第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用.pptx
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《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用
须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜 同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所 有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。
预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要 含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低， 不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子 可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
一、分子用研究技术
目录
第一节 分子杂交与印迹技术
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
目录
引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
目录
PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+缓冲液
目录
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要 含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低， 不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子 可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
一、分子用研究技术
目录
第一节 分子杂交与印迹技术
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
目录
引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
目录
PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+缓冲液
目录
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
常用分子生物学技术的原理及其应用
产。
基因突变技术的最新进展
近年来，随着技术的发展，基因突变技术不断取得新 的突破和进展。
输标02入题
高通量突变筛选技术使得能够在短时间内对大量基因 进行突变和筛选，加速了基因功能研究和药物研发的 进程。
01
03
基因编辑技术的出现，如CRISPR-Cas9系统，使得能 够实现精准地编辑基因组，为基因治疗和生物育种等
01
02
03
04
基因突变技术在生物工程中广 泛应用于菌种改良、基因治疗
和生物制药等领域。
通过基因突变技术可以改良微 生物菌种的代谢途径，提高产
物的产量和品质。
在基因治疗中，基因突变技术 可用于纠正致病基因的缺陷， 治疗遗传性疾病和癌症等疾病
。
在生物制药中，基因突变技术 可用于产生具有特定性质的蛋 白质或酶，用于药物研发和生
常用分子生物学技术的原理及其应 用
目 录
• 基因克隆技术 • 基因表达技术 • 基因突变技术 • 蛋白质组学技术
01 基因克隆技术
基因克隆技术原理
基因克隆技术是通过将外源DNA片段插入到载体DNA中，然后将其转化到宿主细胞 中进行复制和表达，从而获得目的基因或基因片段的过程。
基因克隆的关键步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、DNA连接、转化 和筛选。
疾病治疗
基因表达技术可用于疾病 治疗，如基因疗法和基因 编辑等。
基因表达技术的最新进展
CRISPR-Cas9系统
这是一种新型的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9蛋白的引导，实现对特 定DNA序列的切割和编辑。
人工染色体
通过基因表达技术，可以人工构建染色体，实现生物体的染色体数目和结构的 改变。
领域带来了革命性的变革。
基因突变技术的最新进展
近年来，随着技术的发展，基因突变技术不断取得新 的突破和进展。
输标02入题
高通量突变筛选技术使得能够在短时间内对大量基因 进行突变和筛选，加速了基因功能研究和药物研发的 进程。
01
03
基因编辑技术的出现，如CRISPR-Cas9系统，使得能 够实现精准地编辑基因组，为基因治疗和生物育种等
01
02
03
04
基因突变技术在生物工程中广 泛应用于菌种改良、基因治疗
和生物制药等领域。
通过基因突变技术可以改良微 生物菌种的代谢途径，提高产
物的产量和品质。
在基因治疗中，基因突变技术 可用于纠正致病基因的缺陷， 治疗遗传性疾病和癌症等疾病
。
在生物制药中，基因突变技术 可用于产生具有特定性质的蛋 白质或酶，用于药物研发和生
常用分子生物学技术的原理及其应 用
目 录
• 基因克隆技术 • 基因表达技术 • 基因突变技术 • 蛋白质组学技术
01 基因克隆技术
基因克隆技术原理
基因克隆技术是通过将外源DNA片段插入到载体DNA中，然后将其转化到宿主细胞 中进行复制和表达，从而获得目的基因或基因片段的过程。
基因克隆的关键步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、DNA连接、转化 和筛选。
疾病治疗
基因表达技术可用于疾病 治疗，如基因疗法和基因 编辑等。
基因表达技术的最新进展
CRISPR-Cas9系统
这是一种新型的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9蛋白的引导，实现对特 定DNA序列的切割和编辑。
人工染色体
通过基因表达技术，可以人工构建染色体，实现生物体的染色体数目和结构的 改变。
领域带来了革命性的变革。
高中生物竞赛：常用分子生物学技术的原理及应用课件
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
（一）Southern blotting 1 2 M
内切酶
基因组DNA
重物
纸巾
10×SSC 转 移缓冲液
500g
支持物
9
（一）印迹(blotting)技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
原始文献出处：
Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
PCR方法被美国Science杂志评为1989年 的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被 评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
5 5
"for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies"
Kary B. Mullis
⑥根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建 立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体， 在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。
（一）Southern blotting 1 2 M
内切酶
基因组DNA
重物
纸巾
10×SSC 转 移缓冲液
500g
支持物
9
（一）印迹(blotting)技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
原始文献出处：
Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.
