实验六 酸性磷酸酶的显示
酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶是一种酶类物质，它在人体细胞内起着重要的催化作用，并具有重要的调节作用。
因此，在许多疾病的诊断中，检测酸性磷酸酶的活性和浓度是非常重要的。
以下是关于酸性磷酸酶的显示方法的中文介绍。
常见的酸性磷酸酶显示方法包括酶活力测定、基础染色和免疫染色等。
这些方法可以通过不同的化学试剂和仪器设备来实现，从而得出酸性磷酸酶的活性和浓度。
2. 酶活力测定法
酶活力测定法是用于检测酸性磷酸酶活性的一种方法，其原理是通过一系列的化学反应来形成可测定的产物。
这种方法通常使用p-nitrophenyl phosphate（pNPP）作为酶活力测量底物，它可以转化为p-nitrophenol。
测量产生的p-nitrophenol的光密度可以用于计算样品中酸性磷酸酶的活性。
3. 基础染色法
基础染色法是通过将酸性磷酸酶活性产生的颜色染到细胞和组织切片上来显示酸性磷酸酶的分布和浓度。
这种方法使用基础染料如甲基绿、苏木精、尤红和新绿等来染色，然后通过显微镜观察染色后的细胞和组织切片来判断样品中是否含有酸性磷酸酶。
免疫染色法是通过使用抗体来检测酸性磷酸酶的存在和浓度的方法。
该方法使用细胞和组织切片，将其与具有特异性抗体的二抗结合，然后用荧光素或酶标记的标记剂来标记结合的二抗。
最终，通过荧光显微镜或酶标的方法来检测抗体与酸性磷酸酶的结合情况。
总结：。
实验六酸性磷酸酶的显示剖析
1. 熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及 操作步骤。
2. 观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
实验原理：
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基。 在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成 磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化 铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能 显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
实验步骤
颈椎脱臼处死小鼠。
实验步骤
吸取少量腹腔液，在玻片上涂片滴置于 冰盒中，滴加 适量ACP作用 液，37℃作用 30分钟。取出 后，蒸馏水漂 洗。用10%甲 醛钙溶液后固 定5min。
实验步骤
玻片入2%硫化 胺溶液作用2～ 3min，进行显色。 取出后蒸馏水漂 洗，镜检。
实验作业
绘图表示酸性磷酸酶在细胞中的分布情况； 说明阴性对照在实验中的作用。
对照实验
对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠， 而以蒸馏水代替；或入作用液前先用高温 （50℃）处理30min，使酶失去活性，作 好标记，然后同时进行上述实验 。
实验结果
巨噬细胞的细胞质 中，出现许多棕色或 棕黑色的颗粒和斑块。 部分细胞内，酸性磷 酸酶极为丰富。整个 细胞质区域都有黑色 沉淀。中性粒细胞呈 现阴性反应。
实验用品
1. 器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、 载玻片、盖玻片
2. 试剂：10%中性福尔马林；姬姆萨染液； 6% 淀 粉 溶 液 ； ACP 作 用 液 ； 2% 硫 化 铵溶液
3. 材料：小鼠腹腔液涂片
实验步骤
免疫动物：实验 前4～6天用无菌 注射器取已灭菌 的6%淀粉溶液 1ml注射于小鼠 腹腔内，每天一 次。
实验原理：
酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP） 主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。在 溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP 活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件 下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性， 底物可以渗入，酶活力被显示。
实验八、巨噬细胞酸性磷酸酶显示资料讲解
作业
1、比较对照标本与正常处理标本结果的不同 2、比较吞噬活性强的大体积巨噬细胞和吞噬活
性弱的小体积巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活 性
蒸馏水
0．2mol／L醋酸缓冲液(pH4．6)
5％硝酸铅 3.2％β—甘油磷酸钠
90ml
12ml
2ml 4ml
配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份， 一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者 缓缓混合，边混边搅匀。 若pH不到5．0，可加少量醋酸的调整。 注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用 前配制，不能贮存。
附：0．2mol／L醋酸缓冲液（pH4．6）配制方法
0.2mol/l醋酸（ml） 25.5
0.2mol/l醋酸钠（ml）24.5
4、1％硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml
5、姬姆萨染液（1：30）
姬姆萨原液
3滴
磷酸盐缓冲液（pH6．8） 5ml
实验方法
1、巨噬细胞诱导：实验前2天开始，每日向小鼠腹腔注射6 ％淀粉肉汤1ml，连续注射3天。
酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存 在，而不是酶的本身。
将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液 中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物， 它再与某种捕捉剂相反应，形成显微镜下可视 性沉淀，即最终反应产物。
4．核酸显示法
显示DNA的传统方法为Feulgen反应。
切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解, 其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的 键打开,使脱氧核糖的一端形成游 离的醛基,这些醛基在原位与 Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶 液)反应,形成紫红色的化合物,使 细胞内含有DNA的部位呈紫红色 阳性反应.紫红色的产生,是由于反 应产物的分子内含有醌基,醌基是 发色团,因此具有颜色.
