分子生物学操作方法
DNA的基本分子生物学操作汇总
Sanger测序法利用DNA聚合酶和四种不同脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）的特异性，通过分 别标记四种脱氧核糖核苷酸并在不同反应管中分别添加不同的荧光标记，实现DNA序列的逐一合成和检测。该方 法具有高准确性和高分辨率的特点，但测序长度有限制。
下一代测序技术
总结词
DNA的基本分子生物学 操作汇总
• DNA的提取 • DNA的限制性酶切 • DNA的连接 • DNA的转化 • DNA的克隆与表达 • DNA的测序与分析
01
DNA的提取
细胞裂解
机械法
通过机械方式破碎细胞壁，常用的方法有超声波 破碎和玻璃珠研磨等。
化学法
使用化学试剂如盐酸、氢氧化钠等改变细胞膜通 透性，使细胞内容物释放。
离心分离
利用离心机分离酶切产物。
纯化试剂盒
使用纯化试剂盒进行酶切 产物的纯化。
03
DNA的连接
连接酶的种类与特性
EcoRI
T7 DNA Ligase
识别GAATTC序列，切割后产生5'-突 出的粘性末端。
在DNA的5'到3'方向上催化DNA的连 接。
T4 DNA Ligase
能够连接两个DNA片段，形成磷酸二 酯键。
注意事项
感受态细胞的制备需要在无菌条件下进行，避免污染。
DNA的转化过程
转化过程
将制备好的感受态细胞与外源 DNA混合，通过离心、洗涤
和再悬浮等步骤，使外源 DNA进入感受态细胞。
转化效率
转化效率的高低与感受态细胞 的状态、外源DNA的浓度和
纯度等因素有关。
影响因素
转化条件如温度、pH、离子 浓度等也会影响转化效率。
分子生物学基本操作
琼脂糖凝胶电泳 和凝胶成像实验步骤
一、琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。 根据制备凝胶的材料:
琼脂糖电泳 凝胶 电泳
聚丙烯酰胺电泳
琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断； 聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。
1、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。
0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips
加样-使用合适的枪与枪头
比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips Fra bibliotek 不会有残留；
如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）；
与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头；
加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及 外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从 反应体系的管底吸上，反复吹打
多通道枪
混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀; 多数
分子操作在加样后、反应前都要充分混匀
一、枪混匀
二、旋涡混匀器
0.2ml管,0.5ml管15% 体积以下
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是一种研究生物体分子结构、功能和交互作用的实验方法。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常用技术，并以DNA提取和PCR扩增为例，详细描述了实验的具体步骤和操作。
分子生物学实验一般包括以下几个步骤：实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等。
实验前的准备包括实验设计、试剂的准备和设备的调试。
根据实验目的和问题，确定实验设计和具体操作步骤，选择适当的试剂和设备，并对实验条件进行优化。
生物样品的采集和处理是分子生物学实验的基础。
根据研究对象不同，可以采集细胞、组织、血液等生物样品，并进行预处理，如细胞培养、组织切片、离心等。
核酸提取是从生物样品中分离出核酸的步骤。
核酸提取可以使用化学方法或基于特定原理的商业试剂盒。
其中，常用的方法有酚/氯仿法、骨架蛋白法、磁珠法等。
酶切和电泳是分子生物学实验中常用的技术手段。
酶切是通过限制性内切酶对DNA进行特异性切割，生成特定大小的DNA片段。
电泳是利用电场对DNA片段进行分离和检测，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
PCR扩增是一种重要的分子生物学实验技术。
PCR通过不断循环的变性、退火和延伸过程，在体外扩增DNA序列。
PCR 需要DNA模板、引物、核苷酸和聚合酶等关键试剂。
PCR扩增过程包括初始变性、循环扩增和最终延伸。
扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和检测。
蛋白质表达是研究蛋白质功能和结构的重要实验手段。
常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。
表达载体经过构建和转染后，利用细胞的表达机制使蛋白质在体内合成。
总之，分子生物学实验是研究生物体分子结构和功能的重要方法。
通过实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等步骤，可以获得关于生物体分子结构和功能的有价值的信息。
分子生物学基本操作
琼脂糖凝胶电泳 和凝胶成像实验步骤
一、琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。 根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳
聚丙烯酰胺电泳
琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断； 聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。
1、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，把DNA样品 加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖 凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA 分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残 基，因此在电场中向正极移动。在外加电场作用 下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静，注意样品不能混样。
2、实验步骤
⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀， 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
⑵ 将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地 倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整 个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至 凝胶完全凝固。 ⑶ 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。将凝胶置 入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆 盖凝胶1-2mm。
0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips
加样-使用合适的枪与枪头
比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips 它 不会有残留； 如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）； 与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头； 加样体积应为枪头最大体积的20%-100%，低于该 范围的用小一号的枪头；大于该范围的可以用同 样的枪头加样两次（两次体积相当，比如加210ml, 可以用200ml枪头以105ml加两次）；
分子生物学的实验技巧
