肠道病毒感染病例标本的处理细胞接种和观察

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人肠道病毒传播方式
• > 粪-口Байду номын сангаас径传播: 唾液与粪便
• > 呼吸道传播: 空气飞沫 • > 接触传播:一般人肠道病毒在呼吸道 飞沫中可存留约一至三周，而经胃肠 道的粪便排泄可达到二至三个月以上。
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病毒的组织培养
• 所有已知的人肠道病毒都可以在组织细胞 培养或乳鼠中繁殖； • 大部分血清型可以在1种以上的人源传代细 胞中生长； • 但是没有哪一种细胞可以支持所有的人肠 道病毒生长； • 研究至今，一些血清型（如Cox A1病毒） 只能在乳鼠中繁殖。
肠道病毒感染病例标本的处 理、细胞接种和观察
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人肠道病毒简介和分类
• • • • • • • • • • •小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要 在肠道内复制, 但可感染各个系统和器官。 •单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。 •小球形病毒（~ 30 nm）， 20面体对称结构。 •衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面， VP4与内部RNA结合。 •与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。 •在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。 •引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌 损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。
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实验室检测方法
• 临床怀疑：夏秋季，婴幼儿、皮疹、接触、脑膜 炎 • 实验室的检测方法包括： • 1)血清抗体的变化： 血清抗体4倍变化 • 2)病毒培养及鉴定：理想（金标准）但费时费力， 且部分肠病毒型别不易培养 • 3)组织病理切片检查 • 4)分子生物学检测，RT-PCR，RealTime PCR， 分子杂交等 • 5)快速抗原检测：芯片
• （四）疱疹液：在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到 病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。 先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱 疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液 （维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶 端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即 （12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存 的标本存于－70℃冰箱。 • （五）脑脊液标本：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标 本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊 断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为 1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立 即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存 的标本存于－70℃冰箱。 • （六）病例密切接触者的标本采集：选择典型病例所在的托幼机 构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪 便和血清标本。 • （七）健康对照的标本采集：选择患儿发病所在社区（村）的临 近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪 便和血清标本。 12
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电镜下的病毒形态
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病毒特性
• 肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传 播，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感，75% 酒精和5%来苏亦不能将其灭活，但对紫外 线及干燥敏感。各种氧化剂(高锰酸钾、漂 白粉等)、甲醛、碘酒都能灭活病毒。病毒 在50 ℃可被迅速灭活，但1mol浓度二价阳 离子环境可提高病毒对热灭活的抵抗力， 病毒在4 ℃可存活1年，在- 20 ℃可长期保 存，在外环境中病毒可长期存活。
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标本的采集
• （一）粪便标本：采集病人发病7日内的粪便标本，用 于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放 入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－ 20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃ 冰箱。 • （二）咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本， 用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁 和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入 装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持 液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖 并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室， －20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－ 70℃冰箱。 • （三）血清标本：采集急性期（发病0~3d）和恢复期 （发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采 集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离 11 血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。
手足口病
• 引起手足口病的主要为小RNA病毒科、肠道病毒 属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus) A组16、4、5、 7、9、10 型， B组2、5型；埃可病毒（ECHO viruses）和肠道病毒71型（EV 71），其中以EV 71及Cox Al6型最为常见。 • 感染后引起– 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚 侧面及掌心、屁股出现小泡 • 传染性极高 • 病程约1周
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病毒分离
• –诊断肠道病毒感染的最主要手段，也是金标准。 • –柯萨奇B组病毒和埃可病毒可以很容易地在细胞培 养上生长。适合的标本有咽拭子、粪便标本，鼻拭 子等，也可以从脑脊液中分离到病毒。 • –一些柯萨奇A组病毒不容易通过细胞培养进行分离， 可以通过乳鼠进行分离，但是操作比较复杂，一般 实验室不常规使用这种方法。分子生物学的方法更 适合这种病毒的诊断。 • • 血清学方法 • –自从细胞培养已经可以用做病毒分离后，血清学 方法已经不经常使用了。 • –中和实验，但是非常繁琐，因此，一般也不做这 方面的实验。 9
细胞培养分离方法
• •1990年以前，大都都采用Vero、GMK细胞分离； • •1994年以后，人结肠癌上皮细胞（Caco-2）取代 了Vero细胞； • •1998年人们开始用人肺系细胞（MRC-5）分离 CoxA16等毒株，其敏感性与Caco-2细胞相当。 • •目前，大都使用人源细胞如人喉癌上皮细胞 （HEp-2）、人横纹肌肉瘤细胞（RD）用于病毒分 离。RD细胞支持大多数柯萨奇A组病毒复制。 • •对一些不能在细胞上生长的病毒，可用乳鼠接种分 离病毒。但埃可病毒一般不引起乳鼠发病。