戴安液相色谱中国培训基础知识
戴安液相色谱操作手册
1.用途用于非挥发性物质的分析。
2.部件组成P680A LPG四元低压梯度泵ASI-100自动进样器TCC-100柱温箱PDA-100二极管阵列检测器RF 2000荧光检测器UCI-50数模转换器3.操作步骤3.1准备工作3.1.1打开稳压电源开关。
3.1.2更换泵头里清洗瓶中去离子水3.1.3更换托盘里洗针瓶中的洗液，洗液一般为：50%的甲醇。
3.1.4流动相的混匀与过滤：若流动相为非单一溶剂，配好后要用璃棒或其它工具搅匀。
如果使用的流动相非色谱纯的、水相或配好的混合溶液，需要用0.45μm的一次性过滤膜过滤。
3.1.5流动相的超声脱气：过滤后的流动相需要超声脱气，一般超声约10～20分钟。
3.1.6排泵内的气泡：打开仪器后面板的电源。
拧松泵右侧的快速清洗阀（反时针两圈左右）。
按下泵前面板右下方的“Purge”键，仪器将以6.0 ml的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5分钟将自动停止。
若想想手动停止，则再按再按“Purge”键，将停止清洗。
将每个需要使用的通道分别排完气泡后，拧紧快速清洗阀(顺时针拧紧，注意不要拧得过紧。
)。
3.2联机3.2.1打开进样器、柱温箱、检测器电源开关。
3.2.2打开变色龙软件。
进入合适的仪器面板界面，联机。
在“PROGRAM”中设置泵、进样器、柱温、检测器参数。
在“METHOD”中设置数据分析参数，在“SEQUENCE”编辑进样次序。
3.2.3点工具栏中蓝色小圆点，开始设置采集基线。
3.3分析样品3.3.1系统的准备：3.3.1.1分析样品前先用甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。
3.3.1.2若流动相为有机相与水相的混合物，则第1步完成后，按照分析样品的需要调节比例阀的比例后冲洗流路约20分钟后，待基线走平后即可进样。
3.3.1.3若流相相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸或其它电解质，则第1步完成后用95%的去离子水冲洗流路约20分钟后，再按照分析样品的需要调节比例阀的比例后冲洗流路约20分钟后，待基线走平后即可进样。
戴安液相色谱中国培训基础知识共117页
30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
色谱分离的机理
分离是一个物理的过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
峰底 － Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相 交两点之间的距离
溶剂 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。
基线 ↓
← 色谱峰 峰宽
保留时间（分）
峰高
液相色谱图相关术语
色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分 曲线
300
250
200
150 100
50
k ＝ 2，Vo ＝ 1000L
0
2000
4000
理论塔板数
6000
8000
塔板数 × 103
塔板数与流速的关系
15
10
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
液相色谱教程-液相色谱基础知识2
YOU
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
色谱图名词术语
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 – 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 – 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 – 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象
-25%
液相色谱的应用
目的:得到数据-定性及定量分析
– 灵敏度的要求 – 样品的复杂性 – 样品量的要求 – 精度及准确度的要求 – 容易使用
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液相色谱的应用
制备型液相色谱 目的:得到纯品-分离及纯化 • – 化合物的稳定性 • – 样品的复杂性 • – 制备量的要求 • – 纯度的要求，及纯度的鉴定 • – 方法的安全性
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通 过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离
色谱图名词术语
– 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一 半
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色谱图名词术语
死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留 的组分,从进样到出现峰最大值所需的时 间 – 保留时间(tR)(Retention time):组分从 进样到出现峰最大值所需的时间
液相色谱的基础知识共69页
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
液相色谱的基础知识
•
6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
•
8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
•
9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。 Nhomakorabea•
