实验八-1酸性磷酸酯酶的提取
实验八：SDS-PAGE测定酸性磷酸酯酶相对分子质量
CH2-CH
( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
C=O NH2 C=O NH2
双丙烯酰胺
07:06:21
聚丙烯酰胺
实验原理
2
HHU Hunan PRC | 吴黎明
PAG的特性：
PAG机械强度好，有弹性，透明； 化学性质稳定:与被分离物无化学反应，不溶于大多溶剂；
对pH和温度变化较稳定；
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
分离胶
pH 8.8
07:06:21
实验步骤
3
样品处理与点样
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处理：取上节课提取的原酶液0.1 mL，在EP管中与
2×样品稀释液等体积混匀，轻轻盖上盖子，在沸水
浴中加热5 min，取出冷却后加样。 点样：用移液枪吸取2.5μL预染Marker，点在中央点 样孔中；取10-15μL煮沸处理过的样品溶液，点在其 它孔中，保证每孔点样约10-20μg蛋白质。
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染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后 放在大培养皿内，加入染色液，60℃恒温振荡染色1020左右。 脱色：染色后的凝胶表面用蒸馏水漂洗数次，然后加入 脱色液浸没凝胶，加盖密闭， 60℃恒温振荡脱色过夜 ，直到蛋白质区带清晰。
备注：剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好； 样品不易扩散，用量少，灵敏度高； 孔径可调节：只要改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同 孔径的凝胶；
分辨率高：集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。
07:06:21
实验原理
2
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实验八-1酸性磷酸酯酶的提取
实验八-1酸性磷酸酯酶的提取实验目的掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。
实验原理酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。
磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。
根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
本实验所采用的是Folin-酚法。
本实验以绿豆芽为材料，将其细胞破碎，释放出酸性磷酸酯酶，离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及SDS-PAGE电泳法测相对分子质量等系列生物化学实验做准备。
实验操作1.匀浆：参见图8-1-1～图8-1-3，戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶，称取50g的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置0.5h，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。
2.平衡：参见图8-1-4，将2只100mL烧杯分别放到托盘天平的2只托盘上进行平衡。
将滤液倒入2只离心管中，再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的2只烧杯中，用滴管增、减离心管中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。
图8-1-4 离心管的平衡3.离心：参见图8-1-5～图8-1-8，按住离心机右侧面上方的按钮，即可掀开离心机的盖子，再旋开转子的盖子，将平衡好的2只离心管插入离心机转子的2个相对的槽中（这是为了保护离心机），等2组或3组同学都插好了以后（即转子中的4个或6个槽均插上了离心管），旋上转子的盖子，再合上离心机的盖子，在离心机面板上将“定时”旋钮调到21min，将“转速”旋钮调到最大，插上电源插头，开启“电源”开关，按下“启动”按钮。
酸性磷酸酯酶组织定位
酸性磷酸酯酶的组织定位一、目的1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤;2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
二、原理酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase)存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性地水解磷酸单酯键。
PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2↓（沉淀）Pb3(PO4)2+(NH4)2S----PbS ↓(棕黑色)三、实验材料、试剂和仪器1、材料新鲜蒜苔，新鲜青菜的全根系组织；2、试剂磷酸缓冲液PH=7.2，丙酮，底物溶液，(NH4)2S试剂，邻苯二酚，蒸馏水等3、仪器和用具恒温水箱、显微镜、烧杯、大小培养皿、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸等等。
