.还具有I(+的转运活性,因此它对于植物的生长发育也有重要的作用.在植物细胞液泡内累积高浓度的,可以维持细胞内浓度在最适水平.Hanana等[衢]分离并鉴定出葡萄(Vitisvinifera L)VvNHX1基因.在葡萄成熟和后熟阶段,VvN—HX1高水平表达.并显示出液泡内的累积量增大,这对于液泡体积的增大是必需的.在这一过程中果实变大.还原糖的累积和水分的吸收促进了果实的后熟.4Na~/H+逆向转运蛋白NHX与植物耐盐性大量研究证明过表达NHX逆向转运蛋白可以提高植物的耐盐性.AtNHX1在番茄[墙]和油菜中过表达,均获得了耐盐性较高的转基因植株, 在200mMNaC1胁迫下,仍能正常生长,正常结实.过表达GmNHX1的百脉根在盐胁迫条件下, 再生能力,光合作用能力及存活时间都明显好于对照,耐盐性提高矧.Xue等在小麦中过量表达AtNHX1,发现转基因植株可以在盐土中生长,并且产量提高,谷粒增重.HeE加]将AtNHX1转化棉花,在温室中,200mMNaC1胁迫下转基因植株产量提高,棉纤维量增多,并且光合作用增强,氮的同化速率增高.此外,田间种植的转基因植株也可以产生高质量的棉纤维.Chengc.]利用根癌农杆菌介导法将AtNHX1转化荞麦,获得的转基因植株可以在200mM/LNaC1条件下正常生长.在不同盐浓度处理条件下,转基因植物积累了大量的Na和脯氨酸.而K浓度相对于对照植物有所下降.表明AtNHX1可以提高荞麦的耐盐性.ZhaoE将盐地碱蓬的SsNHX1转化水稻.转基因植株不仅耐盐性有明显的提高,而且K,Ca2+,Mg等离子浓度要高于非转基因植株,此外根V—ATPase活性明显升高.光合作用增强.可溶性糖含量也明显增多.单一的NaVH+逆向转运蛋白活性的上调会产生一系列的与植物耐盐性相关的生理生化变化.从而提高植物的耐盐性,说明植物的耐盐调节是一个复杂的网络.NaVH逆向转运蛋白作为其中重要的一类成员,具有广泛的研究价值.对不同物种以及同一物种的不同Na+/H逆向转运蛋白的耐盐性进行分析.将为我们选择更加优良的耐盐基因奠定基础,从而有效地改良作物的耐盐性参考文献:[1]邱念伟,杨洪兵,王宝山.NaVH逆向转运蛋白及其与植物耐盐性的关系[J].植物生理学通讯,2001,37(3): 260-264.[2]任仲海,马秀灵,赵彦修,等.Na~/H逆向转运蛋白和植物耐盐性[J].生物工程学报,2002,18(1):16一l9.[3]吕慧颖,李银心,孔凡江,等.植物Na+/H逆向转运蛋白研究进展[J].植物学通报,2003,20(3):363—369.【4]张俊莲,张金文,陈正华,等.植物Na+/H逆向转运蛋白与植物耐盐性的研究进展[J].草原与草坪,2005,4:3-9.[5]彭立新,王明启.渗透胁迫调节基因一Na+/HAntiporter 基因与植物耐盐性[J].天津农学院学报,2005,1(2): 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棉花液泡型Na+H+逆向转运体基因在酵母突变体中的表达分析
棉花液泡型Na+/H+逆向转运体基因在酵母突变体中的表达分析1999级生物技术专业 亓 芳指 导 教 师： 郑成超 教 授摘要：本研究利用PCR技术用带有Bam HⅠ和Hin dⅢ酶切位点的两条特异引物扩增棉花液泡型Na+/H+逆向转运体基因（GhNHX1：Gene bank，AF215632）的全长，克隆到pMD18-T载体中，构建了酵母表达载体pYES2-GhNHX1。
随后转化到酵母GhNHX1突变体R100中，在SD选择培养基上筛选阳性克隆。
然后将野生型和转化型酵母进行耐盐性分析，发现转GhNHX1基因酵母突变体的耐盐能力明显提高，从而快速鉴定GhNHX1基因在耐盐性中的功能，为以后转基因植株的获得奠定了基础。
关键词：棉花，GhNHX1，酵母，耐盐性The Expression Analysis of GhNHX1 from Cotton Vacuolar Na+/H+Antiporter in Yeast CellBiotechnology, 1999 Fang QiDirector: Pro. Chengchao Zheng Abstract: Based on the data of a vacuolar Na+/H+ antiporter of cotton from gene bank AF215632, a pair of primers was designed, and we obtain the full length of GhNHX1 by using PCR technology which contain two restriction sites of Bam HⅠ and Hin dⅢat the 5′and 3′ terminals, respectively. And conformed a yeast expression vector pYES2-GhNHX1. The expression of the GhNHX1 gene in yeast mutant, which lacks the vacuolar-type Na+/H+ antiporter gene (GhNHX1) and has poor viability under the high-salt conditions showed partial complementation of the NHX1 functions. Results show that GhNHX1 could effectively increase the salt tolerance of the yeast mutant.Key words: GhNHX1, salt tolerance, cotton, yeast mutant, genetic engineering一、引言土壤盐渍化已成为一个全球性的问题，全世界有约57亿亩土地存在着不同程度的盐渍化，约占可耕地面积的10%（张新春，2002）。