10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
END
液相色谱基本知识
液相色谱基本知识一、液相色谱原理液相色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡原理的分离技术。
当流动相流经固定相时，不同物质在固定相中的保留时间不同，从而实现分离。
通过选择合适的固定相和流动相，以及调整流动相的速度，可以实现对不同物质的分离和纯化。
二、液相色谱种类根据固定相的不同，液相色谱可以分为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱等多种类型。
根据流动相的不同，液相色谱可以分为正相色谱和反相色谱。
正相色谱中，固定相的极性大于流动相的极性；反相色谱中，固定相的极性小于流动相的极性。
三、液相色谱操作步骤1. 样品准备：将待分离的样品进行适当处理，以便于后续的分离和纯化。
2. 装柱：将固定相装入色谱柱中，确保固定相填充均匀。
3. 平衡：在流动相中平衡色谱柱，使固定相和流动相充分接触。
4. 进样：将待分离的样品加入色谱柱，开始分离过程。
5. 洗脱：使用流动相洗脱样品中的各组分，并收集洗脱液。
6. 检测：对收集到的洗脱液进行检测，确定各组分的含量和纯度。
四、液相色谱应用领域液相色谱在多个领域有着广泛的应用，如医药、生物、环保、食品等。
在医药领域，液相色谱可用于药物的分离和纯化；在生物领域，液相色谱可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化；在环保领域，液相色谱可用于污染物的分离和检测；在食品领域，液相色谱可用于食品添加剂、农药残留等的检测。
五、液相色谱优缺点1. 优点：液相色谱具有分离效果好、分离速度快、适用范围广等优点。
同时，液相色谱还可以与质谱等检测手段联用，提高检测灵敏度和准确性。
2. 缺点：液相色谱需要使用有机溶剂作为流动相，可能对环境和人体健康造成一定影响。
此外，液相色谱的设备成本较高，操作复杂度也相对较高。
六、液相色谱仪器设备液相色谱常用的仪器设备包括高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、质谱仪等。
其中，高效液相色谱仪是实现液相色谱分离的核心设备，它包括泵、进样器、色谱柱、检测器等部分。
液相培训内容
L600系列液相色谱仪培训内容一、基本原理色谱技术是利用待测组分与流动相、固定相之间的作用（分配系数）不同，从而实现分离的过程。
先解释2个名词：1、流动相：顾名思义是在整个系统中处于流动状态的流体。
流动相是液体的叫液相（就是我们今天要学习的这一款仪器），起到运输样品和参与组分分离的作用。
流动相是气体的叫气相，只起运输样品的作用。
2、固定相：是静止不动的一相，装填或涂布于色谱柱内，参与组分分离。
“分离”是色谱区别于光谱仪器最大的特点和作用，一般的光谱仪器只能通过波长等特性从混合物中去选择待测物，一般一次只能检测一种物质；而色谱能够将复杂的混合物逐一分离成单一组分，逐个检测，可以实现多种组分的同时分析，比如我们熟悉的色素，苏丹红1、2、3、4，就可以一针进样同时检测。
二、仪器结构及各部分的使用要点液相色谱一般由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统构成。
下面我们按照这个组成的顺序逐一讲解每一部分的使用要点。
1、输液系统输液系统顾名思义就是用来输送流动相的部分，它包含了“输”和“液”两部分，“输”的部分就是指高压输液泵，它就像我们人体的心脏一样，是一切动力的源头，没有它液体不可能流动。
“液”就是指流动相了，它就像我们人体的血液一样，在泵给与的动力下，运送到整个系统。
下面分别讲解这两部分的使用方法和注意事项。
（1）流动相a、流动相类型：我们一般使用的流动相有三种类型，第一种是纯的有机溶剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等，其中甲醇是最常用的，通常用它来冲洗平衡系统，C18柱在工作完后需要保存在纯甲醇中。
第二种是检测样品用的流动相，根据标准或方法来配置，通常含有缓冲盐。
第三种是10%-20%的甲醇水溶液（比例并不需要非常的准确），它是用于纯有机溶剂与含有缓冲盐的流动相之间的过渡冲洗液，因为缓冲盐溶于水但不溶于有机溶剂，如果不过渡直接更换，就会使缓冲盐在有机溶剂中析出成结晶盐，造成系统的堵塞，尤其是色谱柱，这是不可逆的损坏。
液相色谱培训讲义(DOC 40页)
液相色谱培训讲义(十)作者：转载自：发布日期：2007-5-22第十一章柱子的应用与维护色谱柱的液相色谱系统获得分离的中心部件，许多分离问题都归结于色谱柱。
对柱注意适当的维护，则可缓解许多故障的发生。
柱故障主要是由机械、色谱或者化学方面的原因引起的。
维护色谱柱和排除故障，；需要懂得液相色谱的分离过程以及色谱柱本身的构造是非常重要的。
色谱柱的价格昂贵，应避免人为地损坏，并尽可能延长其寿命。
一、色谱柱的种类与评价一般地说，根据样品的性质决定采用何种液相色谱方法，然后再选择不同类型的柱。
即不同类型的柱则代表了不同的色谱方法。
不同种类色谱柱的差异在于柱结构、柱填料和柱尺寸的不同。
色谱柱有不同的尺寸(长度和内径)，分制备型、常规分析型和微型。
不同类型柱的硬件也不同，(包括接头、柱管等方面)，还有径向加压柱和夹套加热柱等。
不同液相色谱法的尺寸根据需要可以选取，普通分析3～30cm长，内径4～8mm。
常用20cm 长、4.6mm内径的柱。
制备型柱内径一般为8mm、25cm长。
微型柱内径l～3mm，长10～20cm。
不同的填料分析的效果可能不同，这是因为生产过程不同所致。
同一厂商生产的同种填料因批号不同也会有差异，这种差异可能从基质就开始(表面积、杂质、特殊处理)，还有键合的化学物质(一氯或三氯硅烷反应剂)，不同厂家生产的填料还会因专利技术(预处理、键合过程、填装技术)等不同而呈现较大差异。
由于种种差异、仅能假设同一批号的柱有基本相同的性质。
多数柱填料基质采用多孔硅胶微粒，通常有球形和无定形两种，具有不同的粒度、孔径和表面积。
多孔聚合物微粒也适用于反相色谱。
聚合物柱的流动相范围广，流动相pH值可在1至13之间。
而硅胶基质pH仅能在2.5和7之间。