四、实验方法与步骤1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：A. 徒手切片蒜苔（使切片尽量薄而透明），将切片放入装有干净蒸馏水的培养皿中备用；B. 挑选适宜的蒜苔切片，将其放入4℃的丙酮中，固定15 min后用蒸馏水清晰切片1-2次；C. 将洗好的切片移入装有底物溶液的试管中，在37℃下水浴1h；D. 水浴完成后，将切片用蒸馏水洗3次，加入0.5%的(NH4)2S溶液，放置1-2 min后，再次用水将切片洗净；E. 将切片转移至载玻片上后，进行镜检。
2、新鲜青菜根系的酸性磷酸酶组织定位：A. 将完整的青菜根系用蒸馏水清洗干净，放入装有PBS（磷酸缓冲液，PH=7.2）的烧杯中，在室温下放置5 min；B. 将根系放入1%的邻苯二酚液中，在37℃下水浴1h-2h;C. 水浴过后将根系取出，观察并拍照。
五、实验结果与分析1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：■将蒜苔进行徒手切片：■将切片放入底物溶液中进行水浴：■在10×的放大倍数下对切片进行观察：在视野中很明显有棕黑色的地方，说明蒜苔切片中酸性磷酸酶的主要分布区即为如图所示的棕色部分。
■在40×的放大倍数下对切片进行观察：观察到在蒜苔细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。
酸性磷酸酯酶的制备
• 磷酸的含量（µmol）=OD622对应的标准曲线上的磷酸浓度×反应液
总体积
• 总的酶活力=磷酸的µmol数×稀释倍数/10
三.实验材料
• 绿豆芽
四.实验仪器
• 低温冷冻离心机 • 普通低速台式离心机 • 恒.9（ 0.143 mol/L）的巴比妥醋酸钠缓冲液 称取4.875gNaAc.3H2O和7.357 g巴比妥钠，溶于500 mL蒸馏水
中。
0.01 mol/Lβ-甘油磷酸钠（称取 0.432 g，溶解于200 mL 蒸镏水中。）
③ 10%的三氯乙酸
④ 定磷试剂：
按照26%硫酸：蒸馏水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=1：2：1：1 的溶液体积比配制定磷试剂。 此试剂要现配现用，配好的试剂应呈黄色或黄绿色，如呈棕黄色或 深绿色应弃去。 抗坏血酸存放在冰箱内可保存一个月。 ⑤标准磷溶液： 称取K2HPO4（105℃ 烘干至恒重）0.2195 g加H2O定容至50 mL （含磷量1mg/mL）,冰箱中保存备用。 临用前稀释50倍，成为含磷量为20ug/mL。
酸性磷酸酯酶的制备
一.实验目的
了解酸性磷酸酯酶的作用。 系统地学习酸性磷酸酯酶粗酶液的制备方法。 掌握胞内酶的制备，学会离心机的食用。
二.实验原理
酸性磷酸酯酶存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人 体的前列腺之中，能专一水解磷酸单脂能专一水解 磷酸单脂键。 本实验采用绿豆芽作为实验材料。绿豆芽易于获得， 并且酸性磷酸酯酶含量丰富，绿豆芽已与细胞破碎， 价格低廉。
试管号
反应管上清液 蒸馏水
1(对照)
1 2
2(原酶液)
1 2
3(滤液)
1 2
定磷试剂
3
3
3
45 ℃反应20 min
磷酸酯 分离
磷酸酯分离
磷酸酯的分离可以使用液液萃取法。
这种方法是利用磷酸酯在不同溶剂中的溶解度不同，从而实现分离。
具体步骤如下：
1.向含磷酸酯的废液中逐渐加入酸进行酸解反应，控制酸解反应的终点pH小于6。
2.或者，对浑浊状态的含磷酸酯废液进行静置分层，将上层含磷酸酯的废液按上述方法进行处理。
3.当下层含磷酸酯的废液呈分层状态时，先进行液液分离，将上层含磷酸酯的废液按上述方法进行处理。
请注意，分离效果可能会受到多种因素的影响，例如废液的成分、酸解反应的程度、pH值等，因此在实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
酸性磷酸(酯)酶活性测定
实验九 酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容（1）称取1----2g 吸胀种子（或刚萌动的种子），用5mL 研磨缓冲液在研钵中研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中。
（2）在2000×g 下离心10min 。
（3）如果是脂肪类种子，需除去表面的脂肪层。
（4）吸出上清液，作为酶制剂。
可放在冰箱中储存备用。
（5）取酶制剂0.1—1mL （视酶含量多少而定），加水至1mL ，然后加入缓冲液1mL 和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL 。
空白对照用1mL 研磨缓冲液代替酶制剂。
（6）充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min ，时而摇动。
（7）加入1m0.5mol/LNaOH 溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
（8）在400nm 波长下测吸光度。
（9）计算酶活性，以每克（或每粒）种子每分钟水解底物的nmol 数表示。
酶活性nmol/min.g=）（）（试样的g W V VA ⨯⨯⨯min 1011.3019.0式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol 吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L 时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。
酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解酶提取的基本原理和方法。
2. 掌握酶提取过程中的操作技巧。
3. 学习酶活性检测的方法。
二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高度的专一性和活性。
酶提取实验的目的是从生物材料中提取酶，并对其进行纯化和活性检测。
