实时定量 PCR
realtimepcr的名词解释
realtimepcr的名词解释Real-time PCR的名词解释Real-time PCR，即实时定量聚合酶链反应，是一种在生物分子研究领域被广泛应用的技术。
它能够在短时间内检测和定量分析DNA或RNA的含量，因此在基因表达研究、微生物检测、病原体诊断等领域具有重要的意义。
首先，我们来了解PCR的基本原理。
聚合酶链反应（PCR）是一种能够在体外扩增DNA分子的技术。
它利用DNA聚合酶酶活性，在一系列变温反应过程中，通过酶催化，把待测DNA片段的特定区域进行放大，从而获得足够数量的目标DNA。
这种技术的应用使得我们能够快速、准确地研究和分析DNA的相关信息。
与传统PCR不同，Real-time PCR在PCR过程中实时监测反应体系中的荧光信号，以实现对DNA量的定量和计量。
这主要通过添加合成的DNA探针或荧光标记的引物，以及具有对应荧光信号的探针来实现。
在PCR反应进行过程中，荧光信号将与DNA量成正比。
PCR结束后，计算机软件会分析和显示实时荧光信号的扩增曲线，从而确定样品中目标DNA的起始量。
Real-time PCR的优势在于其高灵敏度、高选择性和高分辨率。
相对于传统PCR，Real-time PCR不需要后续的电泳分析，节省了实验时间，减少了实验操作和处理的复杂性。
此外，由于实时监测PCR反应过程中的信号变化，Real-time PCR能够提供更精确的计量和定量结果。
Real-time PCR有多种应用，其中包括基因表达研究。
通过实时监测特定基因的表达水平，我们可以了解基因在不同条件下的转录变化情况，从而理解其在生物过程中的功能和调控机制。
此外，Real-time PCR还可以用于微生物检测。
通过设计特异性的引物，可以快速、精确地检测病原微生物的存在与否，为临床诊断和疾病防控提供帮助。
除了这些应用外，Real-time PCR还在病原体诊断和检测方面发挥着重要作用。
传统的病原体检测方法往往需要培养和鉴定，周期较长，诊断结果需要等待数天甚至更长时间。
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
实时定量pcr原理
实时定量pcr原理实时定量PCR原理。
实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够在PCR过程中实时监测靶标的扩增情况，从而实现对靶标的定量分析。
本文将介绍实时定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。
实时定量PCR的原理。
实时定量PCR是在传统PCR技术的基础上发展而来的，其核心原理是通过不断测量PCR反应体系中的荧光信号强度来实时监测靶标的扩增情况。
在实时定量PCR中，通常使用荧光探针（如TaqMan探针、SYBR Green等）来标记靶标的扩增产物。
当PCR反应进行时，靶标的扩增产物会不断积累，荧光信号强度也会随之增加。
通过测量荧光信号强度的变化，可以确定靶标的起始量，并进行定量分析。
在实时定量PCR中，荧光信号强度的测量通常是通过实时荧光定量PCR仪来实现的。
这些仪器能够在PCR反应进行的同时，实时监测PCR管中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过分析荧光信号曲线的特征，可以确定靶标的起始量，并计算出靶标在样本中的相对或绝对含量。
实时定量PCR的应用。
实时定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在基础科研领域，实时定量PCR常常用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。
通过实时定量PCR技术，研究人员可以快速、准确地获取靶标在样本中的含量信息，从而揭示基因表达调控、病原微生物的感染情况、基因型的分布规律等重要信息。
在临床诊断领域，实时定量PCR也被广泛应用于疾病诊断、药物疗效监测、遗传病筛查等方面。
实时定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，能够快速、准确地检测靶标在临床样本中的含量，为临床诊断和治疗提供重要依据。
总结。
实时定量PCR作为一种高效、准确的分子生物学技术，已经成为科研和临床领域中不可或缺的工具。
通过实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度，实时定量PCR能够实现对靶标的快速、准确的定量分析，为科研和临床诊断提供了强大的技术支持。
实时定量PCR
实时定量PCR概述张璐（武汉轻工大学动物科学与营养工程学院）摘要:实时定量PCR(Real-time Quantitative PolymeraseChainReaction，RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。
