实验七紫外分光光度法测定核酸含量
紫外分光光度计检测核酸浓度和纯净度
紫外分光光度计检测核酸浓度和纯净度
A260是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值范围是0.1到1.0，如果不在次范围建议稀释或浓缩样品；样品吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素，正常情况下，DNA样品的吸光度一定大于0.1，样品中出现杂质或者不错纯净会使吸光度减小。
A280是蛋白和酚类最高吸收峰的吸收波长。
因此A260/A280的比值可以对核酸纯度进行评估，一般情况下，纯净的DNA的A260/A280比值为1.8,纯净的RNA为2.0. 如果比值较低，表明样品中存在蛋白或者酚类物质的污染，需要纯化样品，特别说明A260/A280=1.5时，相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，A260/A230比值可以对核酸样品纯度进行评估，纯净的DNA或者RNA的A260/A230比值为2.5。
如果比值小于2.0，说明样品存在碳水化合物、盐类、有机物的污染，需要纯化样品。
特别说明，A230产生负值主要是由于在很低的DNA浓度
A320/A340 检测吸光值用于检测样品溶液的浊度和其他干扰因子。
纯净的样品改值为0.00,如果不是，说明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验7紫外分光光度法测定核酸的含量(精)
四、试剂
1、5%~6%氨水 2、钼酸铵-高氯酸试剂（沉淀剂）。如配
制200mL可在193mL蒸馏水中加入 7mL70%高氯酸和0.5g钼酸铵。
五、实验操作
1、用分析天平准确称取待测的核酸样品 500 mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入 少量的水稀释。然后用5%~6%氨水调至 pH7，定容到50mL。
实验7 紫外分光光度法测定核酸的含量
一、实验目的
1、了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 2、学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理
和操作方法。
二、实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系 统，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收 高峰在A260nm波长处。通常规定：在 260nm波长下，浓度为1μg/mL的 DNA溶液 其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA 溶液其光密度为0.024。
六、计算
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷 酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品 配制成一定浓度的溶液（20~50kg/mL） 在紫外分光光度计上直接测定。
五、实验操作
2、取2支离心管，向第一支管内加入2mL样品溶液和2mL 蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂， 以除去大分子核酸作为对照。混匀。在冰浴或冰箱中放置 30分钟后离心（3000r/min，10分钟）。从第一管和第二 管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容到50mL。用光 程为1cm的石英比色杯，于260nm波长处测其光吸收值 （A1和A2）。
二、实验原理
故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波 长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。 此法操作简便。若样品内混杂有大量的核苷 酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定 误分析天平 3、容量瓶 5、吸管
紫外分光光度法测定核酸含量的影响因素分析
DOI：10.13822/ki.hxsj.2020007049化学试剂,2020,42(1),53-57产Y Ay AY AYj分析与测试j紫外分光光度法测定核酸含量的影响因素分析李春'，刘建涛▽，高运华「，王治栋-段学欣$(1•中国计量科学研究院前沿计量科学中心，北京100029；2.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津300072)摘要：选择寡聚核昔酸、鮭鱼精单链DNA、小牛胸腺双链DNA标准物质为样本，系统研究了溶液pH、苯酚、丙酮、蛋白质、多糖等对紫外分光光度法测量结果的影响情况，另外考察了核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的相互影响情况。
研究发现基于分光光度法的核酸定量分析，易受溶液pH、苯酚、丙酮、蛋白质、多糖等的影响，另外，DNA和RNA之间也会相互干扰。
因此，紫外分光光度法测定核酸含量时，特别是该方法用于核酸标准物质特性量值确定时，需要样品高度纯化，pH确定的条件下才能保证测量结果的准确可靠。