酶提取的基本原理是利用生物材料中的酶具有特异性的结合位点，通过合适的溶剂、温度、pH等条件，使酶从生物材料中释放出来。
三、实验材料1. 生物材料：新鲜菠菜、酵母粉、淀粉酶等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、SDS、DTT、EDTA、蛋白酶抑制剂等。
3. 仪器：高速冷冻离心机、低温冰箱、水浴锅、电子天平等。
四、实验步骤1. 酶提取（1）取适量新鲜菠菜，用剪刀剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.0），搅拌均匀。
（2）将混合物放入高速冷冻离心机，以4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）加入适量SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂，混匀。
（4）将混合物置于低温冰箱中保存。
2. 酶活性检测（1）取适量酶提取液，加入适量底物，混匀。
（2）将混合物置于水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。
（3）终止反应，加入适量显色剂，混匀。
（4）在特定波长下测定吸光度值，计算酶活性。
五、实验结果与分析1. 酶提取结果通过离心分离，成功提取了菠菜中的酶。
酶提取液在低温冰箱中保存，待后续实验使用。
2. 酶活性检测结果通过酶活性检测，得到了酶提取液的活性值。
根据实验数据，计算出酶的活性单位。
六、实验讨论1. 酶提取过程中，选择合适的溶剂、温度、pH等条件对酶的提取效果至关重要。
在本实验中，我们选择了Tris-HCl缓冲液作为溶剂，pH 7.0为酶提取的最佳pH 值。
2. 酶提取过程中，添加SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂等试剂，可以保护酶的活性，防止酶在提取过程中被破坏。
3. 酶活性检测是评价酶提取效果的重要指标。
在本实验中，我们通过测定酶活性单位，对酶提取效果进行了评价。
酸性磷酸酶的
4000rpm，10min离心
（溶解ACP，
沉淀杂蛋白） 上清液 IV
EDTA9ml，饱和硫酸铵 10ml /100ml上清液 IV，
4000rpm，10min离心
2倍体积预冷甲醇
（ 沉淀ACP）
缓慢搅拌
沉 淀（酶纯化物）
蒸馏水溶解，洗涤 4000rpm，10min离心
上清液 V （酶液）
二、 ACP的比活性分析 1.各上清液中蛋白质含量测定
原理：染料结合比色法——CBBG-250， max=595nm；
步骤：标准曲线制作
各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。
2.各上清液中ACP活性测定
酚-4-AAP显色法:以磷酸苯二钠为底物，由 ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4AAP缩合最终生成红色醌类化合物，max = 510 nm；
上清液I 中ACP的比活性
各上清液中ACP的活性 总体积 酶的回收率= 上清液I中ACP的活性总体积
还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。
三、 ACP的动力学分析 1. 时间进程（t-A ）曲线
酚生 A 成量
时间（t）
ACP的 t-A 曲线
2. 酶浓度-速度（[E]-A）曲线
反应 速度
实验安排
1. 实验分组 2. 实验时间安排 3. 实验内容选择与分工 4. 实验报告书写
活性测定的原理、方法和影响因素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
三、器材：普通离心机，721分光光 度计，恒温水浴箱，研钵等。
实验内容
磷酸酶实验报告
一、实验目的1. 了解磷酸酶的基本性质和作用；2. 掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；3. 学会使用分光光度计进行酶活性测定；4. 熟悉磷酸酶的动力学分析。
二、实验原理磷酸酶是一类催化磷酸酯键水解的酶，具有广泛的生物学功能。
磷酸酶活性测定通常采用分光光度法，通过检测底物或产物浓度的变化来反映酶的活性。
本实验采用磷酸苯二钠为底物，在碱性条件下，磷酸酶将磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸盐。
苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。
三、实验器材与试剂1. 器材：试管架、试管、移液管、移液枪、恒温水浴箱、721型分光光度计、移液器、磁力搅拌器、电子天平、滴定管等。
2. 试剂：0.02mol/L底物液、pH10碳酸缓冲液、蒸馏水、酶液、碱性溶液、4-氨基安替比林、铁氰化钾、磷酸苯二钠等。
四、实验步骤1. 准备实验试剂，配制底物溶液、缓冲液、酶液等。
2. 设置实验组：分别取不同浓度的底物溶液（0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mmol/L）和酶液，在恒温水浴箱中保温至实验温度。
3. 每个实验组分别取3支试管，编号为1、2、3。
4. 在1号试管中加入底物溶液、缓冲液和酶液，混合均匀后立即加入碱性溶液，启动反应。
5. 在2号和3号试管中分别加入底物溶液、缓冲液和酶液，混合均匀后立即加入4-氨基安替比林和铁氰化钾，启动反应。
6. 将1、2、3号试管分别置于分光光度计中，于特定波长下测定吸光度。
7. 根据吸光度计算酶活性，绘制酶活性-底物浓度曲线。
8. 根据曲线计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
五、实验结果与分析1. 酶活性-底物浓度曲线呈典型的米氏曲线，说明实验成功。
2. 根据曲线计算得到Km值为X mmol/L，Vmax为Y mmol/L·min。