该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点，是对原有PCR技术的革新，扩大了PCR的应用范围。
本文综述了RQ-PCR技术的概念、分类、原理、应用及研究进展。
关键词：实时定量PCR、分类、应用1、实时定量PCR的基本概念及原理介绍1. 1实时定量PCR概念实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. 2涉及的几个术语简介1. 2. 1 荧光域值(threshold)的设定。
PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的l0倍。
1. 2. 2 Ct值它是指PCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。
初始量越多其到达指数扩增期的ct值越小。
定量结果虽然不能直接用ct值的大小表示，但可根据不同的公式计算后用于定量结果的表示。
1. 2. 3 扩增效率(E) 当扩增效率最大(E=1)且目的基因与参照物的扩增效率近似相同时实验结果才科学、可信。
因为E值5％的差异就可在26个循环后导致产物2倍的差别[1]，且不同的定量方法对E值要求也不同。
1. 2. 4溶解曲线，即Ct值与起始模板的关系。
研究表明，每个模板的D值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Q值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表D值。
因此。
只要获得未知样品的D值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时定量PCR技术(real-time PCR)
样品重复
重复次数请遵循统计学的要求 小样本统计，n>6（n>3） 未知样品和标准品都要重复 所有复管在同样条件下完成PCR
2.2 技术方法及数据
绝对定量与相对定量
绝对定量：绝对标准曲线法
标准品拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释 倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓 度/样本分子量×6×1014
扩增效率 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为： 扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指 数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产 物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2， 就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32， 斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。 如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%， 表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。
TaqMan探针
TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸 收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可 以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长 （低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振 能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放 的荧光被屏蔽。
PCR效率对定量结果的影响
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR国际化标准(一)
实时荧光定量PCR国际化标准（一）引言概述:实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种基于PCR技术的高灵敏度和高特异性的核酸检测方法。
随着其在基础科学研究、临床诊断和生物工程中的广泛应用，国际化标准的建立变得尤为重要。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的相关内容。
