【农学课件】土壤蛋白酶测定
土壤酶活性的测定方法
土壤酶活性的测定方法土壤酶活性的测定方法主要包括测定土壤中的蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等多种酶活性，这些酶活性的测定可以反映土壤的微生物代谢能力和土壤质量。
本文将详细介绍几种常用的土壤酶活性测定方法。
一、酶活性测定方法的准备工作1. 样品处理：收集土壤样本后，将其放在4C冷藏保存，保持样品活性，避免酶的降解。
2. 取样：根据需要，从土壤样品中取出一定量的湿重或干重样品。
3. 土壤处理：依据实验要求，对土壤样品进行处理，如水分调整、添加营养物质等。
二、蔗糖酶活性测定方法蔗糖酶是一种常见的土壤酶，可反映土壤中的碳循环能力。
蔗糖酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤，去除杂质。
2. 准备培养基：其中包括蔗糖作为底物、缓冲液、指示剂等。
3. 加入适量的土壤样品和培养基到离心管中，混匀后，放置在恒温摇床上培养一定时间。
4. 培养结束后，通过离心将土壤颗粒沉淀到底部。
5. 取沉淀后的上清液，用酚酞指示剂进行比色检测，根据比色结果计算蔗糖酶活性。
三、脲酶活性测定方法脲酶是一种重要的土壤酶，参与土壤中尿素的分解过程。
脲酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，在10C恒温条件下接种脲酶底物，使底物完全被土壤降解。
2. 在一定时间后，通过添加草酸溶液阻止进一步反应，停止脲酶的活性。
3. 取样品，加入酚硫酸溶液，进行比色测定。
4. 根据比色结果计算脲酶活性。
四、过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可反映土壤的抗氧化能力。
过氧化氢酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤去除杂质。
2. 准备含过氧化氢底物和其他试剂的反应体系。
3. 将土壤样品加入反应体系中，充分混匀后，在一定时间内反应。
4. 在反应结束后，通过添加硫酸钠溶液停止反应，阻止进一步的化学反应。
5. 使用紫外分光光度计测定样品的吸光度，根据结果计算过氧化氢酶活性。
五、过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶是一类重要的土壤酶，在土壤中参与有机物降解和氧化还原反应。
最新相关土壤酶测定方法(综合)
土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法)实验试剂：1、pH7.6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液(三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。
2、2%酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠,加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液,沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml,继续沸水浴处理,直至完全溶解,用同样的缓冲液定容至100ml。
3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0.01mol/L的CaCl2溶液。
4、0.6mol/L乙酸铅溶液。
5、草酸钠—乙酸混合溶液:每1000ml0.26mol/L的草酸钠溶液含有240.7ml0.2mol/L的乙酸。
6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮,0.02g 抗坏血酸,溶于100ml无水乙醇。
7、0.2%KIO3溶液。
8、pH5.8乙酸—乙酸钠缓冲液:94 ml0.2mol/L乙酸钠与6ml0.2mol/L乙酸混合。
9、0.01%甘氨酸标准溶液:1g甘氨酸溶于1000ml水,再稀释10倍。
10、甲苯。
以上试剂均为分析纯。
实验仪器:基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管实验步骤1、标准曲线的绘制①分别吸取50 、100、150、200、250、300μl0.01%甘氨酸标准溶液,置于10 ml刻度试管中(浓度分别相当于NH2 0.107、0.213、0.320、0.426、0.533、0.639μg/ml),加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液②加入1.5ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min③取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值;以氨基氮(NH2)的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法