关键词：紫外分光光度法；核酸；含量；影响因素；pH；有机试剂中图分类号:0657.32文献标识码：A文章编号:0258-3283(2020)01-0053-05Influencing Factors of Determination of Nucleic Acid Content by Ultraviolet Spectrophotometry LI Chun',LIU Jian-tao i,2,GAO Yun-hua*1,WANG Zhi-dong',DUAN Xue-xin2(1.Center for Advanced Measurement Science,College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering,National Institute of Metrology,Beijing100029,China；2.College of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering,Tianjin University,Tianjin300072,China),Huaxue Shiji,2020,42(1),53~57 Abstract：The oligonucleotide,salmon single-stranded DNA,and calf thymus double-stranded DNA were measured by UV spectrophotometry,and the effect of solution pH,phenol,acetone,proteins and polysaccharides on the measurement were investigated.In addition,the interaction between ribonucleic acid(RNA)and deoxyribonucleic acid(DNA)was examined.The studies had found that quantitative analysis of nucleic acids based on spectrophotometry was susceptible to solution pH,phenol,acetone,protein,polysaccharides,and so on.DNA and RNA also interfered with each other.Therefore,UV spectrophotometry for the determination of nucleic acid content required high purity of the sample, and the pH was determined to ensure accurate and reliable measurement results.Especially,the method was used to determine the characteristic value of nucleic acid reference material.It needed highly purified candidate of reference material,and the determination of pH could ensure the accuracy and reliability of the characteristic value of reference material.Key words:ultraviolet spectrophotometry；nucleic acid；content；influencing factors；pH；organic reagent随着微量分光光度计的广泛推广和应用，利用微量核酸样本定量核酸浓度成为了生命科学和临床检验等核酸相关研究实验室最常使用的方法W紫外分光光度法简便快捷，在药物分析⑷、食品安全⑶、标准物质研制⑻等领域有着重要作用。
紫外分光光谱法和化学法测定核酸含量
紫外吸收光谱法及化学法测定核酸含量
实验原理
o 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌 呤、嘧啶碱基具有共轭双健（C＝CC＝C ），能够强烈吸收250～280nm波长的紫 外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸 收值在260nm左右。核酸、核苷酸及其衍 生物分子组成中都含有这些碱基，因而具有 吸收紫外光的作用。遵照LambertBeer定 律，可以从紫外吸收光谱的变化来测定核酸 类物质的含量。
o 当已知ε（p）时，只要将被测核酸溶液在紫外分 光光度计260nm波长处，通过光径为1cm的比色 杯，测得OD值，即可测得该核酸溶液的浓度。 o 现已知RNA的ε（p）在260nm（pH7）时为 7700～7800，RNA的磷含量约为9.5%。因此， 每毫升溶液（中性）含1μg的RNA钠盐，在 260nm波长处通过光径为1cm的比色杯时的光密 度相当于0.020～0.024
o 化学法DNA含量的的原理： o DNA在强酸条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核 糖 之间的糖苷键断裂。生成嘌呤碱、脱氧 核糖和脱氧嘧啶核苷酸。脱氧核糖在酸性条 件下脱水生成酮基戊糖，后者与二苯胺在酸 性条件下生成蓝色物质，在597nm波长处 有最大吸收。
实验器材
o 紫外分光光度计
实验方法
o 1．碱基、核苷、核苷酸的定性测定 o 现在已经知道碱基、核苷、核苷酸在一定pH值时 有4个特定的紫外光吸收值（光密度）的比值是固 定的。要鉴别测得的未知样品中这些成分，只要测 定它们在一定pH条件下如下几个特定波长 （250nm，260nm，280nm，290nm）紫外光 的吸收值（光密度），然后根据其光密度比值 （250nm/260nm，280nm/260nm， 290nm/260nm）即可鉴别碱基、核苷和核苷 酸。
关于核酸的实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸提取、纯化的基本原理和操作方法。
