微生物学实验1 口腔微生物染色观察与显微镜油镜使用细菌革兰氏染色剖析共36页
2实验二显微镜油镜的使用、细胞形态的观察及革兰氏染色
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当
目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器， 以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿， 更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的 香柏油；第二遍擦镜纸蘸上乙醇再擦镜头；第三遍再用干净 的擦镜纸擦去多余的乙醇。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的 蓝紫色；
然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复 合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
然后再用乙醇脱色处理。
（四）、革兰氏染色原理
由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状 结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩， 结晶紫—碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时 仍保持蓝紫色。
⑷ 初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为 宜）初染1--2分钟min，水洗。
⑸ 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
初染
媒染
脱色
复染
（三）革兰氏染色的操作方法
⑹ 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾 斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
?而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色红色
微生物学实验教程
微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色
G-细菌
G+细菌
革兰氏染色机理
G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联 度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而 明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝 隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内， 使其呈现紫色。 G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后， 肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙 醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，结 晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇 脱色后，细胞又呈无色。这时再经番红复染，就使G-细 菌染成红色，而G+细菌仍呈紫色。
实验材料
试剂：
蒸馏水； 石碳酸复红染液；香柏油；
二甲苯
光学显微镜、灭菌牙签、载玻片
实验方法
滴水 刮取牙垢 涂片 自然干燥 火焰固定
革兰氏染色或 复红染色1分钟 水洗 干燥
镜检（油镜）
口腔微生物染色操作步骤
实验结果
注意事项
1. 载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。
2. 取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢 即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂 片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱。 3. 自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为 宜）。 4. 染色过程中勿使染色液干涸。
实验目的
实验原理
微生物学实验-1
实验材料
实验方法 实验结果 注意事项 实验报告
实验一 细菌的革兰氏染色
思考题
实验目的
1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌 分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步 熟练光学显微镜油镜的使用技术。
实验原理
革兰氏染色法（Gram staining） 是微生物学中常用的一种染 色方法，该染色法由丹麦医 生（Christian Gram）于1884 年创立，故名。
《食品微生物学》实验一细菌的革兰氏染色及其形态观察简介
《食品微生物学》实验一细菌的革兰氏染色及其形态观察简介一、实验目的（教师讲解）通过该实验的学习，要求掌握革兰氏染色的原理和相关操作技术。
二、实验原理（教师讲解、提问学生）革兰氏染色是细菌学最重要的鉴别染色法。
由于细菌细胞壁的结构和化学组成不同，经革兰氏染色而呈现不同的染色反应，可将所有细菌分成两大类:G+菌和G_菌。
革兰氏染色的主要步骤是先用结晶紫初染，再用碘液媒染，经95%乙醇脱色，最后用番红复染。
在此过程中乙醇脱色是关键步骤，为什么呢？因为对于G+菌，由于乙醇的脱水作用使细胞壁肽聚糖的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经番红复染后细胞仍保留初染剂的蓝紫色。
而 G_菌则不同，由于乙醇的脱脂作用，细胞壁的细胞壁通透性增大，结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱而变成无色，经番红复染后而被染上复染剂番红的红色。
三、实验菌种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌活跃生长期的幼龄培养物。
注意：老龄培养物或细胞壁破损会出现假性反应。
四、实验步骤（教师示范、学生完成）涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染(1min)→水洗→碘液媒染(1min)→水洗→95%乙醇脱色(30s)→水洗→番红复染(1min)→水洗→滤纸吸干→镜检1、涂片准备工作：点燃酒精灯，从玻片缸里取一枚载玻片，在火焰上烧去残留酒精后，在上面用记号笔画两个半径为1厘米的圆作为涂片区的标记，再将载玻片翻转到另一面，在左下角和右下角分别编号1、2，在编号1的圆上滴一滴生理盐水。
2、涂片（无菌操作技术）（1）灼烧接种环；（2）拔去试管塞；（3）烘烤试管口； （4）接种环通过火焰进入试管，并在试管壁上冷却30s，挑取少量菌体；（5）再烘烤试管口；（6）将试管塞塞好；（7）在编号1处涂片，将接种环上残留菌体涂至编号2；（8）烧去残留菌体注：为了加快干燥，可将接种环上残留菌体涂至编号2。
涂片时要注意涂抹均匀，不宜过厚，以淡淡的乳白色为宜。
若涂片过厚，脱色效果不好，可能会将G-菌脱色不好而呈紫色，而呈假G+菌。
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色共38页
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使染色观察与显微镜油镜的
使用;细菌的革兰氏染色
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
微生物实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
☞油镜的使用
① 照明系统：光源和聚光器
② 光学放大系统：物镜和目镜
是显微镜的主体； 可消除球差和色差； 都由复杂的透镜组构成。
③ 机械装置
用于固定材料和观察方便。
油镜使用的原理
一、什么是油镜？ • 在载玻片和物镜之间滴加香柏油 二、使用油镜的目的是什么？ 1、增加了显微镜的放大倍数 2、增加了显微镜的分辨率 3、增加了显微镜的照明亮度
微生物实验须知
• 认真预习、带实验指导书、教科书、实验工具、穿 好白大褂 • 提前10分钟到实验室，做好准备 • 不乱动菌种、试剂、仪器等设备，以免发生危险 • 认真听课；做好实验记录 • 实验完毕后整理仪器试剂及卫生工作 • 洗手 • 值日生：3人一组，共13次
实验成绩
1、平时50分： • 实验课情况25分 • 实验报告等25分
4. 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单 手拿，更不可倾斜拿。
细菌的单染色法和口腔微生物的观察
水洗
细菌形态观察
思 考 题
P8（1）使用油镜时，为什么必须用镜头油？
P18（1）
Thank you for your attention!
