茶籽油DNA提取方法的比较

TE （ Tris － EDTA ） ， 颠倒混匀 5 min 后 13 000 r / min 室温离心 5 min 去上层油脂层； 将离心管中余下的 约 400 μL 水相溶液按照 Wizard Genomic DNA Purification Kit（ Promega） 说明书操作步骤提取 DNA； 在 沉淀 DNA 之前， 向离心管中加入 ≥1 μg 植物基因 组 DNA 作为担体， 并加入 600 μL 室温异丙醇， 颠倒 瑨 瑏
混匀 2 ～ 5 次后室温静置 45 ～ 60 min 沉淀 DNA； 沉 70% 乙醇洗涤并干燥后， 淀的 DNA 经离心、 加入 TE 溶液溶解 DNA， 置于 4 ℃ 保存备用。 1． 3． 2 改良 SDS 取 500 μL 制备好的水相 DNA 至 2 mL 离心管，
［11 ］
1
1． 1
材料与方法
［1 ］ 油” 。一些不法经营者将低价位的植物油掺入高
研究的关键是能否提取到高质量的油脂 DNA。 而 食用油脂中所含的 DNA 提取是否成功， 可以使用特 异引物和探针， 运用 DNA 扩增的高效性和敏感性，
［6 － 7 ］ 。 将目标 DNA 通过实时荧光 PCR 扩增来判断 ［7 ］ 覃文 采用实时荧光 PCR 的分子生物学方法检测
［10 ］
立 即 加 入 500 μL 提 取 液 Ⅰ （ 1 mol / L NaCl， 100 mmol / L Tris － HCl pH 8． 0 ， 100 mmol / L EDTA） 、 20 μL β － 巯基乙醇和 250 μL 20% SDS， 混匀， 于 65 ℃ 水浴中保温 20 ～ 30 min， 取出后立即置于冰 上， 并加入 120 μL 5 M KAc 于冰上反应 40 min， 于 4 ℃ 12 000 r / min 离心 20 min， 取上清液加入等体 － 20 ℃ 放置 1 h 后， 积的异丙醇， 于 4 ℃ 13 000 r / min 离心 20 min， 弃上清液， 用 50 μL TE 缓冲液溶解沉 淀， 并加入等体积的氯仿 － 异戊醇 （ 24∶ 1 ） 混匀， 于4 ℃ 8 000 r / min 离心 5 min 吸取上清液， 加入 0． 6 倍体 积的异丙醇和 0． 1 倍体积的 3 M NaCl， 于 － 20 ℃ 放 置 lh 后， 于 4 ℃ 13 000 r / min 离心 20 min 弃上清液， 用 70% 乙醇漂洗沉淀 2 ～ 3 次， 在通风橱中晾干后， 加 入 30 μL TE 缓 冲 液 溶 解 沉 淀， 同 时 加 入 2 μL 37 ℃ 水浴过夜， － 20 ℃ 冰箱待用。 RNaseA， 1． 3． 3 高盐低 pH 法 取 500 μL 制备好的水相至 2 mL 离心管， 迅速
［12 ］
tRNALeu 引物
引物 tRNALeu 由上海博尚生物技术有限公司
加入预 热 至 56 ℃ 的 500 μL 提 取 缓 冲 液 Ⅱ （ 200 mmol / L NaAc， 100 mmol / L EDTA， 1 mol / L NaCl， 5% 6% SDS， 2% β － 巯基乙醇， pH 5． 0 ） ， 可溶性 PVP， 12 000 r / min 离 于 56 ℃ 恒温振荡器温育 30 min 后， 心 10 min， 吸取上清液， 加入 2 /3 倍体积的 2． 5 mol / L KAc（ pH 4． 8 ） ， 4 ℃ 放置 15 min， 10 000 r / min 离 心 10 min 后， 吸上清液移入另一支离心管中， 加入 等体积酚 ∶ 氯 仿 ∶ 异 戊 醇 （ 25 ∶ 24 ∶ 1 ） 混 匀， 于4 ℃ 10 000 r / min 离心 10 min， 反复抽提一次， 上清液加 12 000 入等体积异丙醇： 置于 － 20 ℃ 冰箱 20 min， r / min 离心 15 min， 所得沉淀用 70% 乙醇洗两次， 待 残留的乙醇挥发后， 将 DNA 溶于 30 μL TE 缓冲液 37 ℃ 水 浴 过 夜， 中， 然 后 加 入 2 μL RNase 酶， － 20 ℃ 保存备用。 1． 3． 4 冷冻干燥法 取茶籽油 20 mL 于 50 mL 离心管中， 加 20 mL