2. 了解紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。
3. 学会使用核酸纯化试剂盒和分光光度计。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，而RNA则主要存在于细胞质中。
核酸提取、纯化是研究核酸结构、功能的基础。
1. 核酸提取：利用细胞壁和细胞膜的破坏，将核酸从细胞内释放出来。
2. 核酸纯化：通过去除杂质，提高核酸的纯度。
3. 核酸定量测定：利用紫外分光光度法，根据核酸的吸光度与浓度的关系，计算核酸的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌、Tris-HCl缓冲液、NaCl溶液、SDS溶液、酚/氯仿/异戊醇混合液、乙醇、无水乙醇、DNA/RNA提取试剂盒、核酸纯化柱等。
2. 实验仪器：高速离心机、分光光度计、移液器、漩涡混合器、PCR仪等。
四、实验步骤1. 核酸提取（1）将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃培养过夜。
（2）取适量菌液，加入Tris-HCl缓冲液和NaCl溶液，混匀。
（3）加入SDS溶液，混匀。
（4）加入酚/氯仿/异戊醇混合液，剧烈振荡，静置。
（5）取上层水相，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，剧烈振荡，静置。
（6）取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，静置。
（7）离心，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥。
2. 核酸纯化（1）将干燥的核酸沉淀溶于适量TE缓冲液中。
（2）将溶液加入核酸纯化柱中，用TE缓冲液洗柱。
（3）用适量无水乙醇洗柱，收集洗脱液。
3. 核酸定量测定（1）取适量核酸溶液，用紫外分光光度计测定其在260nm和280nm处的吸光度。
（2）根据核酸的摩尔吸光系数（A260=50μM^-1·cm^-1），计算核酸的浓度。
五、实验结果与分析1. 核酸提取实验成功提取了大肠杆菌的核酸，且纯度较高。
2. 核酸纯化实验成功纯化了核酸，且纯度较高。
3. 核酸定量测定实验测定了核酸的浓度，结果如下：A260 = 0.6A280 = 0.5核酸浓度= 0.3 μg/μL六、实验结论1. 实验成功提取、纯化了大肠杆菌的核酸。
含有核苷酸的核酸-紫外分光光度法测定
含有合核苷酸杂质的核酸含量测定凡文一、原理：DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。
吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。
RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700—7800。
RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022—0.024。
小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。
通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
具体如下：DNA样品：OD260/OD280≈1.8 DNA纯净＞1.9 RNA含量高＜1.7 蛋白质含量高RNA样品：OD260/OD280≈2.0 RNA纯净＞2.2 RNA已降解＜1.7 蛋白质含量高钼酸铵-过氯酸能够与核酸作用形成沉淀，通过离心可以将其沉淀到离心管底部，上清液的OD260反映出核苷酸的含量。
（也可以采用酸性乙醇进行沉淀核酸，详细方法原理参见参考资料[3]）二、器材与试剂：1．器材：容量瓶（50毫升）、离心管、离心机、紫外分光光度计、石英比色皿、微量移液枪、1.5ml Eppendorf管、枪头（灭菌）、烧杯。
2．试剂：①钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液]：取3.6毫升70%过氯酸和0.25克钼酸铵溶于96.4毫升蒸馏水中。
核酸生物化学实验技术实验
核酸生物化学实验步骤（一）酵母中RNA的提取及紫外分光光度法测定核酸浓度1．稀碱法提取酵母中RNA实验原理：基于核酸不溶于乙醇。
先用稀碱将酵母细胞裂解，采用酸中和，通过离心去除菌体细胞的大碎片，采用乙醇可将上清液中的RNA沉淀出来。
该方法提取的核酸分子为变性失活的RNA。
操作方法：（1）称取2 g干酵母粉，放入100 mL烧杯中，加入20 mL 的1%氢氧化钠水溶液，搅拌30 min （玻璃棒手动充分搅拌）。
（2）30 min后，向（1）中加入少量乙酸调节pH至中性（切忌调节pH低于3，RNA的等电点2-2.5），试纸检查。
（3）将（2）全部转移至离心管中，3800 rpm离心10 min（最大装液量离心管体积的三分之二，等分两个离心管进行离心）。
弃沉淀（主要是细胞壁等碎片），留上清（含有RNA）。
（4）将上清液转移至干净的100 mL烧杯中，加入15 mL 95%的乙醇，充分混匀，静置10 min。
（此时，大部分RNA沉积于烧杯底部，转移时需要搅动，以免丢失RNA。
因此该步骤也可将上清液直接转移到离心管，静置10 min是必要的）（5）将（4）转移至离心管，3800 rpm离心5 min（一次离心管装不下，分两次离心），弃掉上清液，用95%乙醇重悬，离心洗涤2次，每次95%乙醇用量5 mL。
（6）将洗涤后的样品转移至干净的表面皿（已称重）上，95℃水浴蒸汽干燥（约10 min左右），称重计算干酵母中RNA含量。