钠氢逆向转运蛋白和糖转运蛋白
钠氢逆向转运蛋白和糖转运蛋白全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：钠氢逆向转运蛋白（NHE），是一种能够帮助细胞调节酸碱平衡的蛋白质。
它主要在细胞膜上起到帮助细胞内部的钠离子和氢离子相互转运的作用。
而糖转运蛋白则是一类能够帮助细胞将糖分子从体外传输到细胞内的蛋白质。
这两种蛋白在细胞功能中起到了至关重要的作用。
让我们来了解一下钠氢逆向转运蛋白的作用机制。
在细胞内部，有一种叫做Na+/H+交换器的蛋白，它能够帮助细胞调节细胞内外的钠离子和氢离子的浓度。
这种蛋白在细胞内膜上起到了关键的作用，帮助细胞稳定内部环境的酸碱平衡。
当细胞内部PH值太高时，Na+/H+交换器会将细胞外的氢离子转运到细胞内部，从而降低细胞内部的PH值。
这种反向转运的机制，使得细胞能够更好地适应不同环境下的酸碱度变化。
钠氢逆向转运蛋白和糖转运蛋白在细胞生物学中的作用是密不可分的。
它们共同作用，维持着细胞内部环境的稳定和功能的正常运转。
在不同的细胞活动过程中，这两类蛋白都发挥着不可或缺的作用。
在细胞内部的运输和调节过程中，钠氢逆向转运蛋白帮助维持细胞内外的钠离子平衡，保持细胞内部环境的稳定性；而糖转运蛋白则帮助细胞获取必要的糖分子，从而满足细胞能量需求，促进细胞代谢的进行。
钠氢逆向转运蛋白和糖转运蛋白是细胞内部不可或缺的蛋白质，它们共同作用，维持着细胞内部环境的稳定性和细胞功能的正常运转。
它们在细胞代谢、细胞生长和分化、细胞信号传导等方面都发挥着重要作用。
研究钠氢逆向转运蛋白和糖转运蛋白对于我们更深入地了解细胞功能和生命活动过程具有重要意义，也为未来新药研发提供了重要的参考和依据。
希望未来能够有更多的研究关注这两类蛋白，在细胞活动中的作用机制和调控方式，为人类健康和疾病治疗带来新的突破和进展。
【文章结束】.第二篇示例：钠氢逆向转运蛋白和糖转运蛋白是细胞膜上的两种重要蛋白质，它们在维持细胞内外环境稳定性以及物质运输过程中起着至关重要的作用。
利用拟南芥液泡膜Na～+-H～+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)改良马铃薯耐盐性的研究
利用拟南芥液泡膜Na～+-H～+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）改宝马铃薯耐盐性的探究引言：盐胁迫是导致植物生长和产量下降的主要因素之一。
马铃薯（Solanum tuberosum）作为世界上重要的经济作物之一，其耐盐性的提高对于增加作物产量具有重要意义。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学探究的模式植物，其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因（AtNHX1）在盐胁迫条件下发挥着重要的调整作用。
因此，本探究旨在探究利用AtNHX1基因改宝马铃薯耐盐性的可行性。
方法：本探究选取耐盐性差的马铃薯品种，通过基因工程技术将AtNHX1基因导入马铃薯中。
起首，利用PCR扩增得到AtNHX1基因的编码序列；然后，构建植物表达载体，将AtNHX1基因插入载体的多克隆位点；最后，通过农杆菌介导法将植物表达载体导入马铃薯愈伤组织，获得转基因马铃薯。
结果：经过PCR扩增和测序验证，成功得到了AtNHX1基因的编码序列。
构建的植物表达载体成功插入了AtNHX1基因，并通过酶切鉴定确认。
通过农杆菌介导法将转基因载体导入马铃薯愈伤组织，经过再生和筛选，最终获得了多株转基因马铃薯。
利用RT-PCR检测表明，转基因马铃薯中成功表达了AtNHX1基因。
谈论：AtNHX1基因在盐胁迫条件下调控植物细胞内Na+/H+离子平衡，对于提高植物的耐盐性具有重要作用。
由于AtNHX1基因在拟南芥中表现出的显著效果，我们猜想将该基因导入马铃薯中可能会改善其耐盐性。
通过转基因马铃薯的获得，我们成功地确认了AtNHX1基因的表达。
接下来，我们将进一步探究转基因马铃薯在盐胁迫条件下的生长和生理指标的变化。
预期结果：我们估计转基因马铃薯在盐胁迫条件下会表现出更好的生长状况和生理指标。
详尽来说，转基因马铃薯的根系可能会更加发达，叶片的相对含水量可能会更高，叶片中的叶绿素含量可能会更稳定，并且叶片表面上可能会缩减脱落的气孔，从而缩减水分流失。
盐生植物盐爪爪液泡膜钠氢反向运输载体基因(KfNHX1)遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定