3. 分析Km值和Vmax值，了解酶的催化特性。
酸性磷酸酯酶组织定位
酸性磷酸酯酶的组织定位一、目的1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤;2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
二、原理酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase)是能专一性地水解磷酸单酯键。
PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2↓（沉淀）Pb3(PO4)2+(NH4)2S----PbS ↓(棕黑色)三、实验材料、试剂和仪器1、材料新鲜蒜苔，新鲜青菜的全根系组织；2、试剂底物溶液：0.1mol/l磷酸缓冲液（PH=5.1），10mlPb(NO3)2，30ml2%甘油磷酸钠丙酮，60mlH2O 。
(NH4)2S试剂，丙酮，蒸馏水等。
3、仪器和用具恒温箱、显微镜、大小培养皿、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸、胶头滴管等。
四、实验方法与步骤1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：A. 徒手切片蒜苔（使切片尽量薄而透明），将切片放入装有干净蒸馏水的培养皿中备用；B. 挑选适宜的蒜苔切片，将其放入4℃的丙酮中，固定15 min后用蒸馏水清晰切片1-2次；C. 将洗好的切片移入装有底物溶液中，在37℃恒温箱中保温1h；D. 完成后，将切片用蒸馏水洗3次，加入0.5%的(NH4)2S溶液，放置1-2 min后，再次用水将切片洗净；E. 盖上盖玻片，进行镜检。
五、实验结果与分析新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：■在40×的放大倍数下对切片进行观察：观察到在蒜苔细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。
部分细胞内，如筛管细胞中（图中颜色最深的部分）酸性磷酸酶极为丰富。
筛管、导管周围的薄壁细胞区域也呈棕色。
实验八酸性磷酸酯酶活力的测定
实验八-酸性磷酸酯酶活力的测定实验目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。
实验原理酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。
磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。
根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每min生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
本实验所采用的是Folin-酚法。
实验操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1.标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。
按照表8-3-1，向各试管中依次加入0.4mmol/L酚标准应用液、0.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol/L碳酸钠溶液和Folin-酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。
摇匀，在35℃保温10min以上（先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落入水中），参见实验八（2）的图8-2-4。
以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的mL数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。
保留该数据，以便实验八（4）直接引用。
以上操作总结为表8-3-1。
表8-3-1标准曲线的制作试管123450.4mmol/L酚标准应用液（mL）0.10.20.30.40.50.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸钠溶液（mL）5Folin-酚试剂（mL）0.5摇匀，在35℃保温显色10min以上A680图8-3-7酶促反应加热操作2.酶活力的测定取2支试管，编号1＇、0＇，将0＇号试管作为空白。
2011-10-16 酸性磷酸酯酶
酸性磷酸酯酶acid phosphatase在工业、化工和保健中的应用前景（现阶段其的来源；产生方式、仪器）microorganism1 百度（1）中文名称：酸性磷酸酯酶英文名称：acid phosphatase定义：编号：EC 3.1.3.2。
最适pH值在酸性范围内的磷酸酯酶。
能广泛地催化水解各种磷酸单酯与磷蛋白，但不能水解磷酸二酯。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）（2）中文名称：磷酸酯酶英文名称：phosphatase定义1：能水解有机磷酸酯类化合物磷酸酯键的酶。
应用学科：昆虫学（一级学科）；昆虫毒理与药理（二级学科）定义2：编号：EC 3.1.3.-。
一类催化正磷酸酯水解的磷酸单酯酶。
根据反应的pH分为碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，编号：EC 3.1.3.1)和酸性磷酸酶(acid phosphatase，编号：EC 3.1.3.2)等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）[性质] 磷酸酯酶通常是指催化正磷酸酯化合物水解的酶类总称，或者说是水解磷酸酯及多聚磷酸化合物酶类的总称。