分子生物学的实验技巧分子生物学作为生物科学的重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其相互作用关系。
合理的实验技巧对于分子生物学的研究至关重要。
下面将介绍几种常用的实验技巧及其操作方法。
一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是分子生物学研究中最常用的技术之一，它能够高效地扩增目标DNA序列。
PCR反应的关键步骤包括：DNA变性（Denaturation）、引物结合（Annealing）和DNA合成（Elongation）。
实验中，我们需要准备好所需的试剂和设备，确保实验台和试管清洁，以避免污染。
同时，掌握好反应温度、时间和引物浓度等重要参数的选择，能够确保PCR反应的成功。
二、凝胶电泳技术凝胶电泳是常用的DNA分子大小分析方法，能够通过电场作用将DNA样品分离出来。
在实验中，我们首先需要准备好凝胶，常用的有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
然后，根据需要选择合适的电泳缓冲液，并将待测样品与DNA标记物一同加入凝胶槽中。
接下来，通过给电极施加电压，使DNA在凝胶中迁移。
最后，通过染色或荧光检测等方法，可可视化目标DNA条带。
当我们操作凝胶电泳时，要注意电流的选择、运行时间和电泳条件的控制，以确保分离结果的准确性。
三、蛋白质SDS-PAGE技术蛋白质的分离与鉴定也是分子生物学研究中的重要内容之一。
其中，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是最常用的方法之一。
在进行SDS-PAGE实验时，首先需要准备好聚丙烯酰胺凝胶，根据需要选择合适的凝胶浓度和电泳缓冲液。
接着，将蛋白样品与还原剂和SDS缓冲液混合，然后进行样品沸腾变性。
之后，将样品加载到凝胶孔中，施加电压进行电泳。
最后，可以通过染色或Western blot等方法对蛋白进行检测与分析。
四、基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它可用于构建重组DNA分子。
在进行基因克隆实验时，需要首先将目标基因进行PCR扩增，然后进行限制性内切酶切割，得到目标基因的载体和酶切后的DNA片段。
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl 或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM）分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。
（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。
（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。
（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。
（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。
每人负责六个月。
其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。
由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。
二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。
2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。
注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。
在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。
6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。
注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG 1 M 0.05-0.6 mM五、基因扩增1．引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成（jinan@）。
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分子生物学操作方法
一、所需试剂和器材
1、Trizol细胞裂解液
2、氯仿
3、异丙醇
4、75%乙醇（用无水乙醇和DEPC水配制），常用20~30ml分装一小瓶。
5、DEPC（1：1000稀释使用，注意：有毒）
6、匀浆器
7、滤纸
RT试剂盒―Fermentas
RNA提取好后要测浓度，调整为2ug
测RNA浓度的方法：5ul稀释20倍测，做RT只用2ugRNA，注意换算成ul，RT之后将变成的所有cDNA作为模板，然后加入引物进行特定目的条带的扩增。
PCR方法中一般反应体系为25ul
⑴模板——RT产物（1～3ul进行扩增）
⑵引物——交给公司合成
⑶PCR试剂盒——Fermentas
如果构建的话要换用高保真的酶。
二、注意事项
* 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA 的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
* 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
* 在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA 酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
三、RNA抽提
1、取50-100mg组织（新鲜或－70°C及液氮中保存的组织均可）置
1.5ml匀浆器中，加入1mlTRIzol充分混匀，冰上静置5min。
2、4C°，12000转离心15min，取上清。
3、将水相中约70%的量转移至另一干净EP管（宁少勿多）。
4、加500ul 异丙醇20～30度，静置10min。
5、4C°12000转，离心10min。
6、弃上清，加1ml 75%乙醇（250ul 水＋750ul无水乙醇），漩涡振荡3～5sec。
7、室温7500转5min。
8、仔细吸除乙醇，室温EP管敞口放置2～5min。
9、加20ul DEPC 处理过的水重新溶解RNA, 可保存在液氮或低温冰箱。
10、分光光度计定量，OD260/OD280比值应为2.0，比值较低说明有残
余蛋白质，比值过高说明RNA有降解；计算公式：[总RNA ug/ml]=40ug/ml×OD260×稀释倍数(n)
四、逆转录
*以Fermentas逆转录试剂盒为例，反应体系为20ul
1、将下列反应混合物加入EP管中，置于冰上
无核酸酶的去离子水（DEPC水）
总RNA 0.5ug/ul
Oligo(dT) 1ul
混匀，短暂离心
2、将反应液置于70 C°、5min 冰上1min短暂离心
3、按顺序加入
混合均匀、短暂离心。
4、将混合物置于37 C°5min 冰上1min短暂离心。
5、加入M-Mulv逆转录酶1ul。
6、将混合物置于42 C°、60分钟。
7、70 C°加热10 min, 中止上述反应，置于冰上。
五、PCR
（一）试剂：
1.第一链cDNA
2.上下游引物
3. dNTPmix(各2mmol/L)
4. 10×PCR buffer
5.Taq酶（2U/ul）
6.内参照上下游引物，如GAPDH的特异性引物
7. ddH2O
（二）操作步骤
1.取0.15ml PCR管，依次加入下列试剂：
2.加入适量的ddH2O，使总体积达到50ul。
轻轻混匀，离心。
3.设定PCR程序：在适当的温度参数(退火Ta=4(G+C)+2(A+T)-5）下扩增28～36个循环。
可在PCR扩增目的基因时，加入内参照上下游引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
4.取出后4℃5min后,－20℃保存或走电泳。
六、电泳鉴定
1.配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml。
2.琼脂糖凝胶（浓度2%；100ml 0.5×TBE加2g琼脂糖）微波炉中火2分钟溶解。
3.冷却至60℃加入Goldview(禁用EB) 2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）。
4.放入梳子，浇板，待凝固。
5.加8μl PCR反应产物+ 2μl上样缓冲液。
6.电泳50～80V（每㎝5V）。
7.紫外灯下观察结果，并采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。