分子病理学授课
合集下载
分子病理学课件
28
主要组织学实验室
学习交流PPT
29
冰冻切片实验室
学习交流PPT
30
乳腺癌标本巨检
学习交流PPT
31
病理和血液病理科
• 专项检查实验室
• 免疫细胞化学 • 细胞学 FISH (HER-2, UroVysion) • 图象分析 • 细胞遗传学 (FISH) • 分子病理诊断 • 流式细胞计数
DNA和RNA：PCR、Real－time PCR、 RT-PCR、ISH、DNA测序、 DNA微阵列
蛋白质： 蛋白组学、组织阵列、 免疫组化、流式细胞检查
学习交流PPT
11
B. 分子诊断应用于疾病的全过程
疾病阶段
检查目的
危险度预测
高危家族及一般人群中
疾病相关基因突变的携
带者
早期疾病诊断
症前诊断
疾病分期分级
分子病理学
学习交流PPT
1
绪论
第一节 病理学与分子病理学 的概念和性质
学习交流PPT
2
一、病理学的概念和性质 • ①研究疾病的原因(病因学)
• ②探索疾病的发生机制
• ③描述疾病发生发展过程中可见 的形态学变化
• ④揭示各种疾病所引起的功能异 常
学习交流PPT
器官病理学 细胞病理学 超微病理学 分子病理学
• 高温修复 • 修复液 • 酸碱度
学习交流PPT
18
学习交流PPT
19
学习交流PPT
20
学习交流PPT
21
学习交流PPT
22
学习交流PPT
23
学习交流PPT
24
学习交流PPT
25
学习交流PPT
【病理课件】分子病理学理论
• 活性态受体通过激活三聚体G蛋白的方式将信号 转入细胞内。
• 已证实有30多个7-螺旋受体的突变和人类疾病 有关。已知有600多种突变可以使7螺旋受体失 活，100多种突变可使受体持续激活而无须配体 结合。
酪氨酸激酶受体 Receptor Tyrosine Kinases
• 哺乳类拥有20个受体酪氨酸激酶家族，各具不 同的结构特征。
甾体激素之类的配体分子直接可以穿越细 胞膜进入细胞浆，在胞浆内与潜在的被称之为 核受体的转录因子结合。结合有配体的受体从 胞浆移动进入胞核，与其它蛋白质一起激活特 定基因的转录。
（2）胞内移动激酶激活通路
一些质膜受体可以开通激活胞内蛋白激酶 的通路，被激活的蛋白激酶进入细胞核，使潜 在的转录因子磷酸化。这些移动的激酶包括PKA 和几种MAP激酶。
Envelope
Proteins Transcriptase Glycoproteins
ONC
5’
gag
pol
env
V-ONC 3’
Transforming Ability
Life cycle of a nononcogenic retrovirus
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
蛋白激酶的分类
• 根据磷酸化的氨基酸残基分类：
• 丝/苏氨酸蛋白激酶 • 酪氨酸蛋白激酶
• 胞浆非受体型 • 跨膜受体型 • 双特异蛋白激酶
• 根据所依赖的第二信使分类：
• cAMP/cGMP依赖性蛋白激酶 • Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和肌浆球蛋白轻链激酶 • 蛋白激酶C (DAG依赖性)
• 已证实有30多个7-螺旋受体的突变和人类疾病 有关。已知有600多种突变可以使7螺旋受体失 活，100多种突变可使受体持续激活而无须配体 结合。
酪氨酸激酶受体 Receptor Tyrosine Kinases
• 哺乳类拥有20个受体酪氨酸激酶家族，各具不 同的结构特征。
甾体激素之类的配体分子直接可以穿越细 胞膜进入细胞浆，在胞浆内与潜在的被称之为 核受体的转录因子结合。结合有配体的受体从 胞浆移动进入胞核，与其它蛋白质一起激活特 定基因的转录。
（2）胞内移动激酶激活通路
一些质膜受体可以开通激活胞内蛋白激酶 的通路，被激活的蛋白激酶进入细胞核，使潜 在的转录因子磷酸化。这些移动的激酶包括PKA 和几种MAP激酶。
Envelope
Proteins Transcriptase Glycoproteins
ONC
5’
gag
pol
env
V-ONC 3’
Transforming Ability
Life cycle of a nononcogenic retrovirus
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
蛋白激酶的分类
• 根据磷酸化的氨基酸残基分类：
• 丝/苏氨酸蛋白激酶 • 酪氨酸蛋白激酶
• 胞浆非受体型 • 跨膜受体型 • 双特异蛋白激酶
• 根据所依赖的第二信使分类：
• cAMP/cGMP依赖性蛋白激酶 • Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和肌浆球蛋白轻链激酶 • 蛋白激酶C (DAG依赖性)
分子病理学技术讲稿
合格的超薄切片样品应该达到以下基本要求： （1）切片的厚度应在50nm左右，不能超过 100nm，以获得较高的分辨率和较高的反差； （2）切片应能耐受电子束的强烈照射而不发 生破裂、变形；（3）细胞超微结构保持良好， 没有明显的物质凝聚和丢失。