正文:一、样品准备1. 样品的收集、保存和预处理2. 样品加载量的标准化3. 样品质量验证和污染检测4. 基因组DNA和cDNA的质量控制5. 防止样品交叉污染的措施二、引物和探针设计1. 引物和探针序列选择的标准2. 引物和探针的纯化和稀释3. 引物和探针的特异性验证4. 引物和探针设计软件的使用5. 引物和探针批次一致性的验证三、PCR反应体系和条件1. PCR反应体系的配制2. 反应管的选择和处理3. 温度梯度实验和温度优化4. 补偿和矫正实验条件中的误差5. PCR反应重复性的验证四、阳性和阴性对照1. 阳性对照品的选择和制备2. 阳性对照品的定量和标准化3. 阴性对照的添加和验证4. 阳性和阴性对照的检测范围和灵敏度5. 对照品的质量控制和存储五、数据分析和结果解释1. 荧光曲线分析和阈值设置2. 标准曲线的绘制和斜率计算3. 样品浓度的计算和质权矫正4. 数据处理和统计分析方法5. 结果的解释和报告撰写总结:实时荧光定量PCR国际化标准的确立对于确保实验结果的准确性、可比性和可重复性具有重要意义。
通过规范样品准备、引物和探针设计、PCR反应体系和条件、阳性和阴性对照以及数据分析和结果解释等环节，我们能够实现实时荧光定量PCR方法的国际化标准化，从而为该技术的应用提供更可靠的支持。
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。
荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。
荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。
在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。
实时荧光定量pcr标准曲线
实时荧光定量pcr标准曲线实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测DNA 或RNA的定量分析技术，其基本原理是利用DNA或RNA在PCR过程中产生的荧光信号来实时监测目标序列的扩增情况。
实时荧光定量PCR标准曲线是评估PCR反应效率和定量分析的重要工具，下面将介绍实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法及其在定量分析中的应用。
1. 实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法。
实时荧光定量PCR标准曲线的构建需要使用一系列已知浓度的模板DNA或RNA标准品，通过对这些标准品进行系列稀释，得到一系列浓度不同的标准曲线点。
在PCR反应中，利用这些标准曲线点进行定量分析，可以得到PCR反应的效率和灵敏度。
首先，选择合适的模板DNA或RNA标准品，可以是纯化的基因片段、合成的基因片段或者已知浓度的cDNA。
然后，对标准品进行系列稀释，通常选择10倍稀释系列，以得到一系列浓度不同的标准曲线点。
接下来，进行实时荧光定量PCR反应，利用这些标准曲线点进行定量分析，得到PCR反应的效率和灵敏度。
2. 实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中的应用。
实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中起着至关重要的作用。
首先，通过标准曲线可以评估PCR反应的效率，即每个循环的扩增倍数，从而判断PCR反应的质量和稳定性。
其次，利用标准曲线可以进行定量分析，计算待测样品中目标基因的相对或绝对含量，从而实现对目标基因的定量检测。
在实际操作中，构建实时荧光定量PCR标准曲线需要严格控制实验条件，确保反应体系的稳定性和准确性。
此外，选择合适的荧光探针和引物对于实时荧光定量PCR的准确性和灵敏度也至关重要。
总之，实时荧光定量PCR标准曲线是实时荧光定量PCR技术中的重要工具，其构建和应用对于PCR反应的效率评估和目标基因的定量分析具有重要意义。
在实际应用中，科研人员需要充分理解实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法和应用原理，以确保实验结果的准确性和可靠性。
实时荧光定量pcr的原理和方法
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。
在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。
使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
实时定量pcr原理
实时定量pcr原理实时定量PCR原理。
实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测和量化DNA或RNA的技术，它结合了传统PCR技术和荧光探针技术，能够实现对靶基因的快速、准确和高灵敏度的定量分析。