［9 ］
我国食用植物油转基因标识管理的实施， 食用植物 油的核酸检测技术已成为目前必须攻克的技术难 题。而食用植物油的核酸检测技术在植物油原料成 分的鉴定、 掺假食用植物油及潲水油的鉴定领域的 研究也日显突出
［3 － 5 ］
。
以油脂为材料提取 DNA 进行分子生物学检测
收稿日期： 2011 － 10 － 20 基金项目： 湖南省自然科学基金资助项目（ 2012 待定） ； 湖南省教育 厅资助科研项目（ 11A007 ） 作者简介： 姚菲（ 1987 － ） ， 女， 在读硕士． 通讯作者： 吴苏喜（ 1965 － ） ， 男， 教授．
价位茶籽油中从而牟取暴利， 如在油茶籽油中掺入 大豆油、 菜籽油等。 植物油掺假多采用现代谱学分 析技术， 方法科学、 结果准确， 但仪器昂贵
［2 ］
特异性 Arah1 基因片段， 从而定性定量检测混合食 用油脂中的花生油成分。 岳巧云
［8 ］
采用实时荧光
。 随着
PCR 方法， 以大豆内源参照基因 lectin 为指标， 能够 对奶粉中掺入的大豆等植物成分进行快速准确地定 性、 定量分析。自 DNA 分析技术兴起后， 国内外油 脂 DNA 提取方法虽多但仍存在以下问题 ： ①各种提 取方法通用性不好， 在许多实验中存在扩增成功率 在物种和食品种类之间的差异； ② 对外源基因最佳 PCR 检 测 方 法 的 摸 索， 检验灵敏度和效率都不 高
+ 中图分类号： TS225． 1 6
文献标识码： A
文章编号： 1007 － 7561 （ 2012 ） 03 － 0017 － 03
Comparison of different methods for extracting DNA from camellia oil
YAO Fei， ZHOU Hui， WU Su － xi （ College of Chemistry and Bio － engineering， Changsha University of Science ＆ Technology， Changsha Hunan 410114 ） Abstract： A new method for extracting DNA from edible oil was established by comparing several methods， since DNA in edible oil had the feature of low content， short fragment and being seriously destroyed． The tRNALeu could be detected in the edible oil by the real － time PCR method． Results showed that the improved method could extract DNA in higher content and purity compared with common methods suggested in reports， which can be used as the PCR template to provide a simple and effective method for detecting nucleic acids substance in edible oil． Key words： camellia oil； extraction of DNA； real － time PCR 油茶籽是中国特有的一种木本带壳油料， 其脂 肪酸组成、 理化特性、 营养价值和生理功效等接近 “植物油皇后 ” — — —橄榄油， 具有预防心血管硬化、 降血压、 降血脂等作用， 在国际上被称为“东方橄榄