电子显微镜技术： 细胞内的细胞器、细胞骨架或大分子水平的变化。
三．常用免疫组织化学染色方法
（一）直接法
将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一 抗体上，以检查相应的抗原。直接法具有 特异性强的优点，但敏感性差，耗费抗体 多。
（二）间接法
先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异 性抗体， 二抗仅有种族特异性。 特点: ⑴ 预先标好二抗，较方便； ⑵ 比直接法敏感，但仍差。
⑵ Lysozyme少数阳性。
６．滑膜及间皮肿瘤及其标记物：双向分 化，无特异性标记物。
Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysoz
yme等均有可能阳性。
７．周围神经肿瘤及其标记物：
⑴ S-100：神经纤维肿瘤，神经鞘肿瘤。
⑵ 髓性碱性蛋白（Myelin basic protein,MBA）； ⑶ 髓鞘相关蛋白（MAG）；
⑷ 层粘连蛋白（Laminin）。
8．淋巴造血组织肿瘤及其标记物：
(１)LCA（Leucocyte Common Antigen，白细胞共同抗原）；
(２)CD19，CD25，CD20－－标记Ｂ淋巴细胞；
(３)CD4，CD8，CD3－－标记Ｔ淋巴细胞；
(４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－标记组织细胞； (５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen）－－标记Ｒ－Ｓ细胞； (６)CD11，CD14－－标记单核细胞、粒细胞。
《分子病理学》ppt课件
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细胞自噬的类型
细胞自噬的机制 The machinery of autophagy
Molecular regulation mechanism of autophagy
PI3K-Akt-mTOR LKB1-AMPK-mTOR Beclin1-Bcl-2 p53 Other mechanisms
细胞自噬的类型
Organelle-selective modes
Mitophagy : mitochondria Pexophagy: peroxisomes, Reticulophagy: endoplasmic
reticulum
selective autophagy
Physiological and Pathphysiological Roles of Autophagy
volved in certain tissue-specific functio Death
mune Response elopment and Aging
utophagy in Disease ncer urodegenerative diseases
arkinson, Huntington, Alzheimer
Half-life Discovery Nobel Prize
< 5 hours 1980 2004
>5 hours 1962 ?
E1(泛素活化酶) E2(泛素结合酶) E3(泛素-蛋白衔接酶)
比利时科学家德·迪夫
衰老的线粒体
衰老的过氧化物酶体
ekeeping mechanism involved cytoplasmic homeostasis
Identification of Atg genes and their functions.
细胞自噬的类型
细胞自噬的机制 The machinery of autophagy
Molecular regulation mechanism of autophagy
PI3K-Akt-mTOR LKB1-AMPK-mTOR Beclin1-Bcl-2 p53 Other mechanisms
细胞自噬的类型
Organelle-selective modes
Mitophagy : mitochondria Pexophagy: peroxisomes, Reticulophagy: endoplasmic
reticulum
selective autophagy
Physiological and Pathphysiological Roles of Autophagy
volved in certain tissue-specific functio Death
mune Response elopment and Aging
utophagy in Disease ncer urodegenerative diseases
arkinson, Huntington, Alzheimer
Half-life Discovery Nobel Prize
< 5 hours 1980 2004
>5 hours 1962 ?