实验一
显微镜油镜的使用 和细菌的单染色法
目的要求
• 学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护
的基本知识
• 使用油镜观察细菌的形态
• 掌握无菌操作、细菌的涂片、单染色技术
实验材料
菌种：培养12-18h的枯草杆菌（B.subtilis)； 口腔细菌
显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等
细菌玻片、接种环、酒精灯。 Nhomakorabea镜体各部复原
• 用后复原：观察完毕，上悬镜筒或下降载物台， 先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾 取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去 残留的二甲苯，后将镜体全部复原 • 镜体全部复原：将光源灯光调至最低后关闭，或 将反光镜垂直与镜座，将最低放大倍数的物镜 （或无镜头之空格）转至到工作位置，同时将载 物台降到最低位置，并下降聚光器。
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观察ppt课件
可与细胞中带正电的组分结合。如刚果红、酸性复红 等。
③脂溶性染料—如Sudan black。
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观 察
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干 染色1~2min 实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观
（7）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水洗去 涂片上的复红染色液。
（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。 （9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油
镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结果。
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观 察
革兰氏染色法
• 操作步骤
涂片——干燥——固定
结晶紫1min——水洗
微生物学实验
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观 察
实验要求
• 坚持课前预习 • 不迟到，不早退，更不能无故缺课； • 严格按正确规范实验方法进行实验，作好记录； • 保持实验室整洁 • 注意安全 • 事实求是地、独立地写好实验报告
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观 察
察
革兰氏染色法基本原理 • 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家
C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的 细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性 菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别 染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和 G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的 不同所决定的。
实验一、油镜的使用、细菌的革兰氏染色和细菌形态的观 察
油镜物镜的工作原理
• 使用油质作为玻片与接物镜之 间的介质——油浸系
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析共38页
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观
察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏
染色剖析
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
实验1微生物显微镜的使用细菌形态的观察和细菌的革兰氏染色共50页文档
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
实验1微生物显微镜的使用细菌形态的观 察和细菌的革兰氏染色
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
实验一_显微镜油镜的使用和革兰氏染色法
实验一显微镜油镜的使用和革兰氏染色法A.显微镜油镜的使用实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．用油镜观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。
操作步骤(一)观察前的准备1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。
坐正，练习用左眼观察。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。
转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。