土壤酶活性及微生物测定土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂：酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。
静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。
测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。
磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。
土壤活性测定实验报告
一、实验目的1. 了解土壤活性的基本概念和测定方法。
2. 掌握土壤酶活性的测定原理和操作步骤。
3. 通过实验，了解土壤酶活性与土壤肥力的关系。
二、实验原理土壤活性是指土壤中微生物、植物、动物等生物体及其代谢产物的综合活性。
土壤酶活性是土壤活性的重要指标，可以反映土壤中生物体的代谢能力和土壤肥力状况。
本实验通过测定土壤酶活性，了解土壤活性水平。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、过氧化氢酶、磷酸酶、脲酶、蛋白酶、转化酶、脱氢酶等试剂。
2. 实验仪器：恒温水浴锅、pH计、分光光度计、滴定管、移液管、烧杯、试管等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集与处理采集不同类型土壤样品，过筛后，置于4℃冰箱中保存。
2. 土壤酶活性的测定（1）过氧化氢酶活性测定原理：过氧化氢酶催化过氧化氢分解，产生水和氧气。
通过测定氧气的产生量来计算过氧化氢酶活性。
操作步骤：①配制过氧化氢酶反应液：取一定量的土壤样品，加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀，置于4℃冰箱中保存。
②取一定量的过氧化氢酶反应液，加入一定量的过氧化氢，在恒温水浴锅中反应一段时间。
③用分光光度计测定反应液的吸光度，根据标准曲线计算过氧化氢酶活性。
（2）磷酸酶活性测定原理：磷酸酶催化磷酸苯二钠水解，产生酚和磷酸。
通过测定酚的产生量来计算磷酸酶活性。
操作步骤：①配制磷酸酶反应液：取一定量的土壤样品，加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀，置于4℃冰箱中保存。
②取一定量的磷酸酶反应液，加入一定量的磷酸苯二钠，在恒温水浴锅中反应一段时间。
③用分光光度计测定反应液的吸光度，根据标准曲线计算磷酸酶活性。
（3）脲酶活性测定原理：脲酶催化尿素水解，产生氨和二氧化碳。
通过测定氨的产生量来计算脲酶活性。
操作步骤：①配制脲酶反应液：取一定量的土壤样品，加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀，置于4℃冰箱中保存。
②取一定量的脲酶反应液，加入一定量的尿素，在恒温水浴锅中反应一段时间。
③用滴定法测定氨的产生量，根据标准曲线计算脲酶活性。
土壤酶的测定方法
参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法一、土壤蔗糖酶3，5- 二硝基水杨酸比色法：1、试剂的配制①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
③8%蔗糖溶液。
④甲苯。
⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真空干燥至恒重。
然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。
再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。
标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。
葡萄糖（毫克）=a×4式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4——换算成1g土的系数二、土壤淀粉酶3，5- 二硝基水杨酸比色法:1、试剂配制①1%淀粉。
土壤农化分析实验PPT优秀课件
起来比较方便，但它一般只适
用于湿润的土壤，不适用于很
采
干的上壤，同样也不适用于砂
集
土。另外普通土钻的缺点是容
土
易使土壤混杂。
壤
用普通土钻采取的土样，
样
分析结果往往比其他工具采取
品
的土样要低，特别是有机质、
的
有效养分等的分析结果较为明
工
显。因为用普通土钻取样，容
具
易损失一部分表层土样。由于
表层土较干，容易掉落，而表
样品风干后，应拣去动植物残体如根、茎、 叶、虫体等和石块、结核(石灰、铁、锰)。如果 石子过多，应当将拣出的石子称重，记下所占的 百分数。
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粉碎过筛
风干后的土样，倒入钢玻璃底的木盘上，用木 棍研细，使之全部通过2mm孔径的筛子。充分混匀 后用四分法分成两份，一份作为物理分析用．另一 份作为化学分析用。
x xxx
x 3x x
图 土壤采样点的方式
x代表采样点位置； 1.五点法；2. 棋盘法；3.