新疆农业科学 2621,55(3) ：522 -072Xinjiang Ag/chlturai Sciexcasdo):32.0443/j. Wo. 141 -4332. 0261.23: 424盐生 膜 体基因（KPHX 2 ）遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定,5 ，曾（新疆大学生命科学与技术学；/新疆生物资源基因工（1!实验#，鸟鲁木齐734640）摘 要：【目的】研究盐爪爪液泡膜N 示/H +反向运输载体KPHX 1 （AY725254-基因的耐盐功能，为耐盐育种提供候选基因。
【方法】泾用农杆菌介导花序浸染的方法，将KHX1转入拟南芥中，结合基因组PCR 和 RT- PCR 方法鉴定符合3： 1分离比的转基因株系；利用在盐胁迫下的萌发率、根长和表型分析，结合原子吸收分光光度计法测定叶片的N 示、K +含量，推断其耐盐性。
【结果】对抗生素筛选符合3：1的转基因纯合株系 进行基因组PCR 和RT- PCR 分析，证实KNHX 1基因在拟南芥基因组中整合和表达。
盐胁迫下转基因株系的拟南芥种子的萌发率和根长明显高于野生型。
202 mM NaCi 胁迫处理15 d 的拟南芥成苗，相较野生型叶片萎黄和死亡,转基因植株的生长表型较好，且积累了较高的Na +和K +。
外源ABA 的处理下，转基因植株的发芽率和生长表型也好于野生型o 【结论】盐爪爪（Kdddm foPatum ）是一种藜科（Che 重/（菌示中写盐生灌木，对盐的耐受性很强。
液泡膜N a + /H +反向运输体（NHX ）是在离子稳态中起重要作用的膜蛋白，通过调节胞间 离子的跨膜转运来维持细胞内离子和pH 平衡。
盐生植物盐爪爪KfJHX1能够提高转基因拟南芥的耐盐性，具有提高植物耐盐性的潜力。
关键词 盐生植物;盐爪爪;KNHX 1 ；耐盐性；拟南芥;遗传转化中图分类号：S137 文献标识码:A 文章编号：141 -4334（2421）43 -4565 -084引言【研究意义】盐胁迫是影响作物产量的主要一。
《白刺液泡膜Na~+-H~+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析》范文
《白刺液泡膜Na~+-H~+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析》篇一白刺液泡膜Na~+-H~+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析一、引言在生物学领域，Na~+/H~+逆向转运蛋白是一类重要的细胞膜蛋白，其作用是维持细胞内外的离子平衡。
白刺作为一种特殊的生物种类，其液泡膜上的Na~+/H~+逆向转运蛋白具有独特的生物学功能。
为了深入研究这一特殊转运蛋白的基因结构和功能特性，本文对白刺液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因进行了克隆，并对其特性进行了详细分析。
二、实验材料与方法1. 实验材料本实验所需材料包括：白刺组织样本、PCR引物、DNA测序仪、酶切工具等。
2. 实验方法（1）基因克隆：从白刺组织中提取RNA，逆转录为cDNA，然后利用PCR技术扩增Na~+/H~+逆向转运蛋白基因片段。
（2）序列分析：对PCR产物进行纯化、酶切和连接，然后转化至感受态细胞中进行扩增，最后通过DNA测序仪对克隆的基因序列进行测定。
（3）特性分析：对克隆得到的基因序列进行生物信息学分析，包括序列比对、蛋白质结构预测、基因表达分析等。
三、实验结果1. 基因克隆结果通过PCR技术成功扩增出白刺液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因片段，经纯化、酶切和连接后，成功克隆到感受态细胞中，得到了稳定的重组质粒。
2. 序列分析结果对克隆得到的基因序列进行DNA测序，结果显示序列正确，无突变或缺失。
通过与已知的Na~+/H~+逆向转运蛋白基因序列进行比对，发现白刺液泡膜上的该基因具有较高的保守性。
3. 特性分析结果（1）序列比对：通过生物信息学软件对白刺液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因序列进行比对，发现其与已知的其他物种的同类基因具有较高的相似性。
（2）蛋白质结构预测：通过对基因编码的蛋白质序列进行结构预测，发现该蛋白具有典型的Na~+/H~+逆向转运蛋白结构特征。
（3）基因表达分析：通过实时荧光定量PCR技术对白刺液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的表达水平进行分析，发现其在不同组织中的表达量存在差异。
《白刺液泡膜Na~+-H~+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析》范文
《白刺液泡膜Na~+-H~+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析》篇一白刺液泡膜Na~+-H~+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析一、引言白刺液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白（Nha1）是生物体细胞内的一种重要膜转运蛋白，具有跨膜物质运输的重要功能。
