酶活性的测定

准确称取天山云杉种子0.1 g，先加入1 ml 预冷的50 mmol/ L的磷酸缓冲液(pH 7.0，内含1 mmol/ L EDTA)，研磨成匀浆，然后用4.5 ml 分两次冲洗研钵至试管中，4 ℃，10000 r/min 离心20 min，上清液即为酶提取液，4 ℃保存用于ROS系统酶活性分析。

3 酶活性的测定
3.1 过氧化物酶(POD，EC 1.11.1.7) 活性的测定。

按照Chance 和Maehly[6]的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L的磷酸缓冲液(pH 7.0，内含0.1 mmol/ L EDTA) 2.9 mL，2 % H2O2 1.0 mL，50 mmol/ L 愈创木酚1.0 mL。

测定时，反应混合液先在25 ℃水浴中预热，立即加入0.1 mL酶液以启动反应，以缓冲液调零，测定OD470值，每隔30 s读数一次。

取0 — 60 s 时间段，即1 min 反应时间来计算酶活性。

以每分钟OD470增加0.01的酶量为一个酶活单位，U·g-1。

计算公式: POD活性= ΔA470 × V t × (0.01× t × FW × V1) -1
注: ΔA470:反应时间内吸光度的变化；V t:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，1 min
3.2 过氧化氢酶(CAT，EC 1.11.1.6) 活性的测定。

按照Aebi[7]的方法，并作如下修改:反应混合液为酶液0.2 mL (空白管以失活的酶液代替)，50 mmol/ L的磷酸缓冲液(pH 7.0，内含0.1 mmol/ L EDTA) 1.5 ml，蒸馏水 1.0 ml。

测定时，反应混合液和0.1 mol/ L H2O2预先在25 ℃水浴中预热。

取反应混合液，加入0.1 mol/ L H2O2 0.3 ml，终体积为3 ml，测定OD240值，每隔1 min读数一次，共读4 min。

以每分钟OD240减少0.1的酶量为一个酶活单位，U·g-1。

计算公式:CA T活性= ΔA240 × V t × (0.1× t× FW × V1) -1
注: ΔA240:A0－(A1+ A2) / 2；A0:对照管的吸光度；A1，A2:样品管的吸光度；V t:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，1 min 3.3 超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.1.1) 活性的测定。

按照Giannopolitis 和Ries[8]的方法，并作如下修改:反应体系: 50 mmol/ L，pH 7.8 磷酸缓冲液3.0 ml，130 mmol/L甲硫氨酸0.6 ml，750 μmol/L氮蓝四唑0.6 ml，0.1 mmol/ L EDTA 0.6 ml，酶提取液0.2 ml(对照管以失活的酶液代替)，蒸馏水1.0 ml，20 μmol/ L核黄素0.6 ml。

混匀后，将一支对照管放置暗处，其他各管置于30 ℃光照为4000 lx 日光灯下反应20 min(要求照光情况一致，视酶活性高低适当调整反应时间)。

至反应结束后，用黑布遮住试管，终止反应。

以避光的对照管作为空白，测定各管OD560值。

以抑制NBT光化还原的50 % 为一个酶活单位，U·g-1。

计算公式:SOD活性= (A0－A s) × V t × (0.5 × A0 × FW × V1) -1
注: A0:照光对照管的吸光度；A s:样品管的吸光度；V t:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g
3.4 抗坏血酸过氧化物酶(APX，EC 1.11.1.11) 活性的测定。

按照Nakano 和Asada[9]的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L 磷酸缓冲液(pH 7.0，内含0.1 mmol/ L EDTA)，0.5 mmol/ L ASA。

测定时，反应混合液和6 mmol / L H2O2预先在25 ℃水浴中预热。

取反应混合液2.9 ml，加入酶液50 μl，加入6 mmol / L H2O2 50 μl (终浓度为0.1 mmol/ L) 以启动反应，终体积为3 ml，以不加H2O2作空白调零，测定OD290值，每隔10 s读数一次。

取0 — 30 秒时间段，即30 秒反应时间来计算酶活性。

以每分钟氧化1 μmol ASA的酶量为一个酶活单位，U·g-1·min-1。

计算公式: APX活性= ΔA290 × V t × (2.8 × t × FW × V1) -1
注: ΔA290:反应时间内吸光度的变化；V t:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；2.8: 1 mmol ASA在290nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，0.5min 3.5 谷胱甘肽还原酶(GR，EC 1.6.4.2) 活性的测定。

按照Halliwell 和Foyer[10]的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L 磷酸缓冲液, (pH 7.5，内含0.1 mmol/ L EDTA)，5 mmol/ LMgCl2。

测定时，反应混合液、10 mmol/ LNADPH2和10 mmol/ L GSSG 预先于25℃水浴中预热。

取反应混合液2.34 ml，加入酶液450 μl、10 mmol/ L NADPH2 60 μl ( 终浓度为0 . 2 mmol/L ) 及10 mmol/ L GSSG 150 μl (终浓度为0.5 mmol/ L ) 以启动反应，终体积为3 ml，以缓冲液代替酶液调零，测定OD340值，每隔30 s读数一次。

取0 — 3.5 min 时间段，即 3.5 min 反应时间来计算酶活性。

以每分钟消耗1 μmol NADPH的酶量为一个酶活单位，U·g-1·min-1。

计算公式: GR活性= ΔA340 × V t × (6.22 × t× FW × V1) -1
注: ΔA340:反应时间内吸光度的变化；V t:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；6.22: 1 mmol NADPH在340nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，3.5min
3.6 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC.1.11.1.9) 活性的测定。

按照黄爱缨[3]、Flohe[4,5]等的方法，并作如下修改:反应体系由1.0 mmol/ L GSH 0.2 ml (含2.5 mmol/ L NaN3)，酶液0.2 ml组成，由37 ℃预热的1.5 mmol/L H2O2 0.1ml启动反应，立即于37 ℃水浴中反应3 min后，加1.67 % 的偏磷酸沉淀液(含2 % EDTA-2Na, 28 % NaCl) 2 ml 沉淀蛋白质，5000 r/min离心20 min，保留上清液。

取上清液1 ml (空白管加入双蒸水0.2ml和1.67%的偏磷酸沉淀液0.8 ml)，加入0.32 mol/L Na2HPO4 1.25 ml 及DTNB (5,5’-二硫对二硝基苯甲酸) 0.25 ml，反应5 min，测OD422值。

必要时也要测定样品本身的GSH (及其他-SH) 的值。

以单位鲜重(g) 的植物样品，在37 ℃下，每分钟使GSH的改变为总量的0.001时为一个酶活性单位(扣除非酶反应的GSH) ，U·g-1·min-1。

计算公式: GPX活性= (A0－A s) × V t × (0.001 × A0 × t × FW × V1) -1
注: A0:照光对照管的吸光度；A s:样品管的吸光度；V t:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液总体积，ml；FW:样品鲜重，g；t:反应时间，5min。