实时定量PCR的原理基于传统PCR技术，但是在PCR反应过程中通过荧光信号实时监测靶基因的扩增情况，从而实现对靶基因的定量分析。
在实时定量PCR中，常用的荧光探针包括SYBR Green和TaqMan探针。
在实时定量PCR反应中，首先是DNA或RNA的反转录和前PCR扩增，然后在PCR反应过程中，荧光信号与靶基因的扩增量成正比。
通过检测荧光信号的增加，可以实时监测靶基因的扩增情况，并且可以根据荧光信号的增加来计算出靶基因的起始量。
实时定量PCR的优势在于其快速、准确和高灵敏度的特点。
相比于传统PCR技术，实时定量PCR无需等待PCR反应结束后再进行结果分析，而是可以在PCR反应过程中实时监测靶基因的扩增情况，从而能够更快速地得到定量分析结果。
同时，实时定量PCR的荧光信号检测系统能够实现对靶基因的高灵敏度检测，能够检测到极低浓度的靶基因。
另外，实时定量PCR还具有高度的准确性。
通过荧光信号的实时监测，可以避免了传统PCR技术中可能出现的内源性荧光干扰，从而能够更准确地进行靶基因的定量分析。
总的来说，实时定量PCR技术是一种快速、准确和高灵敏度的DNA或RNA定量分析技术，它在基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域具有广泛的应用前景。
随着实时定量PCR技术的不断发展和完善，相信它将在生命科学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
实时定量PCR技术的基本原理
实时定量PCR技术的基本原理引言实时定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种用于测量DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、体外诊断和分子遗传学研究等领域。
本文将介绍实时定量PCR技术的基本原理，包括反应原理和应用。
反应原理实时定量PCR是基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的原理，但与传统PCR有所不同。
传统PCR只能在反应结束后测量PCR产物的数量，而实时定量PCR则可以在PCR反应过程中实时测量产物数量的变化。
实时定量PCR一般使用荧光探针标记PCR产物。
荧光探针通常由两部分组成：靶向序列与荧光染料。
靶向序列与待测分子特异性结合，荧光染料则可以发光。
在PCR反应过程中，靶向序列与目标DNA（或RNA）结合并被聚合酶扩增。
当PCR产物与荧光探针结合时，染料释放出荧光信号，通过荧光仪器可以实时检测到荧光信号的强度。
实时定量PCR的关键在于荧光信号的监测与数据分析。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度变化可以了解PCR反应的进程和产物的数量。
数据分析可以根据荧光信号的强度变化绘制标准曲线，进而推断待测样品中特定分子的初始数量。
应用实时定量PCR技术在生命科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。
基因表达分析实时定量PCR可用于定量测量基因表达水平的变化。
通过检测靶向基因的mRNA在不同生理条件或疾病状态下的表达量，可以揭示基因表达调控的机制和生物学功能。
病原体检测实时定量PCR可以快速、准确地检测病原体的存在和数量。
它被广泛应用于临床微生物学、传染病监测和食品安全等领域。
通过选择特定的引物和探针，可以实现对不同病原体的特异性检测。
体外诊断实时定量PCR在临床诊断中发挥着重要的作用。
例如，它可以用于早期癌症的检测和监测，通过检测肿瘤标志物的数量变化来评估治疗效果和预测预后。
实时定量PCR技术原理
实时定量PCR技术原理实时定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于DNA扩增的技术，可以在PCR过程中同时进行扩增和定量分析。
其原理是利用DNA聚合酶酶的催化作用，在初始模板DNA的基础上，通过PCR循环反应不断扩增目标序列的数量，并通过荧光信号的强度变化来实时监测扩增过程。
实时定量PCR使用双链DNA作为模板，首先通过热变性步骤将DNA模板的两条链分离。
然后，在降温的过程中，引物与模板特异性结合形成引物-模板复合物。
引物是针对目标序列设计的短链DNA，根据目标序列的首尾碱基序列确定。
在PCR扩增的第一次循环中，引物与模板复合物在热稳定的DNA聚合酶的存在下，通过链延伸反应合成新的DNA链。
DNA聚合酶酶会催化引物与模板的配对延伸反应，合成新的DNA链，同样的，新合成的DNA链会作为模板在下一循环中被再次复制，形成指数级的扩增。
实时定量PCR技术使用DNA荧光染料或探针来标记并检测扩增过程中产生的DNA数量。