PCR方法被美国Science杂志评为1989年 的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被 评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。
一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
5 5
"for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies"
Kary B. Mullis
⑥根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建 立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体， 在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。
第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、基本工作原理
•Template • 5 DNA
•5
• 5
•Cycle 1
•Primer 1 •5 •Primer 2
•5 • 5
•5 •5
•Cycle 2
•5 • 5
•5
• 5
•5
• 5
•5 •5
•目 录
•5 • 5
• 5 • 5
•Cycle 3
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•第 八 节
•蛋白质相互作用研究技术
•Research Technology of Interaction of Protein
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•蛋白质之间相互作用研究的重要性
• 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而 形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主 要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括 DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、 信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间 的相互作用。
•生 物 芯 片 技 术
•Biological Chip Technology
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip)
•cDNA芯片(cDNA chip)
• 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片
段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
三、几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
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生化21 常用分子生物学技术的原理及应用_PPT课件
Southern印迹杂交（Southern blotting）是 指DNA与DNA分子之间的杂交。其基本过程 是将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性 后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支 持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。
内切酶
1 2M
基因组DNA
重物
纸巾
10×SSC 转 移缓冲液
描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。
该系统的建立是基于对酵母转录因子Gal4分子
的研究。
DNA结合结构域(BD)
N端
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD)
C端
(activation domain)
这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两 者通过共价或非共价键连接建立起来的空 间结构方可表现出一个完整的激活特定基 因表达的激活因子的功能。
一、转基因技术
是指将外源基因整合到动物细胞或 植物细胞的基因组中并使外源基因在动 物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的 技术。 基因的导入方式主要：
显微注射法 胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法
二、核转移技术
即体细胞克隆技术，是用显微操作、 电融合等方法将动物体细胞的细胞核 全部导入另一个个体的去除细胞核的 卵细胞内，使之发育成为个体。
三、PCR技术的主要用途
（二）基因的体外定点突变 （三）基因突变分析 （四） DNA和RNA的微量分析 （五） DNA序列测定
DNA链末端合成终止法
(Sanger双脱氧链终止法)
O O O 5′ HO P O P O P O CH2
A, C, G or T
OH OH OH
内切酶
1 2M
基因组DNA
重物
纸巾
10×SSC 转 移缓冲液
描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。
该系统的建立是基于对酵母转录因子Gal4分子
的研究。
DNA结合结构域(BD)
N端
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD)
C端
(activation domain)
这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存在时没有转录激活的功能，只有两 者通过共价或非共价键连接建立起来的空 间结构方可表现出一个完整的激活特定基 因表达的激活因子的功能。
一、转基因技术
是指将外源基因整合到动物细胞或 植物细胞的基因组中并使外源基因在动 物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的 技术。 基因的导入方式主要：
显微注射法 胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法
二、核转移技术
即体细胞克隆技术，是用显微操作、 电融合等方法将动物体细胞的细胞核 全部导入另一个个体的去除细胞核的 卵细胞内，使之发育成为个体。
三、PCR技术的主要用途
（二）基因的体外定点突变 （三）基因突变分析 （四） DNA和RNA的微量分析 （五） DNA序列测定
DNA链末端合成终止法
(Sanger双脱氧链终止法)
O O O 5′ HO P O P O P O CH2
A, C, G or T
OH OH OH
分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用
（三）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的 基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
T G C
（四）DNA序列测定
将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工 作大为简化，也提高了测序的速度；
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进 行序列测定，也可直接测定。
（五）基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
▪ 分子杂交： 不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成
杂种双链的过程。
▪ 分子杂交的目的： 检测DNA和RNA
▪ 探针： 分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的