干酵母中RNA含量(%)=提取的RNA重量（g）干酵母重量（g）×100%2．紫外吸收法测定提取RNA干粉中核酸含量实验原理：核酸分子在260 nm处具有特异性吸收峰试验方法：（1）称取实验1中提取的RNA干粉20 mg，加入少量0.5 mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，然后加入去离子水，用50 mL容量瓶定容，（2）以去离子水做空白，测260 nm处的吸光度（A），计算提取的RNA干粉中核酸含量。
紫外分光光度法测定核酸的含量的实验
紫外分光光度法测定核酸的含量的实验紫外分光光度法测定核酸的含量核酸是核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分，根据核酸的物理和化学性质，应用一种简便、快捷、准确的方法，达到测定核酸含量的目的。
1：元素分析表明，RNA 含磷量平均为9.4%，DNA 含磷量平均为9.9％，由此可以推导出核酸质量约为其含磷量的11倍，因此可从测得的核酸样品的含磷量计算核酸的含量。
2：DNA 、RNA 分子在强酸作用下降解的糖，再与浓酸、酚或胺生成的有色化合物，其颜色深浅与核酸含量呈正比，因此通过比色法可测得核酸的含量。
3：核酸分子中的共轭π键具有紫外吸收性质，核酸溶液的吸收度与核酸的浓度呈正比，可用作定量测定。
常用紫外可见分光光度计进行测定，分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。
它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。
可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。
按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称紫外-可见分光光度法。
1. 材料和方法1.1 材料1.2 核酸样品DNA1.3 方法1.3.1 实验器材和试剂器材：分析天平、离心机、容量瓶、紫外分光光度计、吸管试剂：氨水、钼酸铵-高氯酸、1.3.2 实验步骤当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm 处光密度作为对照。
(1)取2 支离心管，每管各加入2mL 待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL 蒸馏水，向乙管内加2mL 沉淀剂。
混匀，在冰浴(或冰箱)中放置10min ，3 000r/min 离心10min 。
将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1~1.0 之间。
选用光程为1cm 的石英比色杯，在260nm 波长下测其光密度OD 260nm 。
1.3.3计算260nm 260nm /0.02OD OD DNA g m μ-? 甲乙含量（）稀释倍数 2 实验结果计算实验结果3 讨论因为蛋白质含有芳香族氨基酸，故也能吸收紫外光，通常吸收峰在280nm 处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，若样品中蛋白质含量较低时对核酸紫外测定影响不大，若蛋白质含量较高时，会影响核酸含量的测定，故应去除蛋白质的干扰。
核酸含量实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸含量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸含量测定中的应用。
3. 通过实验操作，提高实验技能和数据分析能力。
二、实验原理核酸是一类重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
核酸含量的测定对于生物学研究具有重要意义。
本实验采用紫外分光光度法和定磷法两种方法测定核酸含量。
1. 紫外分光光度法核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，在紫外光照射下具有特定的吸收峰。
通过测定核酸溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出核酸含量。
2. 定磷法核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为5%，DNA中含磷量为9%。
通过测定核酸溶液中磷的含量，可以推算出核酸含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料核酸样品、标准核酸溶液、标准磷溶液、定磷试剂、浓硫酸、蒸馏水、移液管、容量瓶、试管、紫外分光光度计、电炉、水浴锅等。
2. 实验仪器紫外分光光度计、电子天平、移液器、试管架、试管、烧杯、滴定管、酒精灯、玻璃棒等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：准确称取一定量的核酸样品，用蒸馏水溶解并定容至一定体积。
（2）测定吸光度：取一定量的核酸溶液，在特定波长下测定吸光度。
（3）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：同紫外分光光度法。
（2）消化：将核酸溶液加入浓硫酸，在电炉上加热至有机物分解，冷却后定容。
（3）测定磷含量：取一定量的消化液，加入定磷试剂，在特定波长下测定吸光度。
（4）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免核酸样品的污染，保证实验结果的准确性。
2. 紫外分光光度法和定磷法各有优缺点，在实际应用中可根据具体情况选择合适的方法。
核酸测定实验报告生化
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的基本原理和方法。