观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。
再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。
不要移动装片位置，准备用油镜观察。
(四)油镜观察1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。
2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。
如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。
仔细观察并绘图。
口腔生物学实验教程
龈沟或牙周袋的龈下菌斑采集法
第一节 口腔微生物学实验
人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版
刚果红负性染色方法：
载玻片一端 滴一滴2%刚 果红染液
加入待见 样本混合 后推片
置浓盐酸 上熏至变 红色
推片置 显微镜 下观察
Listgarten的分类标准：
球菌：菌细胞直径0.5μm～1.0μm，包括少量球杆菌； 直杆菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长1.0μm～1.9μm，包括部分
分支杆菌； 丝状菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长与宽之比大于6∶1，菌细胞
多为不规则的长丝状杆菌； 梭状菌：菌细胞直径0.3μm～1.0μm，长约10μm，其末端呈梭状
； 弯曲杆菌：菌细胞呈新月形或弯曲状； 螺旋体：菌细胞宽0.2μm～0.5μm，长约10μm～20μm，螺旋形，
包括大、中、小三种螺旋体。
实验二 变异链球菌的分离和鉴定
实验目的和要求：
通过对菌落特点和菌细胞形态及革兰染色特征的观察，初步掌握菌 斑标本中变异链球菌的分离、培养和表型鉴定的主要程序和方法， 熟悉牙菌斑中常见细菌的菌落特点、菌细胞形态及革兰染色特点。
实验原理：
变异链球菌能发酵蔗糖等多种碳水化合物，而其他口腔链球菌不发 酵山梨醇和甘露醇；根据其菌落形态、染色特点及耐氧情况，以其 特殊的生化反应可以分离和鉴定变异链球菌。
可调式移液器、加样头，小试管，三角形推棒，接种环、酒精灯，载玻 片，无菌棉签，96孔反应板，EP管；口腔检查用口镜，镊子，检查盘， 无菌纱球，无菌探针和龈上锄形洁治器。
革兰染色试剂，系列生化基质和指示剂（包括甘露醇、山梨醇、菊糖、 精氨酸试剂、七叶苷水解试剂）。
变异链球菌ATCC25175悬液。
微生物实验一 微生物染色法和光学显微镜的使用
物
镜
介质折射率↑ → 数值孔径NA ↑ → 显微镜分辨率↑
染色性 镜下观察内容 个体形态 群体排列
二、细菌基本形态与特殊结构的观察
1.细菌的基本形态 • 球菌 • 杆菌 • 螺形菌 螺菌 弧菌
球菌
圆球形
个体形态
近似球形：肾形、矛头形等
形态
群体形态
双球菌：脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌 链球菌：溶血性链球菌、肺炎链球菌 葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 其他：四联球菌、八叠球菌
• 1.光学显微镜结构 • 2.显微镜油镜的识别 • 3.显微镜油镜的原理 • 4.镜下观察内容 • 5.显微镜油镜的使用方法 • 6.显微镜油镜的保护
油镜的识别：
• 刻有“100X”或“OIL”字样 • 有一圈白线作为标记 • 物镜上标有放大倍数、数值孔径（NA）、工 作距离、要求盖玻片的厚度
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细菌的特殊结构（标本）
• 芽胞：破伤风梭菌（负染色法）
三、细菌的涂片制作和革兰染色法
1、细菌的涂片制作
• 菌种：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌18-24h 脂斜面培养物 • 器材及试剂：载玻片、接种环、酒精 灯及无菌生理盐水、结晶紫、卢戈氏 碘液、95%乙醇、石炭酸复红。 • 方法： （1）.涂片 （2）.干燥 （3）.固定 营养琼
实验报告：
细菌的涂片制作和革兰染色法
要求：
1、实验报告纸 2、实验标题、目的、原理、材料、方法、 结果（个体、群体形态图）以及讨论（实验情况、 成功失败、原因分析、经验总结）。
细菌的特殊结构（标本）
• 鞭毛：变形杆菌（镀银染色法）
（3）芽孢： 某些细菌在其生长发育后期，在细胞内
形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极 强的休眠体，称为芽孢。
实验一 显微镜油镜的使用、细胞形态的观察及革兰氏染色
赣南医学院 病原生物学教研室
第一次实验
细菌的形态结构的观察 细菌涂片标本的制作及革
兰染色
实验目的
掌握油镜的使用方法及保养的基本知识 掌握细菌的三种基本形态和三种特殊结 构 掌握细菌学标本的制作和革兰染色法
实验内容
实验室规则 油镜的使用与保护 细菌的基本形态与特殊结构的观察 革兰染色法
油镜观察
复红 30s
3. G染色结果
细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；
作业
实验报告册P1-3。 绘图注意事项：
– 用红蓝蜡笔绘图。 – 注意菌体大小比例合适 – 标出菌体颜色，显示典型排列方式 – 特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置
The end,thank you!