荧光信号可以分为非特异性荧光信号和特异性荧光信号。
非特异性荧光信号来自于引物和其他反应物的副产物，在扩增早期出现，但由于无法用于准确定量，一般在分析中会被排除。
特异性荧光信号来自于目标序列的扩增产物，并通过荧光探针或广泛用的双链DNA染料（如SYBR Green）进行检测。
通过在每一个循环反应中实时监测荧光信号的强度，可以获得一个荧光强度随循环次数而变化的荧光曲线。
荧光强度的增加代表了目标序列的扩增量，通过与已知浓度的标准样品对比，可以计算出初始样品中目标序列的数量。
实时定量PCR技术的优势在于实时监测扩增过程，能够准确、快速地定量目标序列的数量，并且操作简便，适用于许多领域，如基因表达分析、病原微生物检测、基因突变检测等。
acrip-qpcr原理
acrip-qpcr原理一、概述acrip-qpcr是一种先进的分子生物学检测技术，它结合了实时定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）和基因芯片的优点，实现了对特定基因表达的快速、准确和大规模检测。
二、工作原理1. 实时定量PCR技术实时定量PCR技术是一种用于测定基因表达量的技术，通过PCR 技术扩增特异性核酸序列，并在每一个PCR循环后进行实时检测，从而获得靶基因的拷贝数，进而确定其在样本中的表达水平。
传统的RT-PCR方法虽然可以检测特定基因的表达，但其灵敏度、特异性和通量等方面存在局限性。
而acrip-qpcr则通过实时定量PCR技术，结合高灵敏度、高特异性探针和全自动高通量芯片检测，实现了对特定基因表达的精确、快速和大规模检测。
2. 基因芯片技术基因芯片技术是一种将大量探针分子固定于支持物上的技术，用于检测样品中大量基因的表达情况。
通过将样品中的基因序列与探针分子杂交，从而获得样品中基因表达的信息。
传统的基因芯片方法虽然可以同时检测多个样本中的基因表达情况，但其操作复杂、成本高昂、检测范围有限。
而acrip-qpcr则通过将实时定量PCR技术和基因芯片技术有机结合，实现了对特定基因表达的高效、准确和大规模检测。
1. 高灵敏度：acrip-qpcr能够检测到低至单个拷贝的靶基因，具有更高的灵敏度。
2. 高特异性：通过设计特异性的探针，acrip-qpcr能够有效地区分靶基因和其他相似序列，具有更高的特异性。
3. 高通量：acrip-qpcr能够同时检测大量样本中的特定基因表达情况，具有更高的通量。
4. 自动化：acrip-qpcr采用全自动高通量芯片检测，操作简便、快速，减少了人为误差。
5. 可扩展性：acrip-qpcr能够适应不同样本类型和实验需求，具有可扩展性。
四、应用领域acrip-qpcr技术广泛应用于基础生物学研究、临床诊断和药物研发等领域。
在基础生物学研究中，acrip-qpcr可用于研究特定基因在细胞类型和不同发育阶段中的表达模式，鉴定新的生物标志物，以及研究基因调控网络等。
实时荧光定量pcr技术原理
实时荧光定量pcr技术原理宝子们！今天咱们来唠唠一个超酷的技术——实时荧光定量PCR技术。
这玩意儿听起来是不是就感觉很厉害的样子？那啥是PCR呢？PCR就像是一个复印机，不过它复印的不是文件，而是DNA。
普通的PCR就是把一小段DNA不断地复制，让它的数量变得超级多。
就好像你有一颗小种子，然后通过某种魔法，让它变成一大片花海，超神奇的吧！那实时荧光定量PCR呢，它可不只是简单地复制DNA哦。
它呀，在复制的过程中还能实时地检测DNA的数量。
这就好比你在种小种子的时候，还能随时知道已经长出来多少朵花了。
这里面有个关键的东西就是荧光染料或者荧光探针啦。
咱先说说荧光染料这个小机灵鬼。
荧光染料就像一个小间谍，它特别喜欢和DNA结合。
当它和DNA结合的时候呢，就会发出荧光信号。
随着DNA被复制得越来越多，结合的荧光染料也就越来越多，那发出的荧光信号就越来越强啦。
就像一群小萤火虫，最开始只有几只，慢慢地就变得好多好多，整个地方都亮闪闪的。
再说说荧光探针这个有趣的家伙。
荧光探针就像是一个带着特殊任务的小信使。
它的结构有点特别，一头是荧光基团，另一头是淬灭基团。
在没有发生反应的时候呢，这个荧光基团发出的光会被淬灭基团给弄没了，就像你想点亮一个小灯，但是旁边有个小怪兽把光给吞掉了。
可是呢，当PCR反应进行的时候，这个探针会和DNA结合，然后就像一把小剪刀把探针剪断了，这样荧光基团就自由啦，就可以发出明亮的荧光啦。
是不是感觉像一场小小的魔法秀呢？那这个技术为啥这么有用呢？它可以用来检测很多东西哦。
比如说在医学上，可以检测病毒的数量。
如果有个病人感染了病毒，通过这个技术就能知道他身体里到底有多少病毒在捣乱。
这就像我们要和病毒打仗，得先知道敌人有多少兵力一样。
如果病毒数量很多，那我们就得用更厉害的武器去对付它。
在科研上，这个技术也超棒的。
可以用来研究基因的表达量。