曲线法
No
Image 第一步
第二步
第三步
图 四分法取样步骤图 第一步 均匀铺平 第二步 划对角线分四份 第三步 去掉对角的一半
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试验田土样的采集
首先要求找到一个肥力比较均匀的土壤， 使试验中的各个“处理”尽可能地少受土壤不 均一性的干扰。肥料试验的目的是要明确推广 的范围，因此我们必须知道试验是布置在什么 性质的土壤上。在布置肥料试验时所采集的土 壤样品，通常只采表土。试验田的取样，不仅 在于了解土壤的一般肥力情况，而且希望了解 土壤肥力差异情况，这就要求采样单元的面积 不能太大。
③全量分析项目，样品需要磨细，以 使分解样品的反应能够完全和彻底；
土壤酶活性测定的实验步骤
土壤酶活性测定的实验步骤土壤酶的测定1．三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。
2．土样研磨精细后分袋装好。
土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5某2=29g。
一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）1．试剂配制：(1)0.3%过氧化氢溶液：①（1：10030%的H2O2和水）②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）③（1ml30%H2O2+99ml蒸馏水）(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）(3)0.1N 高锰酸钾溶液：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）2．操作步骤：2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色3．结果计算过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1NKMnO4的毫升数表示：M=（A－B）某T式中：A：空白消耗的0.1NKMnO4毫升数B：滤液消耗的0.1NKMnO4毫升数T：KMnO4滴定度的校正值备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。
此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用二、蔗糖酶（P278）滴定法1.试剂配制：(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）(2)甲苯(分析纯)(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液0.5ml磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)+9.5ml磷酸二氢钾（1/15M）磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)：23.88gNa2HPO4,，加H2O溶解，定容至100ml。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。
本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH 将PH调至，用水稀释定容至1000ml。
4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml 混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。
三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。
培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
1h内在分光光度计与578nm波长处比色。
（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。
标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。
土壤蛋白酶测定-ZQX
土壤蛋白酶测定（专用）吴金水Folin-Ciocalteu比色法测定—Sunny1 方法原理其基本原理是酪蛋白酸钠在蛋白酶作用下，水解为酪氨酸。
释放的数量和速率与酶活性之间存在线性关系。
2 主要仪器：离心管（100 ml），试管（25 ml），分光光度计，可调式恒温水浴锅，离心机。
3 试剂和材料3.1 Tris缓冲液[c（C14H11NO3）=50 mmol/L，pH 8.1]: 6.05 g三羟甲基氨基甲烷溶于700 ml去离子水，用稀HCl调节pH值至8.1，用去离子水稀释至1 L。
3.2 酪蛋白酸钠（2%）：10 g酪蛋白酸钠溶于50℃的去离子水，在搅拌下稀释至500 ml。
如果只有酪蛋白（干酪素），可用10 g酪蛋白溶于上述Tris缓冲液，用稀NaOH溶液调节pH至8.1，再用Tris缓冲液稀释至500 ml。
3.3 三氯乙酸（15%）：75 g三氯乙酸（TCA，C2HCl3O2）溶于300 ml去离子水，再稀释至500 ml。
3.4 NaOH-NaCO3溶液：50 g无水Na2CO3溶于60 ml 1 mol/L NaOH溶液，用去离子水稀释至1 L。
3.5 硫酸铜溶液（0.5%）：0.5 g CuSO4.5 H2O溶于少量去离子水。
稀释至100 ml。
3.6 酒石酸钾钠溶液（1%）：1 g酒石酸钾钠（C4H4KNaO6.4H2O）溶于少量去离子，稀释至100 ml。
3.7 碱性试剂：将上述NaOH-NaCO3溶液、0.5%硫酸铜溶液、1%酒石酸钾钠溶液按100:2:2（V）比例混合即可。
3.8 福林（Folin）试剂（33%）：167 ml Folin试剂用去离子水稀释至500 ml。
此稀释液不稳定，应在使用前配制并置4℃下存放。
3.9 酪氨酸标准溶液[p（C9H11NO3）=500 ug/ml]：50 mg酪氨酸（预先于105℃干燥至恒重）溶于Tris缓冲液，并定容至100 ml。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法土壤酶活性测定方法一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法1. 试剂配制（1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。
（2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超过7天）。
（3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O 溶于1000mL蒸馏水中。
（4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。