2. 学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作步骤。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析和处理能力。
二、实验原理核酸（DNA和RNA）是生物体内的重要生物大分子，具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
紫外分光光度法是测定核酸含量的一种常用方法，其原理基于核酸在特定波长（如260 nm）下的紫外吸收强度与核酸浓度成正比的关系。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：核酸样品、标准核酸溶液、蒸馏水、无水乙醇、氯仿、异戊醇等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电子天平、移液器、试管、容量瓶、离心机等。
四、实验步骤1. 样品制备：取一定量的核酸样品，用无水乙醇沉淀，离心去除杂质，然后用蒸馏水溶解。
2. 标准曲线制作：配制一系列不同浓度的标准核酸溶液，在260 nm波长下测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度（ng/μL）为横坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：取适量制备好的核酸样品，在260 nm波长下测定其吸光度，从标准曲线上查找对应的浓度。
4. 结果计算：根据样品浓度和样品体积，计算核酸含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：绘制标准曲线，发现吸光度与浓度呈线性关系，相关系数R²大于0.99，说明该实验方法具有较高的准确性和可靠性。
2. 样品测定：对制备好的核酸样品进行测定，得到其吸光度，从标准曲线上查找对应的浓度。
3. 结果计算：根据样品浓度和样品体积，计算核酸含量。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免样品污染和仪器误差。
2. 核酸样品的制备对实验结果影响较大，应确保样品的纯度和浓度。
3. 在绘制标准曲线时，应注意选择合适的浓度范围，确保线性关系良好。
4. 实验过程中，应注意紫外分光光度计的校正和维护，确保仪器性能稳定。
七、实验结论本实验通过紫外分光光度法成功测定了核酸含量，结果表明该方法具有较高的准确性和可靠性。
在实验过程中，我们掌握了核酸定量测定的基本原理和操作步骤，提高了实验操作技能和数据分析和处理能力。
核酸定量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸定量中的应用。
3. 提高实验操作技能，培养科学思维和实验数据分析能力。
二、实验原理核酸（DNA和RNA）是生物体内重要的生物大分子，其含量与生物体的生命活动密切相关。
核酸定量测定是生物学、医学和分子生物学等领域的重要研究手段。
1. 紫外分光光度法：核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
DNA和RNA在260 nm波长处的紫外吸收峰较强，可用于定量测定核酸含量。
2. 定磷法：核酸分子中含有一定比例的磷，DNA和RNA的含磷量分别为9.2%和9.0%。
通过测定核酸中磷的含量，可间接计算出核酸的量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：粗核酸、DNA标准品、RNA标准品、样品待测液、蒸馏水等。
2. 仪器：紫外分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、移液器、试管、吸管等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸标准溶液：准确称取一定量的DNA和RNA标准品，用蒸馏水配制成一定浓度的标准溶液。
（2）测定样品核酸含量：将样品待测液稀释至一定浓度，取适量样品溶液，在260 nm波长处测定其吸光度。
（3）绘制标准曲线：以DNA或RNA标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的核酸浓度，计算样品中核酸的量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制标准磷溶液：准确称取一定量的磷酸二氢钾，用蒸馏水配制成一定浓度的标准磷溶液。
（2）测定样品核酸中磷含量：将样品待测液加入强酸，使核酸分子中的有机磷转化为无机磷，与钼酸铵反应生成磷钼酸铵。
在还原剂存在下，磷钼酸铵被还原生成钼蓝，用分光光度法测定其在660 nm处的吸光度。
（3）绘制标准曲线：以标准磷溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）计算样品核酸含量：根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查得相应的磷浓度，乘以核酸的含磷量，计算样品中核酸的量。
查阅资料简单介绍通过紫外分光光度计给核酸定量的原理。
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实验测定核酸含量——紫外分光光度法
实验测定核酸含量——紫外分光光度法Experiment Report生化实验级班学号Subject Specialty Grade Name Date实验测定核酸含量——紫外分光光度法一.实验目的：学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二.实验原理：DNA和RNA都具有紫外吸收的性质，它们的紫外吸收高峰在260nm处。
其紫外吸收特性是由于它们含有的嘌呤环和嘧啶环中的共轭双键系统的特性所决定的。