E1(泛素活化酶) E2(泛素结合酶) E3(泛素-蛋白衔接酶)
比利时科学家德·迪夫
衰老的线粒体
衰老的过氧化物酶体
ekeeping mechanism involved cytoplasmic homeostasis
Identification of Atg genes and their functions.
分子病理学-课件
关键措施 1.优化操作流程 2.优选放大系统
(2) 体外酶促核酸扩增技术演进
凝胶电泳 ELISA样实验 (酶联免疫吸附) FRET方法 (荧光共振能量交换)
Real-time PCR Assay
TaqMan Adjacent Probes Scorpion Molecular beacon
一管操作 定量功能
其次，致病基因和相关基因被大量发现，并将逐步 阐明其在疾病发病学中的意义
第三，肿瘤基因诊断和基因治疗将取得突破性进展
第四，人类基因组计划实施过程中创造发明的新技 术和新方法将在病理学中广泛应用，并导致出现更 加迅猛的知识增长趋势
天每
开个
放孩
；子
有的
的花
孩期
子不
是一
菊样
花，
，有
选的
择孩
在子
秋是
B. 分子诊断应用于疾病的全过程
疾病阶段 危险度预测
早期疾病诊断 疾病分期分级
疾病随诊及监督治疗
检查目的 高危家族及一般人群中 疾病相关基因突变的携
带者 症前诊断 预后、预测因素、协助
诊断及治疗 观察个体中治疗的反应并及
时调整
C.近年来的重大技术进步
(1)原位杂交：在保证高特异性的基础上提 高敏感性天牡Biblioteka 开丹放花；，
而选
有择
的在
孩春
➢ He who falls today may rise tomorrow.
子天
是开
梅放
花；
，有
选的
择孩
在子
冬是
天荷
开花
放，
选
择
在
夏
我们，还在路上……
分子病理学
(2) 体外酶促核酸扩增技术演进
凝胶电泳 ELISA样实验 (酶联免疫吸附) FRET方法 (荧光共振能量交换)
Real-time PCR Assay
TaqMan Adjacent Probes Scorpion Molecular beacon
一管操作 定量功能
其次，致病基因和相关基因被大量发现，并将逐步 阐明其在疾病发病学中的意义
第三，肿瘤基因诊断和基因治疗将取得突破性进展
第四，人类基因组计划实施过程中创造发明的新技 术和新方法将在病理学中广泛应用，并导致出现更 加迅猛的知识增长趋势
天每
开个
放孩
；子
有的
的花
孩期
子不
是一
菊样
花，
，有
选的
择孩
在子
秋是
B. 分子诊断应用于疾病的全过程
疾病阶段 危险度预测
早期疾病诊断 疾病分期分级
疾病随诊及监督治疗
检查目的 高危家族及一般人群中 疾病相关基因突变的携
带者 症前诊断 预后、预测因素、协助
诊断及治疗 观察个体中治疗的反应并及
时调整
C.近年来的重大技术进步
(1)原位杂交：在保证高特异性的基础上提 高敏感性天牡Biblioteka 开丹放花；，
而选
有择
的在
孩春
➢ He who falls today may rise tomorrow.