（5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。
（7）甲苯。
（8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。
然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄糖母液（10mg还原糖/ml）。
取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准葡萄糖液（1mg/ml）；2. 操作步骤（1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。
用蒸馏水补足至10mL。
加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。
最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
（2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
土壤酶活性的测定
土壤酶活性的测定1.土壤样品采集与制备取根际土壤为土壤样品，同时挖取根系周围0-20cm和20-40cm土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。
充分混匀后取样，用于土壤酶活性测定的土壤经风干后，过1mm筛，测定多酚氧化酶活性土样过0.25mm筛。
供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带回实验室，磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测土壤微生物种群、数量等。
2.土壤酶活性的测定方法2.1.土壤脲酶比色法测定多酚氧化酶、过氧化物酶活性采用邻苯三酚比色法测定；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法；碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法（2）测定操作步骤：称2g过1mm筛风干土，置于100mL三角瓶中，注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液，振荡(120次/分钟)20分钟。
随即加入3N硫酸5mL，稳定未分解的过氧化氢并终止反应。
用慢速型滤纸过滤瓶中的土壤悬浊液，吸取25nil滤液，用0.01N高锰敏钾滴定至淡粉红色终点。
结果计算：设滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为B滴定25而原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为A高锰酸钾滴定度的校正值为T=(A-B)×T/2等于20分钟土壤的过氧化氢酶活性(mL 0.lmol KMnO4/g)2.2.脲酶采用靛酚蓝比色法操作步骤：取2.5g风干土，置于50mL三角瓶中，加0.5mL甲苯，15min后加5mL 10%尿素液和10mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
过滤后取0.5mL滤液注入25mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000mL，则得1mL含0.1mg氮的标准液。
绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。
标线绘制：取稀释的标准液l、3、5、7、9、11、13mL，移于50rnl容量瓶中，然后加入蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酸钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。
用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。
（二）试剂1）1%精胶2）甲苯3）铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O 溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。
4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1 L （1mL含50μg NH3-N）。
（三）操作步骤（1）标准曲线绘制取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。
显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。
（2）土壤蛋白酶活性测定称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。
培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。
显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。
以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（μg）表示蛋白酶活性。
土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法分析意义：对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。
（一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
一种土壤蛋白酶测定方法的探究
一种土壤蛋白酶测定方法的探究摘要：蛋白酶测定常用方法是茚三酮比色法，然而普通的茚三酮比色法测定氨基酸浓度的灵敏性不高，稳定性不好，从而影响了测定土壤蛋白酶活性的准确度，因此，本研究在前人研究的基础上，进行了茚三酮试剂的活化，改进了茚三酮比色法，达到了以更高的精度测量蛋白酶活性的目的。
关键词：土壤酶蛋白酶活性变更茚三酮比色法土壤中存在着很多酶类，主要来源于动植物、微生物的细胞分泌物以及残体的分解物，它们是土壤的重要组成部分之一[1]。
而蛋白酶属于是土壤中基本都有的的酶类，蛋白酶可以将土壤中的各种蛋白质以及肽类等化合物水解使之变成氨基酸，因此土壤中蛋白酶的活性与土壤中氮素营养的转化状况有极其重要的关系，所以研究蛋白酶的测定方法十分有意义[2]。
测定土壤蛋白酶的方法有铜盐比色法、茚三酮比色法和三氯化铁滴定法，常用的基质有酪素、明胶等[3]。
本文使用酪素为基质，茚三酮比色法测定土壤蛋白酶活性。
使蛋白酶酶促蛋白质水解成为氨基酸，并与茚三酮反应形成蓝紫色的化合物，颜色的深浅与试液中氨基酸含量符合朗伯-比尔定律，呈正比，因此可通过测定试液的吸光度，求得试液的氨基酸含量（每克土壤中氨基氮毫克数），用此表示蛋白酶的活性。