就像每个基因都有自己的小脾气，有的时候很活跃，表达量就高；有的时候就很安静，表达量就低。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系 统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断 和个体化用药分析的首选技术平台。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞 争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物 被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已 知模板推测未知模板的起始拷贝数。
谢谢观看
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地 高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加 入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
三种PCR类型及应用
三种PCR类型及应用多种PCR技术类型：1. 实时定量PCR（qPCR）实时定量PCR是一种检测PCR反应过程中的特定DNA序列的技术。
它可以实时监测PCR反应过程中的产物累积情况，通过检测DNA结合荧光染料的信号强度来定量分析起始模板的含量。
由于其高灵敏度和快速结果，实时定量PCR 被广泛应用于基因表达分析、微生物检测、病毒定量测定等领域。
2. 数字PCR数字PCR是一种基于微小级别的PCR技术，通过将PCR分成数百万份独立的反应来进行定量分析，从而实现对起始模板数的精确计数。
与传统PCR技术相比，数字PCR具有更高的灵敏度和准确性，尤其适用于低拷贝基因的检测和分析。
数字PCR广泛应用于检测稀有突变、检测微生物DNA和病毒DNA等领域。
3. 表面增强拉曼散射PCR表面增强拉曼散射PCR结合了PCR技术和拉曼光谱学，通过在PCR过程中引入金纳米颗粒来增强PCR产物的拉曼信号，从而实现对PCR产物的多重检测和分析。
表面增强拉曼散射PCR技术具有高速、高灵敏度和高特异性的特点，适用于分子生物学、生物医学和环境监测等领域。
不同类型PCR的应用：1. 实时定量PCR在基因表达分析中的应用实时定量PCR可以准确、快速地测定特定基因的表达水平，广泛应用于基因调控研究、药物筛选、疾病诊断等领域。
通过实时定量PCR技术，研究人员可以量化分析基因在细胞、组织或生物样品中的表达情况，从而深入了解基因的功能和调控机制。
2. 数字PCR在稀有基因检测中的应用数字PCR技术可以对样本中稀有基因的存在进行准确计数，适用于肿瘤标志物检测、胎儿DNA检测等需要高灵敏度和准确性的应用。
通过数字PCR技术，研究人员可以对样本中的特定基因进行精确检测，为疾病诊断和生物医学研究提供有力的支持。
3. 表面增强拉曼散射PCR在环境监测中的应用表面增强拉曼散射PCR技术可以实现对微生物DNA的可视化检测，广泛应用于环境监测和水质检测等领域。
实时定量pcr标准曲线
实时定量pcr标准曲线实时定量PCR标准曲线。
实时定量PCR（qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样品中的数量的技术。
它是一种快速、准确、灵敏的方法，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
在进行实时定量PCR实验时，标准曲线是非常重要的，它可以用来确定目标基因的拷贝数，并进行定量分析。
本文将介绍实时定量PCR标准曲线的建立方法及相关注意事项。
建立实时定量PCR标准曲线的第一步是准备标准品。
标准品通常是目标基因的纯化片段或合成基因片段，其浓度应该事先确定，并且要进行系列稀释，以得到一系列已知浓度的标准品溶液。
这些标准品溶液将用于构建标准曲线。
接下来是进行PCR反应。
在进行PCR反应时，将目标基因的标准品溶液与PCR试剂混合，然后进行PCR扩增。
扩增过程中，实时检测PCR产物的累积量，并记录下来。
通过测定不同浓度的标准品溶液的PCR产物累积量，可以得到标准曲线的数据点。
在得到标准曲线的数据点后，需要进行数据分析。
通常情况下，标准曲线是通过绘制标准品浓度与PCR产物累积量的对数值之间的关系图来表示的。
通过标准曲线，可以将待测样品的PCR产物累积量转化为目标基因的拷贝数，从而进行定量分析。
在建立实时定量PCR标准曲线时，有一些注意事项需要特别注意。
首先，标准曲线的构建需要使用至少三个不同浓度的标准品溶液，以确保曲线的可靠性和准确性。
其次，在进行PCR反应时，要确保反应条件的稳定性，避免出现扩增效率不一致的情况。
另外，数据分析时要注意选择合适的拟合模型，以确保标准曲线的准确性和可靠性。
总之，实时定量PCR标准曲线的建立是实验中非常重要的一步，它直接影响到定量分析的准确性和可靠性。