显然，聚合物柱要好一些，但目前仍是以硅胶基质的柱为主。
原则上，聚合物柱可以克服硅胶基质柱的某些不足，但需要大量的实验来证实，要进一步考查聚合物基质填料的全面优越性。
在实际工作中，选择性能良好的柱可得到好的结果，首先要注意柱径、长度、填料种类和填料粒度。
液相色谱基础理论.ppt
并非由试样所产生的峰；亦称假峰
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基础理论：术语介绍
基线－Baseline
在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线
基线飘移 － Baseline Drift
基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise
由各种因素所引起的基线波动
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基础理论：术语介绍
峰面积 － Peak Area
峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error
0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak
后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak
前沿较后沿平缓的不对称峰
调整保留体积，V’R － Adjust retention volume
戴安中国HPLC用户培训 2011年
戴安中国有限公司
液相色谱基础知识部分
液相色谱简介 液相色谱理论基础
2
高效液相色谱简介
3
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
4
经典液相色谱
石油醚 淋洗剂
叶绿素
碳酸钙 颗粒
Review Stop
叶绿素 中的有 色物质
峰底 － Peak Base
峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height
峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width
在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height
液相色谱培训下
4、峰形问题 4.3、分叉峰： 故障原因 排除办法 4.3.1、 色谱柱前端污染 冲洗或更换色谱柱 4.3.2、 色谱柱前端损坏 更换色谱柱 4.3.3、溶剂与流动相不溶 用流动相为溶剂 说明：一般样品都用流动相作为溶剂，也有 的标准没有用流动相做溶剂，这通常与样品 的溶解性有关。在此情况下，进样前要先进 空白，确定对系统测定的影响情况。
1、开机前准备 1.3、流动相及相关溶液配制及处理： 1.3.1、严格按标准要求配制流动相，包括 试剂名称、级别（HPLC级）、数量、先后顺 序等都要注意，同时还要注意配制过程中的 一些现象，比如是否有晶体析出、是否有沉 淀或浑浊、是否有pH值较大变化等，这些现 象往往告诉我们：在配制过程中出现问题。 有可能是我们操作失误，也有可能是标准出 了问题，后者更应引起我们的 2、开机的步骤 3、开机后冲柱 4、进样及计算 5、实验后处理
1、开机前准备 1.1、系统管路的检查： 1.1.1、溶剂瓶内是否有一定体积的溶剂， 不能空瓶运转系统，使空气进入系统管路。 1.1.2、溶剂是否有浑浊或杂质，发现问题 要及时更换溶剂瓶及溶剂，防止堵塞滤头。 目视观察不需要多少时间，但却可以及时发 现很多问题，避免分析过程中出现意想不到 的麻烦，是一种非常有效的方法，也是一种 好的操作习惯。
1、开机前准备 1.3.3、过滤时要注意几个问题，一是过滤 前要充分混合；二是注意滤膜的选择，一般 含有机溶剂的流动相选用有机膜（多用暖色 包装），不含有机溶剂的流动相选用水膜（ 多用冷色包装），特别要注意水膜不能用来 过滤有机相；三是避免过滤过程中的污染。 另外在过滤正相流动相时，一定要在过滤前 将过滤器烘干，避免残留水分污染流动相。
2、开机的步骤 2.1、依次开启总电源及输液泵、检测器等 系统各部分电源，各部分开始自检。 2.2、自检完成后，打开电脑开启工作站联 机，控制系统各部分的运行。 说明：岛津等个别品牌系统可直接通过输液 泵控制面板上的控制键来完成自身运行的控 制，并不需要通过工作站来进行控制。
液相色谱基础知识
梯度洗脱形式： 梯度洗脱形式：
线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例 指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系 折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系
梯度洗脱形式的选择
液相色谱基础知识
梯度洗脱： 梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度，提高检测器的灵敏度
液相色谱基础知识
液相色谱基础知识
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 液相色谱：
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 适用于高沸点、大分子、 分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
气相色谱： 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 适用于沸点较低、 流动相只起运载样品分子的能力
注意事项： 注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 （如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动 相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
样 品
1.