核苷酸链。
待测DNA或RNA
探针
碱基对间氢键
增色效应： DNA变性伴随260nm吸收值增高
减色效应： DNA复性伴随260nm吸收值降低
Taq
5’
Taq
5’
R
R
R Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
1. Strand Displacement
3’
5’
2. Cleavage
3’
5’ 3. Polymerization
3’
Complete
4. Detection
5’ 3’
PCR衍生技术
▪ 反向PCR ▪ 逆转录PCR ▪ 原位PCR ▪ 重组PCR ▪ 不对称PCR ▪ 多重PCR
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激 活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子
DNA结合结构域 转录激活结构域
BD
AD
组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响
分子生物学-分子生物学技术的原理及其应用
遗传变异与进化
研究基因组的突变、遗传变异和物种进化过程。
生物工程与基因治疗
应用分子生物学技术进行
2
将目标基因插入携带载体中，实现基因
的复制和传递。
3
PCR技术
通过反复复制DNA片段，快速扩增目标 DNA序列。
基因测序技术
通过测定DNA碱基序列，获得基因组的 信息。
未来发展趋势和前景
分子生物学技术的不断发展将为医学、农业、环境等领域带来更多应用，推动科学研究和社会发展。
分子生物学-分子生物学 技术的原理及其应用
分子生物学的定义
分子生物学是研究生物体的分子基础和机制的科学，涉及生命的DNA、RNA和蛋白质等分子的结构、功能和 相互作用。
分子生物学的研究领域
基因结构与表达
研究基因的结构、转录过程和蛋白质合成调控 机制。
信号转导与细胞通讯
研究细胞内信号传递、细胞通讯和细胞命运决 定。
分子生物学技术的应用
生物工程
利用基因工程技术改良农作物、制造药物等。
功能基因研究
研究基因在生物体内的功能和作用机制。
基因改良
改良农作物和家畜，提高产量和品质。
医学诊断
通过基因检测诊断疾病，提供个性化医疗方案。
基因治疗
通过修复异常基因或引入正常基因来治疗遗传 性疾病。
检验食品安全
利用基因检测技术检测食品中的有害成分。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术是一系列用于分析和操作分子生物学层面的实验技术。
这些技术基于对核酸（DNA和RNA）和蛋白质的结构和功能的研究，以及对基因表达和调控机制的理解。
在本文中，我将介绍常用分子生物学技术的原理和应用。
1.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种能够从极少量的DNA样本中扩增特定DNA序列的技术。
它基于DNA的两条链之间的互补配对，使用DNA聚合酶酶和引物来在离子和温度周期变化的条件下进行。
PCR技术广泛应用于分子生物学和生物医学研究中，包括基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定以及病原体的检测等。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA，RNA和蛋白质的常用技术。
其中，聚丙烯酰胺（或琼脂糖）是一种高分子量聚合物，能够形成孔隙凝胶。
在电场的作用下，DNA，RNA或蛋白质在凝胶中迁移，根据大小和电荷的差异进行分离。
凝胶电泳广泛用于DNA和RNA的分离和纯化，以及蛋白质的分析和鉴定。
3.DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的技术。
它通过测量DNA片段中的碱基顺序来分析DNA的序列信息。
目前有多种DNA测序技术，包括链终止测序（Sanger测序）和高通量测序（如Illumina测序和Ion Torrent测序）。
DNA测序在基因组学、遗传学和基因诊断中起着重要的作用。
4.基因克隆技术：基因克隆是指将目标基因从其源DNA中扩增，并将其插入到载体DNA 中，然后转化到宿主细胞中。
利用基因工程技术，克隆的基因可以在宿主细胞中被表达。
这种技术被广泛应用于重组蛋白质的定制表达、转基因生物的制备以及基因治疗的研究中。
5. 蛋白质电泳和Western blot：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
与DNA电泳类似，蛋白质电泳通过在聚丙烯酰胺凝胶中迁移蛋白质来分离不同大小和电荷的蛋白质。
Western blot是一种检测目标蛋白质的特异性抗体的技术，通过将蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合来检测和定量蛋白质。
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用1.聚合酶链反应（PCR）：PCR是一种在体外快速合成特定DNA片段的技术。
它的原理是基于DNA的逐步复制。
PCR需要DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs等反应物。
通过多个循环的高温退火、DNA扩增和DNA合成过程，可以在短时间内扩增指定的DNA片段。
应用：PCR在许多领域得到广泛应用。
它可用于基因组学、遗传学、医学诊断、病毒学等领域。
例如，PCR可以用于检测基因突变、诊断遗传疾病、鉴定病原体等。
2.DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
目前主要有Sanger测序和高通量测序两种方法。
（1）Sanger测序原理：Sanger测序是一种经典的测序方法，基于DNA的DDN反应。
它利用碱基的链终止效应，使DNA合成过程在产生溶胶碱基的情况下中断，从而得到不同长度的DNA片段。
通过电泳分离并测定不同长度的DNA片段，可以确定DNA序列。
（2）高通量测序原理：高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序和Pacific Biosciences测序等，通过以平行方式同时测序多个DNA片段，大大提高了测序效率和数据产量。
应用：DNA测序技术在基因组学、癌症研究、生物进化等方面具有广泛应用。
它可以用于发现新基因、研究遗传变异、揭示物种演化等。
3.基因克隆：基因克隆是将DNA片段插入载体（如质粒）中并转化到细胞中，从而实现特定基因的复制和表达。
基因克隆包括DNA片段的剪接、连接、转化和筛选等步骤。
应用：基因克隆技术是分子生物学研究的基础。
它可以用于制备重组蛋白、构建转基因植物和动物、研究基因功能等。
4.蛋白质表达：蛋白质表达是将基因转录为mRNA，再通过翻译作用合成蛋白质的过程。
蛋白质表达技术包括原核和真核表达系统。
（1）原核表达系统：原核表达系统常用的有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
这些系统可以用于高效表达蛋白质，并且易于操作。
（2）真核表达系统：真核表达系统是利用真核细胞如CHO、HEK293等表达蛋白质。
常用分子生物学技术的原理及应用【PPT】
2. 印迹(blotting)定义
将存在于凝胶中的生物大分子转移（印 迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分 析的技术。
3. 应用 广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测
4. 发展 电转移印迹技术、
真空吸引转移印迹等
（二）探针技术
探针(probe)的概念
是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素
或荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能 够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测 核酸样品中是否存在某一特定的基因。
原始文献出处
Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸） and hybridization with DNA probes.