子天
是开
梅放
花；
，有
选的
择孩
在子
冬是
天荷
开花
放，
选
择
在
夏
我们，还在路上……
分子病理学
分子病理学教学课件ppt
蛋白质纯化
通过色谱、电泳等技术将目的蛋 白质从混合物中分离出来。
蛋白质分析
利用质谱、光谱等技术对蛋白质的 结构、功能和相互作用进行分析。
细胞培养与转染
细胞培养
将细胞在体外进行培养，以观 察其生长和分化过程。
转染方法
利用物理、化学等方法将外源 DNA导入宿主细胞。
转染效率评估
通过分子生物学技术检测外源 DNA在细胞中的转染效率。
转录后修饰的类型
转录是基因表达的第一步，由RNA聚 合酶催化，生成RNA分子。
转录后修饰包括5'端帽子修饰、3'端 尾巴修饰及RNA剪接修饰等，这些修 饰对于RNA分子的稳定性和翻译效率 具有重要影响。
要点三
转录调控元件与疾病
转录调控元件是调节基因表达的关键 部位，其变异可导致多种疾病，如癌 症等。
THANKS
谢谢您的观看
详细描述
生物信息学方法可以用于处理和分析大规模的生物数据，如基因组学、转录组学和蛋白质组学数据等。这些方 法可以用于寻找基因变异、基因表达谱分析、蛋白质相互作用等，有助于揭示疾病的分子机制和寻找新的治疗 靶点。同时，这些方法还可以用于评估疾病的风险和预后，为临床决策提供依据。
基于干细胞与免疫细胞的分子病理学研究
自身免疫性疾病的分子病理学研究
自身免疫性疾病的病因
系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病与免疫细 胞功能异常、自身抗体产生等分子机制密切相关。
自身免疫性疾病的诊断
通过检测自身抗体、炎症因子等生物标志物，有助于早期诊断自 身免疫性疾病。
自身免疫性疾病的治疗
针对免疫细胞功能异常和自身抗体产生的分子机制，开发出免疫 抑制剂、生物制剂等新型治疗策略。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2. 染色步骤 （1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水； （2）消化暴露抗原： （3）去除内源性酶 （4）滴加适当稀释的一抗； （5）滴加适当稀释的生物素化的二抗； （6）滴加ABC复合物等三抗； （7）滴加底物显色； （8）苏木素复染核，脱水透明封片。 以上(1)-(5)之间均用缓冲液洗。
3. 结果判定 HRP-DAB: 阳性呈棕黄或棕黑色
分子病理学授 课
复习题
1 什么是分子病理学？ 常用分子病理技术有哪些？ 2 什么是免疫组织化学？ 试述免疫酶组织化学的方法和原理。
一、概论 生物高新技术——病理学中的应用 向二方面发展：
计算机和图像分析技术的应用
简单的形态描述——量化方面发展 直接观察——远程远输“间接”观察 定量病理学和远程病理学 原位杂交、原位PCR和原位末端标记技术
2）免疫组化技术 也是在蛋白水平原位检测基因表达的一种方法。
是在组织细胞原位检测抗原（或抗体）的一种方法，
2.历史 1914年，Coons等人首次用荧光素标记抗 体检测肺炎双球菌的成功，开创了免疫组 化的新时代 Sternberger改进并建立了辣根过氧化物 酶－抗过氧化物酶（PAP）技术。 80年代以后，ABC、APAAP、LSAB法 等，使免疫组化技术的应用更加广泛，成 为当今生物医学中形态、功能、代谢等综 合研究的一种有力工具。
AP-Fast red: 玫瑰红色
AP-NBT, BCIP: 紫蓝色
HRP-DAB: 棕黄或棕黑色
AP-Fast red: 玫瑰红色
4. 对照实验 （1）空白对照：一抗由 TBS 或其他无关抗体取代。 （2）阴性对照：二抗和/或三抗一抗 由 TBS或其他无关抗体取代。 （3）阳性对照：用含已知靶抗原的切片 作阳性对照。
直接法免疫荧光原理示意图
间接法免疫荧光原理示意图
4. 免疫酶组织化学
60年代初，HRP-抗体分子上，开创了酶标记抗体的 新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是HRP， 其次是AP。 （1） PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB 其灵敏度是免疫荧光法的100-1000倍 （2） ABC法: Ag→ Ab1→ Bio-Ab2→ABC→DAB （3) APAAP法: Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR （4） LSAB或SP法: Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SA DAB （AP-SA）→ （FR /NBT）