处
理
使用适宜的流动相溶解样品 在溶剂选择的时候，应注意以下原则： -- 减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰 的流动相 -- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统 中尤其在色谱柱中产生沉淀
溶 剂 等 级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
General Maintenance and Troubleshooting
溶 剂 等 级
缓冲液的使用
使用前必须过滤 以免造成腐蚀、 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞:首先用纯水冲洗 首先用纯水冲洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用 ），再用 阻塞 首先用纯水冲洗 （ ）， 甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min) 甲醇冲洗 易受到细菌和霉菌的影响
液相色谱基础知识培训教材
Inject Inject
用“5s”法计算柱效
Inject
Good Column
Bad Column
液相色谱基础知本身
. 减小填料的颗粒度 . 找到最佳的流速(根据不同内径) . 合适的温度 . 降低溶剂的粘度 . 增加柱长
液相色谱基础知识培训教材
其他影响柱效的因素
` 柱外效应
. 连接管路 . 进样器、检测器
` 进样体积 ` 进样量
液相色谱基础知识培训教材
容量因子 k'
与峰高的关系
与R的关系
改变k'值的方法∶
调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗
液相色谱基础知识培训教材
选择性系数 a
` 定义∶
. a =1 时两组分分不开，
` 改变a的途径
程度。是化学因素。 . N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程
度。
液相色谱基础知识培训教材
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
W
s
方法
Wtan
16 切线法
Wh
5.54 半峰高
W3s
9
3s
W4s
16
4s
W5s
25
5s
液相色谱基础知识培训教材
用“切线”法计算柱效
不好的色 谱柱的柱效反 而比好色谱柱 的要高，因为 其拖尾部分测 不出来
2020/11/26
液相色谱基础知识培训教材
` “分析型液相色谱” ` 定性及定量分析
. 灵敏度的要求 . 样品的复杂性 . 样品量的要求 . 精度及准确度的要求 . 容易使用
液相色谱基础知识培训教材
液相色谱的应用（二）
戴安液相色谱HPLC培训教程
P680平衡泵头结构图
易损件!
混合腔的维护
• 小心拆卸混合 腔的盖板；
• 检察混合搅拌 器电磁棒是否 需要更换；
• 安装新的密封 圈
P680常见故障指南
• Upper pressure limit exceeded. 流路堵塞； —— 寻找并排除堵塞点 流速过高； —— 重新设置流速(清洗系统) 手动进样阀转换位置慢； —— 调整高压极限
• One of the piston seal is leaking. 检查泵头是否泄漏。 —— 修改柱塞泄漏阈值或更换垫片。
• Leak detected. 泄漏报警并停泵。 —— 消除泄漏，擦干传感器和托盘。
• Right hand pump block carrover pressure is too high. 右侧工作泵头的压力超过允许范围。 —— 检查工作泵头、平衡泵头、清洗阀之间的管路是 否堵塞。
Summit HPLC 系统
• P680A 等浓度泵
• P680A LPG 分析泵 低压四元梯度
• P680A HPG 分析泵 高压二元梯度
• P680P HPG 制备泵
P680前面板
压力显示 流速显示
屏
光
功
幕
标
能
键
键
遥高
直
泵
控低
接
开
状压 态极 显限
操 作
关 键Βιβλιοθήκη 键示显示P680后面板
电电 源源 保 开插 险
• Strong baseline drift 氘灯预热时间不足/系统没有平衡； —— 延长平衡时间 色谱柱污染； —— 清洗或更换色谱柱 环境温度不稳定； —— 确保恒定的温度 溶剂污染； —— 更换溶剂 流动池污染； —— 清洗流动池
液相色谱教程-液相色谱基础知识1
什么是HPLC?
