分子生物学常用技术-基因操作

凝胶电泳法：
BIO－RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统
ImageQuant RT ECL 凝胶成像系统
核酸的贮存——DNA保存
1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于1×TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反 应，PH低于7.0时DNA容易变性。
特点：操作简单、成本低、产量高、 纯度好.
SDS, 碱
碱 中和
质粒提取的主要方法
• 煮沸裂解法
原理：
加热可使蛋白质和染色体DNA变 性，但环状质粒DNA结构紧密而 不会解链，温度下降后，质粒 DNA又重新恢复超螺旋结构。通 过离心去除变性的蛋白质和染色 体DNA，回收上清液中质粒DNA。
特点：煮沸裂解法比较剧烈，只用 于提取小质粒。对于会释放出大 量糖类的菌株(HB101)不适宜.
主要内容
一、常用分子生物学技术： • 质粒DNA的提取 • 基因组DNA/RNA的提取 • 核酸的纯化、分离及定量 • 聚合酶链式反应（PCR） • DNA序列分析 • 核酸杂交技术 二、其他分子生物学技术：
主要技术
质粒DNA提取
DNA/RNA的提取
纯化、分离及定量
限制性酶切技术
DNA合成 聚合酶链式反应（PCR）
Triton-溶菌酶法
质粒DNA提取方法的选择
• 常用的碱裂解法,煮沸法，SDS法均可 获得较满意效果．至于有人采用碱裂解 法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸 法或SDS法进行质粒DNA的大量分离， 只 是各个实验室的习惯问题.
质粒提取的主要方法
• 碱裂解法：
原理：基于染色体DNA与质粒DNA的 变性与复性的差异而达到分离目 的.细菌在强碱性环境中裂解， 蛋白质变性，染色体DNA被蛋白 质包裹缠绕，质粒DNA被释放出 来。
• RNA可溶于DEPC水（焦碳酸二乙酯）中，在-70℃保存。 • RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-
20℃保存。ห้องสมุดไป่ตู้
分子生物学技术
第二节 质粒DNA的提取
Plasmid DNA Preparation
• 质粒的基本概念 • 质粒提取的原理和方法 • 质粒的纯化
质粒DNA的提取
1 保证核酸一级结构的完整性； （pH 4～10；0 ～4℃;机械剪力；核酸酶等）
2 尽量排除其他分子的污染,保证提取核酸的纯度;
1)其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应 降低到最低程度； 2)核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的
有机溶剂和过高浓度的金属离子； 3)其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
质
粒
标记基因
结
构
图
抗性基因
多克隆位点 启始复制子
质粒DNA的提取和纯化
• 质粒的分离与提取则是最常用、最基本的 实验技术． 1、细菌的培养
• 主要步骤： 2、细菌的收集与裂解 3、分离纯化
质粒提取的主要方法
质粒DNA的小量制备
2-5ml
质粒DNA的大量制备
500ml
碱裂解法
方法
煮沸法
SDS裂解法
• 质粒：质粒是染色体以外能自身独立复制的超 螺旋共价闭环双链DNA分子。
• 能自主复制，是能独立复制的复制子。 • 质粒能携带外源基因进入细菌中扩增或表达.是
基因工程中广泛应用的基因运载工具. • 常见质粒载体
pUC： pUC 119， pUC 118， pUC 18, pUC 19，T—载体 pBR：322，327
3 EB荧光分析法
荧光染料溴化乙锭(EB)，可嵌入到碱基平面， 而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于半定量分析。
完整性鉴定
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢， 如果发生降解，可出现电泳图谱脱 尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量， 提示是否存在RNA降解；如加样槽 中存在条带，可能是DNA污染。
浓度：
DNA双链:
1 OD ~
DNA单链或RNA: 1 OD ~
寡核苷算单链: 1 OD ~
纯度：
A260/280之比应在1.80
50 µg 40 µg 33 µg
只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
NanoDrop ND-1000 spectrophotometer.
2. 荧光光度法 NanoDrop® ND-3300 Fluorospectrometer
抽提 有机抽提法
纯化DNA
鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
1、荧光光度法
2、紫外分光光度法
DNA OD260/280=1.8 RNA OD260/280=2.0
浓度与纯度鉴定
1 紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。
如计算DNA浓度：
A260×稀释倍数×50＝ μg/ml
2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效 防止细菌和核酸的污染。
核酸的贮存——RNA保存
• Rnase InhibitorRNA酶抑制剂Human Placental ribonuclease inhibitor（HPRI）是一种蛋白质，可与多种 RNA酶（包括RNases A, B, C类）非共价结合成为等摩尔复 合物，抑制RNA酶活性。
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
• 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 • 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂
（如乙醇、异丙醇等） • 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
细胞
Bacterial Cells Or tissue culture cells Or blood Or flies………..
酶切片段
DNA序列分析
探针标记 分子杂交技术 生物信息学
分子生物学技术
第一节 核酸的提取与鉴定概述
核酸分子抽提的技术路线的设计
1、核酸的释放：
破裂细胞
释放核酸
机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法）
2、核酸的分离与纯化：
• 将含有核酸分子从复杂复合物或他物质分离中
分离
提取DNA总的原则
基因操作（Gene manipulation）
分子生物学常用技术
The Popular Technology in Molecular Biology
分子生物学研究目标——生物大分子
DNA RNA 蛋白质
操作对象：
DNA
核酸
制备
RNA
分析
蛋白质
操作
以核酸为主要对象来讲述
分子生物学技术
分离
分析
操作