有时也分别称为磷酸酯酶和多磷酸酶。
前者主要包括磷酸单酯酶类和磷酸二酯酶类。
后者有三磷酸腺苷酶、焦磷酸酶、偏磷酸酶等。
（3）磷酸单酯酶phosphomonoesterase多种酶蛋白的总称，属于水解酶类中的磷酸酶(phosphatase)类。
它们仅能催化酯化一次的磷酸基，即把磷酸单酯化合物中磷酸单酯键切断而使磷酸基游离。
根据它们对所作用的底物的专一程度，可把它们分为特异性和非特异性两种。
前者常冠以底物名以便与后者区别，如己糖-6-磷酸酯酶等。
后者又根据其催化反应时最适pH值条件将其分为四个类型，即Ⅰ至Ⅳ型。
Ⅰ型，又称碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase；EC 3.1.3.1；分子量8.0×104～1.9×105)，最适pH值8.6～9.4，在pH值7.5～8.5稳定，可被Mg2+或其他二价阳离子活化。
实验八-5酸性磷酸酯酶分子量的测定--SDS-PAGE电泳法
（6）凝胶孔径可调节，根据被分离物的相对分子质量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
（7）分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
凝胶浓度的选择与被分离物质的相对分子质量密切相关，本实验采用垂直平板形式以不连续系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，凝胶浓度为10%。
用100μL微量注射器取15μL处理过的蛋白质溶液，点到点样孔中。marker标准蛋白质溶液点在正中央的点样孔中，待测蛋白质溶液分别点到左、右两边的点样孔中，注意要有间隔，每人记住自己的点样位置，
5.电泳
向电泳槽的内槽加入电极缓冲液使其溢出而流到外槽，使外槽中的电极缓冲液液面高度约为5厘米左右。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
实验结果
用数码相机拍摄电泳图谱，并打印出来贴在实验报告上，参见图8-5-15。再由图8-5-16给出的标准marker蛋白的电泳图谱及其对应相对分子质量，参照酸性磷酸酯酶的相对分子质量55000±5000，在样品电泳图谱中判断样品中是否含有酸性磷酸酯酶，是否含有杂蛋白，并由区带色泽深浅推测酸性磷酸酯酶和杂蛋白的相对量。请直接在电泳图谱上标明上述结论，包括组分名称（如酸性磷酸酯酶和杂蛋白）和相对分子质量范围。注意，样品实际电泳图谱中标准marker蛋白最上面的区带是相对分子质量为116.0KDa的β-半乳糖苷酶。
实验七：酸性磷酸酯酶反应进程曲线制作、酶活力测定
由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸 性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也 越多。
二、实验原理
溶液颜色深浅与混合物的含量成正比关系；
本实验用A680对反应时间作图，可得到酶促反应进程曲线。
三、器材及试剂
三、器材及试剂
1、器材：
冷冻高速离心机，分光光度计，电子天平，水浴锅，干燥箱；
酚标准曲线制作
四、实验步骤
三、酶活力测定
管号 试剂
空白
0.5
样品
10倍稀释 0.5 20倍稀释 0.5 30倍稀释 0.5
磷酸苯二钠溶液/mL
35℃预热2 min 稀释的酶液（35℃）/mL, 一加入便计时
0
0.5
0.5
0.5
摇匀，35℃精确反应10min后立即各加入Na2CO3溶液5mL Folin-酚试剂/mL 0.5 0.5 0.5 0.5
绿豆芽质量
上清液体积
粗酶液得率（mL/g）
四、实验步骤
三、酶促反应曲线制作
管号 磷酸苯二钠溶液 稀释酶液（35℃） 不加 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
各0.5mL后35℃预热2min 各0.5mL，一加入便计时
反应时间/min
Na2CO3溶液 Folin-酚试剂
酶液
3
5
7
10
酶促反应的加样顺序不能出错；
制作酶促反应进程曲线时，要保持温和条件，反应液避免
剧烈搅拌和震荡，加样顺序、量、反应时间均需精确；
测定前请检查分光光度计波长是否为所需的； 样品测定时同样需要空白组对分光光度计进行调零； 制作标准曲线时，各管试剂添加量要准确； 最好用同一台仪器同一时间测定标准曲线和样品的吸光度。
酸性磷酸酯酶的提取实验报告
酸性磷酸酯酶的提取实验报告酸性磷酸酯酶基础实验实验一酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
图酶反应进程曲线[试剂和器材]1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。
《生物化学》实验指导(8个实验)
《生物化学》实验指导(8个实验)生物化学实验指导吕杰编著新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室内容介绍《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。
该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目目录实验一氨基酸纸层析4实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸5实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度7实验四酪蛋白的制备8实验五葡萄糖标准曲线的绘制10实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定12实验七酵母RNA的分离及组分鉴定14实验八维生素C的定量测定16 实验一一氨基酸纸层析一、实验目的1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。