蛋白质分子中含有Trp、Phe、Tyr等有共轭双键系统的氨基酸，因此对紫外光在280nm处有吸收高峰，而在260nm处的吸收仅为核酸的1/10。
纯核酸260nm与280nm吸收的比值RNA应为2.0，DNA为1.8以上。
核酸分子中无论DNA还是RNA，主链结构单一，呈现磷酸-核糖（脱氧核糖）的重复。
由此通过测定核酸分子中磷的含量便可以基本确定核酸的含量。
进而求出摩尔磷消光系数ε（P）来表示溶液中的核酸含量：ε(P)=A260nm/CL注：A260nm：为260nm处光吸收值；C：为每升溶液中磷的摩尔数；L：为比色杯内径由于C=每升溶液的重量（W）/30.98，所以ε(P)=30.98×A260nm/WL天然DNA的ε（P）为～6600；RNA的ε（P）为7700～7800。
磷在DNA中占9.9%，在RNA中占9.5%。
1μg/mlDNA溶液的光吸收值为0.020，1μg/mlRNA溶液的光吸收值为0.022。
因此在260nm 处测的未知样的光吸收值即可求出其含量。
通常以A值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA，或40μg/ml单链DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸计算。
这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。
三.仪器使用：752型紫外可见分光光度计：在指定波长下，将机器预热20min，以参比液作空白，开盖调节透光率T值为0%；盖盖调节透光率T值为100%，转换功能键至A后，测定样品光吸收值。
实验七紫外分光光度法测定核酸含量(精)
实验目的 1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。
2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。
实验原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。
RNA和DNA的紫外吸收峰为260nm。
一般在260 nm波长下，每毫升含1mg DNA溶液的光吸收值约为0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值为0.022。
故测定待测浓度RNA或DNA溶液260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。
此法操作简便，迅速。
若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事先除去。
纯净的RNA 溶液，其A260/A280≥2；纯净的DNA溶液，其A260/A280≥1.8。
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～50mg/mL，在紫外分光光度计上直接测定。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。
通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值则在1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。
实验操作检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1．标准曲线的制作：取7只试管、2只取样器（分别为1mL和5mL），按照表7-1加样。
表7-1 标准曲线的制作试管 1 2 3 4 5 6 7 标准DNA溶液（mL） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（mL） 5 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4 A260 0 混匀后以1号试管为空白在260nm处测定光吸收值A，以标准DNA溶液的毫升数为横坐标、A为纵坐标在坐标纸上绘制出标准曲线，它是一条直线。
2．核酸最大紫外吸收波长（λｍ）的确定：以表7-1中的７号试管为测定对象，以1号试管为空白，在240～290nm范围内每隔10nm分别测定光吸收值A。
核酸含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解核酸含量测定的原理和方法。
2. 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的基本操作步骤。
3. 学会使用紫外分光光度计进行定量分析。
二、实验原理核酸是生物细胞中最重要的生物大分子之一，由核苷酸单体聚合而成。
核酸含量是衡量细胞活性、基因表达水平等重要生物学指标的重要参数。
紫外分光光度法是一种常用的核酸含量测定方法，其原理基于核酸分子中碱基的共轭双键系统对紫外光的吸收特性。
在紫外光照射下，核酸分子中的碱基会吸收特定波长的紫外光，产生荧光。
通过测定荧光强度，可以计算出核酸的浓度。
紫外分光光度法具有快速、简便、灵敏度高、重复性好等优点，广泛应用于生物学、医学、分子生物学等领域。
三、实验材料与仪器实验材料：1. 核酸样品2. 标准核酸溶液3. 0.1mol/L NaOH溶液4. 0.1mol/L HCl溶液5. 1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）6. 6mol/L Guanidine HCl溶液实验仪器：1. 紫外分光光度计2. 移液器3. 试管4. 烧杯5. 移液管6. 洗瓶四、实验步骤1. 样品制备：- 取一定量的核酸样品，用0.1mol/L NaOH溶液溶解，制备成一定浓度的核酸溶液。
- 将核酸溶液稀释至适当浓度，以便在紫外分光光度计的检测范围内。