本研究在加勒斯江法测量土壤中蛋白酶活性的基础上，重点对其中的茚三酮显色液的配制方法进行改进，以此来提高茚三酮比色法测量氨基酸的灵敏度和稳定性。
1实验方法1.1实验原理蛋白酶能够使蛋白质水解后得到肽，进一步水解就会生成氨基酸[4]，具体水解过程是蛋白质、蛋白朊、蛋白胨、多肽、二肽、氨基酸。
先准备好含有一定浓度的蛋白酶溶液，之后加入蛋白质，使它们反应一段时间，最后测量生成的氨基酸的含量，以此来测定蛋白酶的活性[5]。
比色法是测定土壤中蛋白酶活性的最常用方法[6]，蛋白质水解后产生氨基酸，令氨基酸与某些物质反应生成带颜色的络合物，比如说铜盐蓝色络合物或茚三酮等物质。
根据溶液测得吸光度值大小与氨基酸含量的关系，求得氨基酸量（每克土壤中氨基氮毫克数），用此表示蛋白酶的活性。
《蛋白酶的测定方法》课件
色谱法的注意事项
总结词
色谱柱的维护、流动相的选择
详细描述
色谱法测定蛋白酶时，需要关注色谱柱的维 护，保持其良好的分离效果。同时，要根据 实验需求选择合适的流动相，以获得准确的 蛋白酶分离和测定结果。
电泳法的注意事项
总结词
电泳参数的选择、染色剂的配制
详细描述
电泳法测定蛋白酶时，应选择适当的电泳参数，如电压、电流和电泳时间。同时，要关 注染色剂的配制和使用，以确保电泳结果的准确性和可重复性。
测定方法的操作简便性
比较不同测定方法的操作流程、所需试剂和 仪器等方面的简便程度。
测定方法的适用范围
比较不同测定方法的应用范围，例如适用于 何种类型的蛋白酶、何种样本类型等。
测定方法的成本
比较不同测定方法的实验成本，包括试剂、 仪器、人力和时间等方面的成本。
测定方法的选择
根据测定目的选择
根据实验目的选择适合的测定方法，例如若需要快速筛选蛋白酶，可 选择简便快速的测定方法。
设定温度和时间
设定适宜的反应温度和时间。
加入酶液和底物
将酶液和底物溶液混合，开始 反应。
结果测定
通过分光光度计等仪器测定反 应过程中的吸光度变化，计算
酶活力。
色谱法的操作流程
样品制备
将待测样本进行适当的处理和稀释。
柱层析分离
将处理后的样本通过色谱柱进行分离 。
洗脱和收集
用适当的溶剂对色谱柱上的组分进行 洗脱和收集。
蛋白酶的分类
总结词
根据作用方式和底物特异性，蛋白酶可分为多种类型，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。
详细描述
根据作用方式和底物特异性，蛋白酶可分为多种类型。例如，胃蛋白酶主要在胃液中发挥作用，能够分解蛋白质 成多肽；胰蛋白酶则主要在胰腺和小肠中发挥作用，能够分解蛋白质成氨基酸和较小肽段。此外，还有许多不同 类型的蛋白酶，如弹性蛋白酶、胶原蛋白酶等，分别具有不同的底物特异性和生理功能。
土壤水解酶测定方法
土壤酶测定方法——荧光微型板酶检测技术（microplatefluorimetric assay）（一）所测酶类：1.碳水化合物分解酶类（纤维素、淀粉、半纤维素）：①α-Glucosidase a-葡萄苷酶②β-Glucosidase b-葡萄苷酶（E.C.3.2.1.21）③β-Cellobiosidase β-纤维二糖苷酶④β-Xylosidase β-木糖苷酶（E.C.3.2.1.37）⑤N-Acetyl-glucosamidase 乙酰氨基葡萄糖苷酶（几丁质酶）（E.C.3.2.1.52）2.有机氮分解酶类（蛋白质、尿素）：⑥Aminopeptidases 氨肽基酶leucine-aminopeptidase（蛋白酶之一）（E.C.3.4.11.X）⑦Urease 尿酶3.有机磷分解酶类：⑧Phosphatase 磷酸酶（E.C.3.1.3.1 and 3.1.3.2）4.有机硫分解酶类：⑨Sulfatase 硫酸酯酶E.C.3.1.6.15.氧化还原酶类：⑩Peroxidase 过氧化物酶（加双氧水）⑪phenol oxidase 酚氧化酶（二）实验材料和药品：1. 500ml的烧杯10个2. 移液器3. 排枪（10-100ul, 30-300υL）4. 磁力搅拌器5. 96孔微型板（黒、白板）6. ｖ型槽7 .酶标仪标准底物：4-methylumbelliferone(MUB)7-amino-4- methylcoumarin(AMC)荧光底物:4-MUB-phosphate4-MUB-sulfate potassium salt4-MUB-β-D-glucoside4-MUB-β-D-cellobioside4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide4-MUB-β-D-xyloside4-MUB-α-D-glucosideL-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin非荧光底物：L-dopa（三）试剂准备1. 醋酸钠缓冲液2L8.003g无水醋酸钠溶液加水1L，用醋酸调pH到土壤pH，再定容到2L。
蛋白酶活性的测定方法及原理 PPT
A：样品平行试验的平均OD值 K：吸光常数 4：反应试剂的总体积 1 0：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数
思考题
蛋白酶有哪几类？ ①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨 基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。 ②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶 ③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶 ④按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的碱性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶
标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使 用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不 含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为 横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常 数K值，其K值应在95~100范围内。
影响酶活力的因素有哪些？ ①酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。 ②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。当
③温所度有对的酶酶活与力底的物影结响合：生在成适中宜间的产温物度后范，围即内使，再酶增促加反底应物速浓度度随，温中度间T升产it高物le而浓增度加也，不超会过增最加适，反酶应促温反度应，速酶度活也力不将会会增下加降。。