二、油镜的使用与保护
普 通 光 学 显 微 镜 基 本 构 造
油镜头的识别： 物镜头的下缘， 一般刻有一白色 圈，标有油 100、 HI、oil等字样
二、油镜的使用与保护
油 镜 使 用 的 原 理
透镜
油n=1.515
空气n=1.0 玻璃n=1.52
二、油镜的使用与保护
放置好显微镜 调节光源 低倍镜观察 油镜观察 清洁和还原显微镜
球菌
杆菌——大肠杆菌
螺形菌——霍乱弧菌
芽孢
破伤风杆菌 示：芽孢
炭疽芽孢杆菌 示：芽孢
鞭毛
伤寒杆菌 示：鞭毛
荚膜
肺炎链球菌 示：荚膜
四、革兰染色法
1. 细菌涂片制作
涂片（均匀） 干燥 固定
2. 革兰染色
实验二显微镜油镜的使用、细胞形态的观察及革兰氏染色
2
二、实验原理
（一）普通光学显微镜
1.光学部分:接目镜 、 接物
镜 、 照明装置(聚光镜、 虹 彩光圈、反光镜等)。 它使检 视物放大,造成物象。
2.机械部分:镜座、镜臂、镜
筒、物镜转换器、载物台、载 物台转移器、粗调节器、细调 节器等部件。它起着支持、调 节、固定等作用。
编辑ppt
3
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涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
无菌操作
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（三）革兰氏染色的操作方法
（1）涂片：先在载玻片左右端各滴一滴生理盐水，分别挑 取大肠杆菌和白色葡萄球菌菌体于生理盐水中涂片（采用 三区涂片法：分别将上述2种菌液延伸至玻片中央，混匀 并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多， 涂片要均匀，不可过于浓厚。
根据公式D=0.61λ/n·Sinα/2 ，增大分母，使得D值减小，分辨
率增大。
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（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当
目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器， 以免压碎玻片或损伤镜面。
1、实验原理（p.29） 革兰氏染色法：细菌学中重要的鉴别染色法。 有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线
菌和真菌都呈革兰氏阳性反应； 弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都 呈现阴性反应。
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9
（四）、革兰氏染色原理
根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的 结构差异来达到染色的目的的。
微生物显微镜的使用细菌形态的观察和细菌的革兰氏染色
细菌的染色一、实验目的1、掌握细菌涂片标本的制备方法2、掌握细菌革兰染色发和抗酸染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰氏染色结果3、巩固显微镜油镜的使用和保护法4、学习无菌操作技术二、实验仪器和试剂仪器：显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯试剂：结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌液体培养液、牙垢、石炭酸复红、3％盐酸酒精、碱性美蓝染液、枯草芽孢杆菌、擦镜液三、实验原理：革兰染色法：萋－纳氏抗酸染色法：枯草芽孢杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，它包围在肽聚糖的外面，所以枯草芽孢杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。
萋－纳氏抗酸染色法是在加热条件下使枯草芽孢杆菌与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。
当再加碱性美蓝复染后，枯草芽孢杆菌芽孢仍然为红色，而细菌为蓝色。
四、实验步骤：革兰染色：1、涂片左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧，冷却后从试管中取菌液一滴,在洁净载玻片一端做一涂膜；取一牙签在牙齿上轻轻划动取少量牙垢，在该洁净载玻片的另一端做一涂膜。
2、干燥在空气中自然干燥。
3、固定用镊子夹住涂片一端，将两涂膜出分别在火焰上连续通过三次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜。
4、染色•结紫初染：滴加数滴结晶紫染液于细菌涂片上，染色1分钟，水洗；•卢戈氏碘液媒染：用卢戈氏碘液覆盖涂片1分钟，水洗；•95%的乙醇脱色：滴加95%的乙醇，轻轻摇动玻片进行脱色，直至流出的乙醇无紫色时，水洗；•蕃红复染：滴加蕃红染液复染2分钟以上，水洗，吸干镜检。
5、镜检载玻片上滴加一滴香柏油，放油镜下镜检;注意标本中细菌的形态、大小，排列和颜色。
萋－纳氏抗酸染色法：1、涂片、固定用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌液，涂于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。
2、染色•滴加石炭酸复红液于涂片上，用玻片夹住涂片微火加热，保持染液冒蒸汽约5分钟，切勿蒸发至干或使染液沸腾；•冷后，水冲洗；•以3％盐酸酒精脱色，至片上红色全部脱去为止；•水冲洗后，以碱性美蓝液复染1分钟，水洗，待干，镜检。
实验三 显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色
一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在 油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。
二、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘 液、95％乙醇、0.5%沙黄染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜 纸
直接用高倍镜或油镜观察？ 4、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如
何控制这一步？
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：：载玻片要洁净无油迹；滴生理 盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可 过于浓厚
（2）固定： 染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定
法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜， 温度过高会改变甚至破坏细胞形态。
（3）染色（先阅读p.31的注意事项）
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色 是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性 菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被 误染成阴性菌。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲 洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液 被稀释。
（4）镜检(p.24，用低倍、高倍、油镜 分别观察细菌)
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
（二）油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过 于密集的细菌，常常呈假阳性。