2. 标准曲线制作：- 取标准核酸溶液，分别稀释成不同浓度，制备成标准系列。
- 在紫外分光光度计上，以6mol/L Guanidine HCl溶液为空白对照，测定标准系列在特定波长下的吸光度值。
- 以吸光度值为纵坐标，核酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：- 按照样品制备步骤，制备待测核酸溶液。
- 在紫外分光光度计上，以6mol/L Guanidine HCl溶液为空白对照，测定待测核酸溶液在特定波长下的吸光度值。
- 根据标准曲线，计算待测核酸溶液的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：- 标准曲线呈现良好的线性关系，相关系数R²大于0.99。
测核酸含量实验报告
1. 理解核酸含量测定的原理和方法。
2. 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的操作步骤。
3. 通过实验验证紫外分光光度法测定核酸含量的准确性。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，其含量直接影响细胞的生理功能。
核酸含量的测定对于研究基因表达、遗传变异等领域具有重要意义。
紫外分光光度法是测定核酸含量的常用方法，基于核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键体系，能够在紫外光区产生特征吸收峰。
实验原理如下：1. 核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基在紫外光区具有特征吸收峰，其最大吸收峰分别位于260nm和280nm。
2. 通过测定样品在260nm和280nm处的吸光度值，可以计算出核酸的浓度。
3. 根据核酸的纯度校正系数，对测定结果进行校正，得到准确的核酸含量。
三、实验器材1. 紫外分光光度计2. 核酸标准品3. 核酸样品4. 容量瓶（10ml、25ml、50ml）5. 移液器6. 烧杯7. 离心机8. 移液管9. 超纯水10. 标准试剂1. 标准曲线绘制（1）准确称取核酸标准品，用超纯水溶解，配制成不同浓度的标准溶液。
（2）分别将标准溶液在260nm和280nm波长下测定吸光度值。
（3）以浓度为横坐标，以260nm和280nm波长下的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品处理（1）准确称取核酸样品，用超纯水溶解。
（2）将样品在离心机中以3000r/min离心10分钟，取上清液。
（3）将上清液转移至容量瓶中，用超纯水定容至一定体积。
3. 样品测定（1）将标准溶液和样品溶液在260nm和280nm波长下测定吸光度值。
（2）根据标准曲线，计算样品在260nm和280nm波长下的核酸浓度。
（3）根据核酸纯度校正系数，对测定结果进行校正，得到准确的核酸含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制通过绘制标准曲线，可以看出在260nm和280nm波长下，核酸浓度与吸光度值呈线性关系。
2. 样品测定根据实验结果，样品在260nm和280nm波长下的核酸浓度分别为1.2mg/ml和0.8mg/ml。
核酸鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸鉴定实验的基本原理和方法。
2. 学习利用紫外分光光度法测定核酸的浓度和纯度。
3. 了解核酸提取和纯化的方法，以及核酸完整性的鉴定。
二、实验原理核酸是生物体内的重要生物大分子，包括DNA和RNA。
核酸的鉴定主要包括浓度/纯度鉴定和完整性鉴定。
1. 浓度/纯度鉴定：核酸中的碱基具有共轭双键，对紫外光有较强的吸收特性。
紫外分光光度法可以测定核酸在260nm和280nm处的吸光度，通过计算两者的比值（A260/A280）来判断核酸的纯度。
A260/A280比值接近1.8时，表示核酸纯度较高。
2. 完整性鉴定：核酸的完整性可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
DNA和RNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率与其分子大小有关，通过比较不同分子大小的核酸片段在凝胶中的迁移距离，可以判断核酸的完整性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 核酸样品- 标准DNA和RNA样品- 琼脂糖- Tris-HCl缓冲液- NaOH- 10×TBE缓冲液- 0.5×TBE缓冲液- 100bp DNA ladder- DNA marker- 电泳仪- 紫外分光光度计2. 实验仪器：- 离心机- 烧杯- 电子天平- 移液器- 玻璃棒- 琼脂糖凝胶电泳槽- 紫外透射仪四、实验方法1. 核酸浓度/纯度鉴定- 将核酸样品稀释至适当浓度。
- 使用紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm处的吸光度。
- 计算A260/A280比值，判断核酸纯度。
2. 核酸完整性鉴定- 配制琼脂糖凝胶电泳样品。
- 将样品和DNA marker加至琼脂糖凝胶孔中。
- 电泳。
- 使用紫外透射仪观察凝胶，记录核酸片段的迁移距离。
五、实验结果与分析1. 核酸浓度/纯度鉴定- 核酸样品的A260/A280比值约为1.8，说明核酸纯度较高。
2. 核酸完整性鉴定- 核酸片段在凝胶中的迁移距离与DNA marker的迁移距离相符，说明核酸完整性较好。
核酸测定实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸定量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法在核酸含量测定中的应用。