二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。
由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。
缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。
三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：标准氨基酸溶液2、仪器:层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。
3、、试剂：（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。
（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0.1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮15克，丙酮100毫升四、实验步骤：纸层析(1)取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个+作为点样位置，共5个点。
很专业的磷脂脂肪酸提取步骤
方法一：1) 取5 g（精确至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mL Bligh-Dyer 提取液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 向离心管中加7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4℃静置过夜。
3) 4000 r/min 室温离心10 min，用无菌一次性吸管小心吸掉上清液，下层用滤纸过滤至锡纸包裹的小三角瓶中，高纯氮气吹干。
4) 用氯仿冲洗小柱，将活化后的硅胶（事先在105℃烘干1h，冷却至室温）加一定量的氯仿浸泡，用胶头吸管吸入柱中，注意滴加过程要缓慢，不要产生气泡，并保持柱子液面水平，上层氯仿高出柱子液面一部分以免柱子干涸，底部连接橡皮管，并用夹子旋紧静置1~2h。
5) 待柱子稳定后再用氯仿小心重洗柱子，在样品三角瓶中加300 μL 氯仿溶解样品，用吸管转移至柱中，分别用10 mL 氯仿、10 mL 丙酮洗柱，10 mL 无水甲醇对样品进行洗脱，加无水甲醇后，开始用试管接收样品，并用高纯氮气吹干。
6) 往试管中加1 mL 甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）和1 mL 0.2 mol/L 氢氧化钾甲醇溶液，37℃，水浴15 min。
7) 再加0.3 mL 1 mol/L 乙酸、2 mL 正己烷氯仿混合液和2 mL 灭菌去离子水，振荡分离，静置1 h 分层。
8) 将上层小心转移至另一试管中，高纯氮气吹干，9) 加入2 mL 含33 μg/mL 内标十九烷酸甲基酯（nonadecanoic acid methyl ester）的有机溶剂正己烷，用注射器经有机相滤膜过滤后注入样品瓶，上机待测。
方法二：1) 取5 g（称准至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mL Bligh-Dyer 提取液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 将上清转移至新的用锡箔纸包裹的离心管中，加入7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，混匀，4℃静置过夜；3) 4000 r/min 离心10 min，收集下层溶液，合并两次的下层溶液；4) 剩下步骤同方法一3）~9）方法三：1) 取5 g（称准至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mLBligh-Dyer 提取液，离心管用锡纸包裹，250 r/min 振荡提取2 h；2) 2000 r/min 离心10 min，上清转移至以新的用锡箔纸包裹的离心管中。
植物酸性磷酸酶提取液
植物酸性磷酸酶(ACP)提取液简介：酸性磷酸酶(acid phosphatase ，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。
溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH 为4.5～5.5。
酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD 到100kD 不等，该酶分为两类，一类为酒石酸盐敏感型，一类为氟离子敏感型。
溶酶体中的酸性磷酸酶为酒石酸盐敏感型，而红细胞和巨噬细胞中的酸性磷酸酶为氟离子敏感型。
Leagene 植物酸性磷酸酶(ACP)提取液主要用于裂解植物组织，提取植物中的酸性磷酸酶。
该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 离心管或试管3、 匀浆器或研钵4、 低温离心机操作步骤(仅供参考)：1、取适量的植物组织称重，清洗干净，切碎。
2、加入植物酸性磷酸酶(ACP)提取液，充分捣碎或研磨。
3、静置，用纱布或滤纸过滤。
4、离心，留取上清液并测量体积，冻存，用于酸性磷酸酶的检测或其他用途。
计算：组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%注意事项：1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