高效液相色谱法– HPLC(High Performance Liquid Chromatography )– 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段: 高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…– 广泛应用于各个领域: 医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…– 无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间
他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带
Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)
色谱法简介
20世纪30年代开始广泛研究和应用
高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
什么是UPLC?
超高效液相色谱– UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography ) – 是区别于HPLC的液相色谱新领域
– 基于小颗粒填料和LC原理的一种创新方法– 实现超高分离度、灵敏度、分析速度–是Waters公司对液相色谱的新贡献
– HPLC的流程
HPLC的图形结果
色谱图(Chromatogram) :色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间
THANK YOU
2024
1906年正式命名(见诸文献)
色谱法是一种现代的分离方法-不单是分离有色物质-不单是吸附机理
昔者瓠巴鼓瑟，而流鱼出听
色谱法的原理– 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离– 两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂
液相色谱培训二：理论基础
可整理ppt
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2、基本参数 固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值 小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。 混合物中各组分的分配系数相差越大，越容 易分离。 在HPLC 中，固定相确定后，K 主要受流动 相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的 组成配比及pH 值，以获得组分间的分配系 数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的
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2、基本参数 2.3.2、容量因子(capacity factor，k)--化合物 在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动 相中的量之比。因此容量因子也称质量分配 系数。 容量因子的物理意义：表示一个组分在固定 相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时 间（t0）的几倍。k＝0 时，化合物全部存在 于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k
可整理ppt
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2、基本参数 2.4、分离参数 2.4.1、分离度(resolution，R)--相邻两峰的保 留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率 ，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5 称为完 全分离。中国药典规定R 应大于1.5。 提高分离度有三种途径： ①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这 样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法
可整理ppt
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2、基本参数 2.3.3、选择性因子(selectivity factor，α)--相 邻两组分的分配系数或容量因子之比。 要使两组分得到分离，必须使α≠1。α 与化 合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温 有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从 本质上来说，α 的大小表示两组分在两相间 的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相 互作用力的差异。
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2、基本参数 2.2、柱效参数 2.2.1、理论塔板数(theoretical plate number， N)--用于定量表示色谱柱的分离效率（简称 柱效）。 N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径 分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类 和流速及测定柱效所用物质的性质。
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分离度与 N 的关系
N 塔板数
N结果
% 变化
N 1000 N 2000 N 3000
N 5,000 N 10,000 N 15,000
1000 31.6 2000 44.7 3000 54.7
41% 73%
5,000 70.7 10,000 100 41% 15,000 122.4 73%
定义： tR2 t0 k ' 2
tR1 t0 k ' 1
a =1 时两组分分不开， R 1
改变a的途径
改变固定相或改变流动相
改变温度
改变样品的本身性质
改变分离因子α 的例子
通过改变流动相改变α，同样强度的不同溶剂
① ②③ ① THF / H2O ＝28 : 72
② MeOH / H2O ＝58 : 42 ③ CH3CN / H2O ＝38 : 62
离子对色谱机理
使用五烷基磺酸盐
:
C18
:
4 x 30
:
2O 0.005M
& 1% (50/50)
: 2.0
: , 254 , 0.1
1. 2. 3. 4. 5. 6.
使用六烷基磺酸盐
:
C18
:
4 x 30
:
0.005M
&
1% (50/50)
: 2.0
: , 254 , 0.1
1.