材料 纯茶籽油： 由长沙理工大学云影山上采摘来自百度文库油
茶籽， 经晒干、 去蒲、 脱壳、 烘干、 粉碎后经压榨浸提 精炼后的油茶籽油储存备用。 1． 2 1． 2． 1 主要仪器与试剂 试剂与仪器 CTAB 、 SDS、 NaOH、 Tris、 HCl、 EDTA、 B － 巯基乙 NaAc、 KAc、 醇、 可溶性 PVP、 醋酸铵、 苯酚、 氯仿、 异 70% 乙醇、 TE 异丙醇、 无水乙醇均为分析纯， 戊醇、 dNTPs、 Taq － DNA 聚合酶等试剂均 缓冲液、 琼脂糖、 购自上海鼎国生物工程技术服务有限公司 。 DNA 提 取 试 剂 盒： Wizard Magnetic 购 于 Promega 公司； DNA Purification： 购 于 上 海 鼎 国； GL － 21M 台式高速冷冻离心机： 长沙英泰仪器有限公司； 实时荧光 PCR 仪 （ ABIPRISMTM 7700 Sequence Detector， 美国 ABI 公司 ） ； 核酸蛋白分析仪 （ Beckman DU640 ） ； 移 液 枪 5 mL、 1 mL、 200 μL、 100 μL、 20 10 μL、 1 μL： 德国 Eppendorf 公司。 μL、 1． 2． 2 合成： 上 游 引 物 序 列 5 ＇ － CGAAATCGGTAGACGCTACG － 3＇， 下游引物序列 3 ＇ － TTCCATTGAGTCTCTGCACCT － 5＇， 探针序列 5＇－ GCAATCCTGAGCCAAATCC － 3＇。 1． 3 DNA 提取方法 水相 DNA 制备： 取 600 mL 食用油转入一个已 灭菌的 1 000 mL 的烧杯中， 再加入 100 mL 无菌双 蒸水， 充分混匀， 用磁力搅拌器在 4 ℃ 充分乳化 2 h， 4 ℃ 12 000 r / min 离心 3 min， 去除上层油脂层， 在 此向下层水溶液中加入 600 mL 食用油脂， 离心， 去 除上层油脂层， 反复五次。取水相保存在 4 ℃ 冰箱。 1． 3． 1 试剂盒方法 在 2 mL 离心管中加入 1 mL 茶籽油及 400 μL
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5 000 r / min 离心 30 min， 无菌水， 振荡 30 min， 小心 将水相转移到培养皿中， 将培养皿放于 － 80 ℃ 冷冻 过夜， 然后将培养皿转至真空干燥机中至水分完全 蒸发， 加 1 ～ 2 mL CTAB 提取缓冲液（ 1 000 mL 水中 Tris 12． 111 4 g， NaCl 81． 181 6 g， 溶解 CTAB 20 g， Na2 EDTA 7． 444 g， 65 ℃ 温 高压灭菌 ） 至培养皿中， 用 CTAB 提取缓冲液小心仔细地反复冲 浴 10 min，
。
本文以 纯 茶 籽 油 为 材 料， 拟验证比较食用油 DNA 5 种提取方法， 采用实时荧光 PCR 定性定量检 测 tRNALeu 基因， 并通过提取核酸的浓度和纯度比 瑏 瑧
油脂加工
较， 得到一种通用性好、 性价比高的食用油脂 DNA 提取方法， 以促进油脂 DNA 技术的推广。
粮油食品科技 第 20 卷 2012 年 第 3 期
粮油食品科技 第 20 卷 2012 年 第 3 期
油脂加工
茶籽油 DNA 提取方法的比较
姚 菲， 周 慧， 吴苏喜
（ 长沙理工大学 化学与生物工程学院 ， 湖南 长沙 410114 ） DNA 序列片段短、 要： 针对食用油脂中 DNA 含量极低、 破坏严重的特点， 通过实时荧光 PCR 法 检测植物的通用 tRNALeu， 对茶籽油 DNA 几种提取方法进行比较， 建立了食用油脂中 DNA 提取新 方法。结果证明： 较之于文献中常见植物油 DNA 几种提取方法， 用改进方法提取的 DNA 含量高、 摘 纯度高， 可以作为 PCR 反应的模板， 为食用油脂进行核酸类生物性检测提供了一种简捷有效的方 法。 关键词： 茶籽油； DNA 提取； 实时荧光 PCR