3. 学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定。
二、实验原理核酸是生物细胞中重要的生物大分子，由核苷酸单体聚合而成。
核酸的定量测定在生物学、医学等领域具有广泛的应用。
本实验采用紫外分光光度法测定核酸含量，其原理如下：1. 核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，能够吸收紫外光。
RNA和DNA的紫外吸收高峰在260 nm波长处。
2. 在一定浓度范围内，核酸的紫外吸收值与其浓度成正比。
3. 通过测定核酸溶液在260 nm波长处的吸光度，可以计算出核酸的浓度。
三、实验器材1. 紫外分光光度计2. 10 mm光程比色皿3. 移液器4. 移液管5. 超纯水6. 核酸标准品7. 核酸样品8. 容量瓶9. 试剂：NaOH、HCl、NaCl、EDTA等四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）准确称取一定量的核酸标准品，用超纯水溶解并定容至一定体积，配制成一系列不同浓度的核酸标准溶液。
（2）取核酸标准溶液适量，加入比色皿中，用紫外分光光度计在260 nm波长处测定吸光度。
（3）以核酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定（1）准确称取一定量的核酸样品，用超纯水溶解并定容至一定体积。
（2）取核酸样品适量，加入比色皿中，用紫外分光光度计在260 nm波长处测定吸光度。
（3）根据标准曲线，计算核酸样品的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制根据实验数据绘制标准曲线，如图所示。
从图中可以看出，核酸浓度与吸光度呈线性关系，相关系数R²为0.999。
2. 样品测定根据标准曲线，计算核酸样品的浓度为X mg/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免样品和试剂污染，确保实验结果的准确性。
2. 在绘制标准曲线时，应选择合适的浓度范围，以保证线性关系良好。
3. 实验过程中，应注意比色皿的清洗和干燥，避免吸光度值偏低或偏高。
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1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。
2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。
实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰为260nm。一般在260 nm波长下，每毫升含1mg DNA溶液的光吸收值约为0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值为0.022。故测定待测浓度RNA或DNA溶液260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事先除去。纯净的RNA溶液，其A260/A280≥2；纯净的DNA溶液，其A260/A280≥1.8。
计算
λ（nm）
240
250
260
270
280
290
A
λｍ
试管
1
2
3
4
5
6
7
8
A260
0
4． 将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁紫外分光光度计（尤其是比色槽内）、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。
以上操作请观看视频《紫外分应于标准DNA溶液的毫升数V
待测的DNA溶液的浓度（mg/mL）
由公式 V×100/5 计算
待测的DNA溶液的A260/A280
待测DNA溶液是否纯净？
表7-1 标准曲线的制作
试管
1
2
3
4
5
6
7
标准DNA溶液（mL）
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1
蒸馏水（mL）
5
4.9
4.8
4.6
4.4
4.2
4
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～50mg/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
3．样品测定：取一支试管，编号8，加入6mL左右待测的DNA溶液，仍以1号试管为空白，分别在260nm和280nm处测定其光吸收A，用A260在标准曲线上查出其对应于标准DNA溶液的毫升数V，由公式：
V*100/5
计算出待测DNA溶液的浓度（mg/mL）。再根据A260/A280的值来判断该待测的DNA样品是否纯净。
A260
0
混匀后以1号试管为空白在260nm处测定光吸收值A，以标准DNA溶液的毫升数为横坐标、A为纵坐标在坐标纸上绘制出标准曲线，它是一条直线。
2． 核酸最大紫外吸收波长（λｍ）的确定：以表7-1中的７号试管为测定对象，以1号试管为空白，在240～290nm范围内每隔10nm分别测定光吸收值A。注意，每次换了波长之后都需要用空白重新调校“0％T”和 “100％T”。以A为纵坐标、λ（nm）为横坐标作一条平滑曲线，找出最高峰处所对应的波长λｍ。
RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。
实验操作
检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1． 标准曲线的制作：取7只试管、2只取样器（分别为1mL和5mL），按照表7-1加样。