2. -
3. -
液相色谱原理 － 更进一步的探讨
离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！ 使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的值，使样品 成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性
离子抑制色谱
离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的值，抑制样品离子的电离 主要适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的在2-8（较保险值3-7）内
在高值下用离子抑制
色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温 流动相：乙腈/0.01M 4
+ 0.01M 流 速：1.0 检 测：240 样 品：巴比妥的衍生物
① 巴比妥 ② 己琐巴比妥 ③ 甲基苯巴比妥 ④ 速可巴比妥
离子对色谱法
在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型： 磷酸季丁铵（ A），适用于弱酸 烷基磺酸盐（ B），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 – 后面的数字是碳链 的长度 磷酸二丁胺（ D4），适用于弱碱
什么是色谱的分离度
分离度的公式：
R V2 V1
1 2
(W2
W1 )
R：分离程度的量度
影响分离度的因素：K’、α及N
分离度方程：
R
k ' k ' 1
1
N 4
K‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之 间作用的强弱
α是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏 程度，是化学因素
N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度
分离度方程解析：柱效项
N R
1 4
1
1
若 N 增加 2倍 或 3倍 , R会如何变化?
N ＝ 理论塔板数：分离效率的量度
= .5
N
16
V
2
W
N
16
5
2
.5
N 1600
=2
N
16
V
2
W
N
16
5
2
2
N 100
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
N
V1
2
W
色谱泵及液相色谱对泵的要求
稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注 滞后体积 仅仅应用于梯度实验 目的：在任何情况下保持最高精度
梯度：高压混合
高压梯度 使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积
峰高
液相色谱图相关术语
色谱峰 － 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 － 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 － 峰最大值到峰底的距离 峰宽 － 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 － 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两 点之间的距离
梯度：低压混合
低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当，梯度的 准确性受影响 滞后体积（系统 体积）设计合理
低压梯度
梯度滞后：系统体积的影响
B AC
D
比例阀
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
液相色谱图相关术语
死时间，t0 － 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时 间 保留时间， － 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 － 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流 动相体积 保留体积， － 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
液相色谱应用：制备型液相色谱
液相色谱原理 － 基本概念及方法开发
液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的方法；亦称色谱条件
评价液相色谱方法的标准
问题：什么样的分离结果是好的？分离度？
液相色谱图相关术语
峰面积 － 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差；σ － 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 － 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 － 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 － 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
液相色谱图相关术语
基线 － 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 － 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N － 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 － 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内 移动过程中谱带宽度增加的现象
滞后体积变化的影响
设计不好的系统，滞后体积随反压变化
滞后体积随反压变化的后果：
梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好
用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
固定滞后体积，改善了梯度性能
普通的低压梯度系统
梯度百分比
梯度百分比
梯度曲线
不好的梯度 滞后曲线
好的梯度 滞后曲线
保留时间
保留时间
900
600 mAU
400 200
-100 5
900
600 mAU
400 200
-100 5
色谱柱反压变化对梯度实验的影响
Methylparabene Ethylparabene PropylparabeneButylparabene
: 60 , 85 105
: > 2%
6
8
10
Minutes
Methylparabene Ethylparabene PropylparabeneButylparabene
12
P680A : 60 , 85 105 : < 1%
6
8
10
12
Minutes
120, C18, 5 µ m, 4.6 x 100 ; 0.5 ; 25°C; 5 µ L ; 256 ; (A) (B) ; : 30 % b 100 % B 10 ; , , , 10
液相色谱的检测器
常规检测器 示差折光检测器（ ） 紫外/可见光吸收检测器（） 荧光检测器（） 蒸发光散射检测器（ ） 其他检测器（ ） 高端检测器 光电二极管矩阵检测器（ ） 质谱检测器（ ）
0
0
0
1 1/2
.50
2 2/3
.67
3 3/4
.75
10 10/11
.91
20 20/21
.95
与分离度的关系
与 R 的关系
容量因子 k 与峰高的关系
改变 k’ 值的方法： 调节流动相的极性、、离子强度等 梯度淋洗
谱图
改变容量因子 K’ 的例子
①
①
①
②
50/50
40/60
③
②
②
③
③
60/40
α、k’ 及 N 如何控制分离度
分离度方程解析：分离因1.1 1.4，R 会如何变化？
＝ 分离因子：峰分离程度的量度
V1
V2
V3
V0
时间 0.5
12
5
k' V2 或 V2 V0
k' V1
V1 V0
V2
2 - .5 3 1- .5
5 - .5 V3 1- .5
9
分离因子：α
分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求 化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
液相色谱应用：分析型液相色谱
定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用
滞后(系统)体积
溶剂输送 系统(泵)