它负责维持细胞内环境的稳定，并在生物体的代谢过程中发挥重要作用。
因此，对Nha1基因的克隆和特性分析，对于理解其在生物体中的功能及其调控机制具有重要意义。
本文旨在通过克隆Nha1基因并对其特性进行分析，为进一步研究其生物学功能提供基础数据。
二、方法2.1 实验材料本实验所使用的实验材料为含有白刺液泡的组织样本，以及其他必要的实验器材和试剂。
2.2 Nha1基因的克隆（1）首先通过PCR技术扩增出Nha1基因片段；（2）利用克隆载体构建Nha1基因的重组质粒；（3）将重组质粒转化入感受态细胞，通过蓝白斑筛选得到阳性克隆；（4）对阳性克隆进行测序验证，确保克隆的Nha1基因序列正确。
2.3 Nha1基因的特性分析（1）通过生物信息学软件对Nha1基因的序列进行分析，包括开放阅读框、编码的氨基酸序列等；（2）利用相关软件预测Nha1蛋白的二级结构和三级结构；（3）通过实时荧光定量PCR技术分析Nha1基因在组织中的表达情况；（4）利用Western blot技术检测Nha1蛋白在细胞中的表达情况。
三、结果3.1 Nha1基因的克隆结果通过PCR扩增、克隆载体构建、感受态细胞转化及蓝白斑筛选等步骤，成功克隆出Nha1基因，并进行了测序验证，确保了基因序列的正确性。
3.2 Nha1基因的特性分析结果（1）通过生物信息学软件分析，确定了Nha1基因的开放阅读框及编码的氨基酸序列；（2）预测了Nha1蛋白的二级结构和三级结构，为进一步研究其功能提供了基础；（3）通过实时荧光定量PCR技术分析，发现Nha1基因在多种组织中均有表达，且在不同组织中的表达量存在差异；（4）通过Western blot技术检测，发现Nha1蛋白在细胞中有所表达。
Na+H+ 转运蛋白NHX1基因及其耐盐机制的研究进展
液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白及其耐盐机制的研究进展摘要：液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白通过液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPiase建立的跨膜质子梯度为驱动力，将Na+运入液泡区隔化，从而使细胞质中的Na+保持在较低水平，也降低了细胞渗透势避免了水分胁迫。
分析Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的亲水性图谱包括N末端的跨膜区域和C末端的胞质区域，前者对氨氯吡嗪脒（amiloride）及其衍生物敏感，是负责转运的区域，由9-12个跨膜结构域组成，这段序列在其他植物 NHX以及哺乳动物NHE中均高度保守。
后者大约由300个氨基酸组成，结构域内含有多个蛋白激酶用位点，能够与钙调素（calmodulin）结合，参与多种信号反应，是调节活性的区域。
将NHX1基因导入其它植物诱导表达能显著提高植物耐盐性，也能互补酵母NHX1突变的表型，而AtNHX1基因在离子动态平衡方面，细胞内囊泡运输，蛋白质定位以及其它细胞过程中也发挥作用。
关键词：液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白耐盐性调控机理在干旱、半干旱地区，土壤表面盐分积累造成土壤盐碱化，严重影响农作物产量。
如何改善土壤理化因素，增加农作物产量，以及改善干旱、半干旱地区生态环境，就成为盐生植物研究的出发点。
耐盐植物抵御盐害的途径主要有三种：一是植物细胞对离子的选择性吸收限制Na+的进入；二是将胞质中的Na+排出；三是胞内的Na+储存在液泡中即Na+的区隔化【1】。
Na+的外排和区隔化是目前研究的热点，通过膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白实现，其中存在于液泡膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白就是将Na+储存在液泡内。
利用液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPiase建立的跨膜质子梯度为驱动力【2】,将Na+运入液泡区隔化，从而使细胞质中的Na+保持在较低水平，也降低了细胞渗透势避免了水分胁迫。
随着分子生物学的研究深入，已经从模式生物拟南芥、水稻以及盐生植物盐地碱蓬、刺槐、经济作物小麦、玉米等中克隆出表达该蛋白的基因。
拟南芥液泡膜Na+H+逆向转运蛋白的研究进展
拟南芥液泡膜Na+H+逆向转运蛋白的研究进展
拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的研究进展
拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白是由AtNHX1基因编码的一个在盐胁迫中起重要作用的蛋白.本文综述了AtNHX1的基本结构、功能及作用机制,展望其作为有效植物耐盐基因的前景,并对拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因家族其他成员的研究,也做了相应的概括.