研究内容--阐明疾病的病理机理 （1）“大海捞针”式探讨单个致病基因
与疾病关系研究—人类基因组计划
（2）信号转导—疾病关系
认清疾病发生的信号转导机制
最终阐明其机制
寻求干预和防治疾病
病理学发展以方法为先导 人类科学进步的历史和学科的发展—— 以研究方法与工具创新为先导 一项新技术的创立，随之带来一批新的 研究成果
在病理学领域中
系统解剖—LM—EM—免疫组化技术
器官病理学—细胞病理学—免疫病理学
原位杂交和原位PCR技术的兴起，又将病 理学这门有着悠久历史的学科推进到分子 病理学水平
21世纪是生命科学的世纪 分子生物学是生命科学的带头学科
随着生物高新技术在病理学中应用的不断 增多，分子病理学将在此研究领域中占有 越来越重要的位置
2. 按标记物标记的部位分 直按法（一步法） 间接法（二步法） 桥联法（多步法）
目前应用最为广泛的为免疫酶法 根据三抗、酶的不同又分为 PAP法、APAAP法、BA法 ABC法、LSAB法和SP法等。
3. 免疫荧光法 已知的抗体或抗原分子标记上荧光素 与其相对应的抗原或抗体起反应 形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素 荧光显微镜下——荧光的抗原抗体结合部位 检测出抗原或抗体
四、免疫组化染色的一般注意事项 1. 内源酶的灭活及内源生物素的处理 HRP—3％的H2O2水溶液 含丰富血细胞的标本中，与H2O2产生 强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和 细胞形态。 可以用3％的H2O2甲醇液
内源性生物素的去除：
目的：正常细胞也含有生物素，尤以肝、 脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的 染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形 成亲和素(或链亲合素)-生物素复合物，导致 假阳性发生。 方法：在采用生物素方法染色前，对标本 进行亲和素处理，使其结合位点饱和。
近些年来，由于原位杂交技术、流式
细胞仪及图像分析等技术的兴起和应用，
使免疫组化引向基因水平和定量检测
形成免疫组化新的分支
杂交免疫组化和定量免疫组化。
90年代初, 原位PCR技术的诞生
免疫组化主要是用来原位PCR结果的化学
放大和显示，标志着免疫组化技术又进入
了一个新的发展阶段。
二、 方法和原理 1. 按标记物种类分: 免疫荧光法 免疫酶法 免疫铁蛋白法 免疫金法及放射免疫自显影法
直接法免疫酶组织化学原理示意图
间接法免疫酶组织化学原理示意图
NBT
HRP-DAB
AP-坚固红
ABC
LSAB
PAP APAAP
Ab2
Ab1
Bio-Ab2 Ab1
Ag
Ag
多步法免疫酶组织化学原理示意图
பைடு நூலகம்
三、免疫组织化学方法基本步骤 1. 试剂配制
（1）柠檬酸盐缓冲液 （2）TBS (Tris 缓冲生理盐水) （3） 1M Tris-HCl 缓冲液( pH 7.4 ) （4） 显色液: （5） Mayer苏木精复染液
免疫组织化学技术
一、概论：概念
二、方法和原理
三、免疫组织化学方法基本步骤
四、免疫组化染色的一般注意事项
一、概论
1. 概念： 1）免疫组织化学（immunohistochemistry） 是组织学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗 原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织原位的显 示；是免疫学与组织化学相互渗透、相互交叉而产生的 一门学科。
分子病理学水平
近些年来，尤其是纳米技术的诞生
使人们对疾病的认识达原子水平
分子病理学 从分子水平研究患病机体生命现象的科学 从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机 制的科学 分子生物学 细胞生物学 经典病理学
互相渗透、交叉
分子病理学的形成是分子生物学技术在病理 学中的应用的具体体现。
技术手段 （1） 分子免疫学+病理学乃至形态科学-— 免疫组织化学 （2）分子生物学技术 （探针；PCR；分子杂交）+形态学科 ISH、IS PCR和原位末端标记技术 (3) 生物芯片技术—组织芯片技术 (4) 纳米技术—对疾病的认识达原子水平