在进行实时定量PCR实验时，需要严格按照标准曲线的建立方法进行操作，并注意相关的注意事项，以确保实验结果的可靠性和准确性。
希望本文所介绍的内容能够对实时定量PCR实验中标准曲线的建立有所帮助。
Real time PCR
体会总结
• 1、real time PCR 因为灵敏度高，实验过程 中要尽量避免核酸污染，每次实验时都要 设置NTC。 • 2、避免微量加样，除模板以外的其它反应 成分可以先预混匀后再分装。
• 3、在real time PCR实验之前，尽量在普通 PCR上摸索好实验条件,比如说测引物特 性、合适的引物模板浓度等。 • 4、合适的调整引物和荧光物质的浓度，一 般引物浓度不能过高，浓度过高易导致模 板与引物错配,反应特异性下降。
• 5、实验准备非常重要，尽管实验准备这个 阶段非常繁琐，但只有把自己要做的实验 思路想好，实验材料准备好，要做的实验 才会更好、更顺利的完成。 • 6、从做PCR这个实验我认为实验细节很重 要，决定实验的成败，只有把每个实验的 细节做好，实验才会达到我们预想的效果。
板与引物错配,反应特异性下降
The end
• 实时荧光定量PCR与常规PCR相比，它具 有操作简单、结果获得快速、特异性更强、 有效解决PCR污染问题、自动化程度高等 特点。
Realtime PCR 常用的两种方 法
• SYBR green（荧光染料 掺入法） • Taqman probe （探针法）
SYBR green
• 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧 光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链 中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号， 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增 加完全同步。
Real time PCR
实时荧光定量PCR
• 定义：在PCR反应体系中加入 荧光基团，利用荧光信号累积 实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线对未知模板进行 定量分析的方法 。
实时定量PCR技术和常规PCR技术的区别
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Realtime PCR detection system working procedure
SYBR Green I Assays
SYBR Green I detection of genomic DNA. Amplification of the IL-1beta gene from human genomic DNA. A, 5-fold serial dilutions
实时监测产物量，计算初始模板量
1.基础研究的基因表达分析研究 2.临床病原体检测
3.食品卫生检疫
基础研究的基因表达分析研究 定量PCR和Array技术的结合 Oncogene 2002 Jul 4;21(29):4587-94 Expression profiling of microdissected pancreatic adenocarcinomas. 定量PCR和LCM技术的结合 特定细胞中基因表达变化 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 4, 2234-2239, February 19, 2002 Laser capture microdissection analysis of gene expression in macrophages from atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice
标准曲线
• 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 • 计算待测样品的初始模板浓度
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490
Melt Curve Graph for FAM-490
一. 实时监测产物量，计算初始模板量
1.基础研究的基因表达分析研究 2.临床病原体检测 3.食品卫生检疫
2.临床病原体检测 a.病人体液中目标基因的检测. 病毒,寄生虫,细菌 市场上有各种开发好的试剂盒 3.食品卫生检疫 a.转基因食品的检疫 根据转入基因的特异性区段设计探针 b.食品中病原微生物的检测
二. 基因型分析
1.利用扩增信号的种类来分型 2.根据熔解曲线的不同来分型
Amplicon
4.Cycle 20-30.
dsDNA 65-150 bp
dsDNA varies--different sizes.