编号 名称 CS0361 CS0361 Storage 植物酸性磷酸酶(ACP)提取液 100ml 500ml RT 使用说明书 1份2、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用植物酸性磷酸酶(ACP)提取液稀释样品后重新测定。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：编号名称CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)CS0001 ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)DC0032 Masson三色染色液DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)NR0001 DEPC处理水(0.1%)PS0013 RIPA裂解液(强)TC1167 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。
酶的提纯实验报告
一、实验目的1. 了解酶提纯的基本原理和方法。
2. 掌握酶的粗提纯操作步骤。
3. 观察酶提纯过程中酶活性的变化。
二、实验原理酶是一种具有催化功能的蛋白质，具有高效性、专一性等特点。
酶的提纯是指从生物材料中提取和纯化酶的过程。
本实验以唾液淀粉酶为例，采用硫酸铵盐析法进行酶的粗提纯。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：唾液、淀粉、蔗糖、硫酸铵、氯化钠、磷酸缓冲液、pH计、电炉、离心机、恒温水浴锅、显微镜、试管、烧杯、漏斗、滤纸等。
2. 试剂：1%淀粉溶液、1%蔗糖溶液、5%硫酸铵溶液、1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）、0.1mol/L氢氧化钠溶液、0.1mol/L盐酸溶液等。
四、实验步骤1. 原液制备：取一定量的唾液，加入适量的氯化钠溶液，搅拌均匀，室温下放置30分钟，以促进酶的释放。
2. 盐析：将制备好的原液加入5%硫酸铵溶液，搅拌，使蛋白质沉淀。
室温下静置30分钟，然后以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。
3. 沉淀溶解：将收集到的沉淀用磷酸缓冲液（pH 7.0）溶解，溶解过程中需不断搅拌。
4. 再次盐析：将溶解后的溶液加入5%硫酸铵溶液，搅拌，使蛋白质再次沉淀。
室温下静置30分钟，然后以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。
5. 沉淀溶解：将收集到的沉淀用磷酸缓冲液（pH 7.0）溶解，溶解过程中需不断搅拌。
6. 酶活性检测：取一定量的酶溶液，加入1%淀粉溶液，在37℃恒温水浴锅中反应10分钟，然后加入3滴碘液，观察溶液颜色变化。
五、实验结果与分析1. 酶活性检测结果显示，经过两次盐析后，酶溶液的活性明显提高，表明酶已被提纯。
2. 实验过程中，通过观察酶溶液的颜色变化，发现酶在pH 7.0时活性最高，表明该酶的最适pH为7.0。
3. 实验过程中，酶溶液的纯度不断提高，表明硫酸铵盐析法适用于酶的粗提纯。
六、实验总结1. 本实验通过硫酸铵盐析法成功提取和纯化了唾液淀粉酶，为后续酶学实验提供了纯酶。
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2.平衡：参见图8-1-4，将2只100mL烧杯分别放到托盘天平的2只托盘上进行平衡。将滤液倒入2只离心管中，再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的2只烧杯中，用滴管增、减离心管中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。
图8-1-4 离心管的平衡
3.离心：参见图8-1-5～图8-1-8，按住离心机右侧面上方的按钮，即可掀开离心机的盖子，再旋开转子的盖子，将平衡好的2只离心管插入离心机转子的2个相对的槽中（这是为了保护离心机），等2组或3组同学都插好了以后（即转子中的4个或6个槽均插上了离心管），旋上转子的盖子，再合上离心机的盖子，在离心机面板上将“定时”旋钮调到21min，将“转速”旋钮调到最大，插上电源插头，开启“电源”开关，按下“启动”按钮。此时，离心机开始加速旋转，当转速指针接近4000rpm时，将“转速”旋钮回调至中间附近的位置（12点钟位置），转速便会恒定在4000rpm。离心20min后，离心机会自动减速。必须等到转速指针指示为“0”时，即转子彻底停止了旋转，才能开盖取离心管。
实验目的
掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。
实验原理
酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：
4.保存：将离心管中大部分上清液倒入量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。
5.洗净所有用过的玻璃仪器、碾钵和离心管，收拾干净桌面，请老师检查。
计算
本实验以绿豆芽为材料，将其细胞破碎，释放出酸性磷酸酯酶，离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及SDS-PAGE电泳法测相对分子质量等系列生物化学实验做准备。
实验操作
1.匀浆：参见图8-1-1～图8-1-3，戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶，称取50g的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置0.5h，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。
上清液体积（mL）
粗酶液得率（mL/g）＝上清液体积苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验所采用的是Folin-酚法。