This is then followed by detection by either nucleotide probes (for a northern blot and southern blot) or antibodies (for a western blot).
The technique offers significant savings in time, as chromatography or gel electrophoresis, and the complex blotting procedures for the gel are not required.
"for his invention of the polymerase
chain reaction (PCR) method"
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第二十二章
常用分子生物学技术 的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
目录
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
第一轮筛选
第二轮筛选
第三轮筛选
目录
第五节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
目录
克隆疾病相关基因的策略
（一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(position-
目录
二、DNA链末端合成终止法
目录
目录
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列 分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱 氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发 射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并 依此确定DNA碱基的排列顺序。
目录
DNA自动测序结果包含了某一生物体全部
DNA序列的克隆群体。 •基因组DNA (genomic DNA librar录目录基因组筛选结果举例目录目录
三种印迹技术的比较
②
③ ①
分子杂交实验
目录
放 射 自 显 影 照 片
目录
DNA 点阵
目目录录
第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
目录
一、基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
目录
其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
缩小范围，最后克隆该基因。
系统的定位克隆工作
① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)
交换分析、连锁不平衡分析
② 分子生物学分析
染色）非定位候选基因克隆策略
由于基因组作图的完成和分子病理学的 发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根 据病理学变化和对各种基因产物功能的了解， 预测出候选致病基因。
independent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional
candidate gene approaches )
目录
（一）功能性克隆
定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，
克隆该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表达产物较易得 到部分纯化的遗传性疾病。
目录
（四）定位候选基因克隆策略
当致病基因的染色体定位确认后， 人们可以利用因特网上的基因网站 所提供基因序列数据，鉴定出候选 致病基因。
目录
第六节
遗传修饰动物模型的建立 及应用
Nucleic Acid Sequence Analysis
目录
核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
目录
一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
基本原理 基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个 碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应 强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同 分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同 的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放 射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
退火
Tm-5˚C
目录
四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
目录
三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
目录
实时PCR技术原理
目录
第三节 核酸序列分析
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
目录
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板Байду номын сангаасNA的
含量可以扩大100万倍以上。
目录
二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
目录
三、PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
目录
克隆方nal complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
目录
（二）定位克隆
定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步
目录
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分
子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起， 只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基 配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双 链(heteroduplex) 。
目录
复性
RNA
DNA
目录
（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记
其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定 在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核 酸分子存在。
目录
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
常用分子生物学技术 的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
目录
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
第一轮筛选
第二轮筛选
第三轮筛选
目录
第五节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
目录
克隆疾病相关基因的策略
（一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(position-
目录
二、DNA链末端合成终止法
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三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列 分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱 氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发 射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并 依此确定DNA碱基的排列顺序。
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DNA自动测序结果包含了某一生物体全部
DNA序列的克隆群体。 •基因组DNA (genomic DNA librar录目录基因组筛选结果举例目录目录
三种印迹技术的比较
②
③ ①
分子杂交实验
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放 射 自 显 影 照 片
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DNA 点阵
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第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
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一、基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
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其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
缩小范围，最后克隆该基因。
系统的定位克隆工作
① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)
交换分析、连锁不平衡分析
② 分子生物学分析
染色）非定位候选基因克隆策略
由于基因组作图的完成和分子病理学的 发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根 据病理学变化和对各种基因产物功能的了解， 预测出候选致病基因。
independent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional
candidate gene approaches )
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（一）功能性克隆
定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，
克隆该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表达产物较易得 到部分纯化的遗传性疾病。
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（四）定位候选基因克隆策略
当致病基因的染色体定位确认后， 人们可以利用因特网上的基因网站 所提供基因序列数据，鉴定出候选 致病基因。
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第六节
遗传修饰动物模型的建立 及应用
Nucleic Acid Sequence Analysis
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核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
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一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
基本原理 基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个 碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应 强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同 分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同 的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放 射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
退火
Tm-5˚C
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四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
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三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
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实时PCR技术原理
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第三节 核酸序列分析
Cycle 2
5 5
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Cycle 3
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25～30 次循环后，模板Байду номын сангаасNA的
含量可以扩大100万倍以上。
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二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
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三、PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
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克隆方nal complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
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（二）定位克隆
定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步
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一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分
子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起， 只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基 配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双 链(heteroduplex) 。
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复性
RNA
DNA
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（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记
其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定 在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核 酸分子存在。
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二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。