Data
First Amplification cycle--Starting Quantities.
Gel bands
MeltCurves Gel bands
Principle I : Primer-Fluoresent
of human genomic DNA (50 ng to 16 pg) were amplified using gene-specific primers; B, standard curve of the serial dilution (r = 0.997, efficiency = 98.4%).
Realtime PCR
Template Enzyme Primers Probe* Dye Protocol
Regular PCR DNA(cDNA) Taq DNA Polymerase Forward & Reverse Primers
DNA(cDNA) Taq DNA Polymerase Forward & Reverse Primers 50-200nM target DNA seq. with fluorescence SYBR Green or different kinds dye(FAM, TET..) 1.Denature 95oC 1min.
Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR) process requires a license. The iCycler iQ system includes a licensed thermal cycler and may be used with PCR licenses available from Applied Biosystems. Its use with authorized reagents also provides a limited
No dye 1.Denature 95oC 1min.
2.Annealing 60oC 1 min. 3.Extension 72oC 1-3 min. or don't need.
2.Annealing 60oC 1 min. 3.Extension 72oC 1-3 min.
4.Cycle 40.
Realtime PCR Detection System 实时定量PCR技术及其应用
南京农业大学 陈 溥 言
定量PCR技术的产生
1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染 料法插至双链 DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的 荧光强度 PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I 取代EB
Exon1a-1 193bp
GC Rich
701bp 125bp
Exon1
1,173bp 26bp
Exon2 25,854bp 118bp
Exon3
Rat--Chro.1
340bp
159bp
154bp
ATG
Exon3 24,494bp
ExonX 430bp
74bp Rat Exon1a Unkown Seq. GC Rich /Exon1 525bp 293bp 125/26bp
荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
实时在线监控
对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加， 观地看到反应的对数期 直
降低反应的非特异性
使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性
增加定量的精确性
全程监控，准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便，无需跑胶
Realtime PCR & Regular PCR Comparasion II
Real-time analysis can be viewed online, during the PCR Range of fluorophore excitation and emission from 400–700 nm 4 different fluorophores can be multiplexed per sample tube 96 samples can be tracked simultaneously, maximizing throughput Sample data can be reanalyzed at any time Raw data files are user accessible Easy, intuitive software speeds setup and data presentation Storage of hundreds of protocols Standard PCR plate format accommodates existing protocols and minimizes costs User interface offers easy yet powerful options for data analysis Real-time quantitative PCR provides accurate quantitation, accelerating lead identification in drug discovery and improving viral load assessment iCycler iQ software is designed to automate analysis options, including quantitative and melt-curve analysis; you can also choose to reanalyze raw data at any point post-run Monitor the thermal protocol in real time, saving time and effort in your analysis Closed-tube analysis reduces contamination concerns and speeds time to results
Байду номын сангаас
Rat Exon2 1,198bp 121bp
Mouse-Chro.19
158bp
154bp
ATG
Exon2
Exon-1a 837bp 162bp
Rat/Mouse Exon1a Region
Exon-1b
Rat Exon2
Human-Chro.11
804 bp 225bp 254bp 121bp
26,288bp
Principle II : Primers & Probe(Beacon)-Fluoresent
Principle III—SYBR Green I dye
探针设计的一般原则：
1. 扩增片段的长度不应太大,一般小于300bp 2. 探针不能和任一引物互补. 3. 探针保证特异性的前提下尽可能的短，长度不超过 30bp. 4. 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度 5. 探针应尽可能的靠近引物 6. 如用于检测多态位点,多态位点应尽可能的靠近探 针中部. 7. 探针5’端不能是G，G有淬灭作用.