作者：安静张荃 AN Jing AHANG Quan 作者单位：山东师范大学生命科学学院逆境植物重点实验室,济南,250014 刊名：生命科学ISTIC PKU 英文刊名：CHINESE BULLETIN OF LIFE SCIENCES 年，卷(期)：2006 18(3) 分类号：Q5 关键词：Na+/H+逆向转运蛋白液泡离子区隔化植物耐盐性。
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摘 要 ： 液 泡膜 Ｎａ ／ Ｈ 逆 向转运 蛋 白是植 物体 内广 泛存 在 的一种跨膜 转运 蛋 白， 负责 植物 体 内 Ｎａ 、 Ｈ 的交 换 。本 文 对 Ｎａ ／ Ｈ 逆 向转运 蛋 白的克 隆、 分 子结 构 、 功 能及 应 用 等 方 面 展 开论 述， 旨在为研 究者 系统 的理解 Ｎａ ／ Ｈ 逆 向转运 蛋 白的研 究进展 ， 为调 控该 蛋 白的表 达 来 改进植
Ｎａ ＋／ Ｈ＋ ａ ｎ ｔ ｉ ｐ ｏ ｒ ｔ ｅ ｒ ，ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ｅ ｄ ｔ ｏ ｅ ｎ ａ ｂ ｌ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｅ ｒ ｓ ｔ ｏ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍａ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｐ ｒ ｏ —
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当前 农 业 生 产 所 面 临 的 逆 境 胁 迫 包 括 生 物 胁 迫 和 非 生 物 胁 迫 ， 其 中非 生 物 胁 迫 中最 重 要
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第３ ３卷 第 ３期
２ ０ １ ６ 年 ９月
河 北 省 科 学 院 学 报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｈｅ ｂ ｅ ｉ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ
Ｖｏ１ ． ３ ３ ＮＯ ． ３
Ｓｅ ｐ． ２ Ｏ１ ６
物 的生长发 育及 抗 盐胁迫 能力等 方 面的应 用提 供参 考 。 关键 词 ： 植物； 液 泡膜 ； Ｎａ ／ Ｈ 逆 向转运 蛋 白； 耐 盐性
中图分 类号 ： Ｑ９ ４ ３ 文 献标识 码 ： Ａ
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ａ ｎ ｄ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｖ ａ ｃ ｕ ｏ ｌ ａ ｒ Ｎａ ＋ ／ ｎ＋ａ ｎ ｔ ｉ ｐ ｏ ｒ ｔ ｅ ｒ
文章编号 ： １ ０ ０ １ —９ ３ ８ ３ （ ２ ０ １ ６ ） ０ ３ —０ ０ ３ ９ —０ １ ０
植 物 液 泡膜 Ｎ ａ ＋ ／ Ｈ ＋ 逆 向转 运 蛋 白的研 究 与应 用
任 秀艳 。 ， 王 宝增 ， 王 聪 艳 ， 侯 志敏
（ １ ． 廊坊 师范学院 生命科学学 院， 河北 廊坊 ０ ６ ５ ０ ０ ０ ；２ ． 河 北省 高 校 食 药 用 菌 应 用 技 术 研 发 中心 ， 河北 廊 坊 ０ ６ ５ ０ ０ ０ ）