酸性磷酸酶工作液
【实验材料】
一、 材料：小白鼠 二、 器材：显微镜、恒温水浴锅、注射器、盖玻片、
载玻片、剪刀、镊子、酒精灯 三、 试剂：6%淀粉肉汤、0.85%生理盐水、酸性磷酸
酶工作液、福尔马林、钙固定液、2%硫化铵溶液、 甘油明胶封固剂
6%淀粉肉汤：称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g加入到100ml蒸馏水中 溶解，再加入可溶性淀粉6g，温浴溶解，煮沸15分钟灭菌，置4C冰箱中保存， 使用时水浴融化。 0.85%生理盐水：称取8.5gNaCl溶于1000ml蒸馏水中。 酸性磷酸酶工作液： ① 0.05mol/L醋酸缓冲液：先用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中 均匀混制成0.2mol/L的醋酸液（A液），再称取醋酸钠（NaAc·3H2O）2.72g溶于 100ml蒸馏水中配成0.2mol/L的醋酸钠溶液（B液）。取A液30ml加B液70ml混匀即 成0.05mol/L醋酸缓冲液，置4C保存。 ② 3%β-甘油磷酸钠溶液：称取β-甘油磷酸钠3g溶于100ml蒸馏水中，4C保存。 ③ 工作液：临用时，称取硝酸铅25mg,溶于22.5ml的0.05mol/L醋酸缓冲溶液中， 待全部溶解后，再缓慢地滴加入3%的β-甘油磷酸钠液2.5ml，同时快速搅动，防止 产生絮状物。 福尔马林·钙固定液：先称取无水CaCl2 10g溶于100ml蒸馏水中配成10%氯化 钙溶液，取该液10ml加入到80ml蒸馏水混匀，即成福尔马林·钙固定液。 2%硫化铵：量取2ml硫化铵加入到98ml蒸馏水中，现配现用。 甘油明胶封固剂：称取明胶7g加入42ml蒸馏水中，水浴加温溶解，再加入 50ml甘油并搅匀，另加少许麝香草酚作防腐剂，置4C贮存，使用水浴加温融 化。
【实验内容】
1、取20g左右小白鼠一只，每日往其腹腔注射6%淀粉肉汤1ml，连续 三天。
酸性磷酸酶活性测定方法
实验九 酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容（1）酶液提取。
称取1g 样品，用5mL 研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm 下离心10min 。
吸出上清液，即为酶粗提液。
可放在冰箱中储存备用。
（2）活力测定。
取酶液0.1—1mL （视酶含量多少而定），加水至1mL ，然后加入缓冲液1mL 和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL 。
空白对照用1mL 研磨缓冲液代替酶制剂。
充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min ，时而摇动。
10min 后，加入1m0.5mol/LNaOH 溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
在400nm 波长下测吸光度A 。
（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol 数表示。
酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的g W V V A ⨯⨯⨯min 1011.3019.0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol 吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L 时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol 化为nmol 乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。
细胞生物学实验
细胞生物学实验讲义河池学院化生系生物教研室2011年3月目录1.细胞生物学实验简介2.实验一细胞膜的通透性观察3.实验二植物细胞骨架的观察4.实验三线粒体的超活染色与观察5.实验四细胞融合6.实验五叶绿体的分离与观察7.实验六酸性磷酸酶的显示方法8．实验七联会复合体的染色与观察9．实验八死、活细胞鉴别10.附录：生物绘图法细胞生物学实验简介细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。
目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。
本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向本系生物专业本科生进行讲授。
实验一细胞膜的通透性观察一、实验目的1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2.了解溶血现象及其发生机制。
二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。
各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
渗透作用是细胞膜的主要功能之一。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。
因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。
本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。
铅法—显示酸性磷酸酶
混合液，4℃，2～5min
步骤：
① 将标本放于下列孵育液中 37℃， 10～15′
孵育液： 0.1M醋酸缓冲液，PH5.2 0.24％硝酸铅 15ml 15ml
3％β—甘油磷酸钠
3 ml
33ml
混匀，置37℃水浴中15～30分钟后，过滤。
② 于37℃蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温蒸馏水洗）
③ 入5％硫化胺，1～2分钟。 ④ 流水冲洗3～5分钟后，换蒸馏水。（可用Mayer苏木素复染核）
铅法——显示酸性磷酸酶
姜富祥 研究生学院 2010071
铅法——显示酸性磷酸酶
〔原理〕
以β—甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被
ACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅 沉淀。在被S2-置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。反 应式如下： ★ 酸性磷酸酶Acid Phosphatas（ACP）
ACP的特性 ① PH 4.5～5.5适宜 ② 激活剂：Mn2+ ③ 抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石
酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。
〔ACP定位〕 ① 溶酶体（颗粒状）内； ② 溶酶体外ACP存在于ER和胞液。 ③ 该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、
肾上腺。
〔方法〕
标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6
微米。 固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可 用甲醛，但影响活性。 本实验不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）
⑤ 用甘ห้องสมุดไป่ตู้明胶或Apathy氏糖胶封固。
〔结果〕酶活性部位→棕黑色硫化铅沉淀。 分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细 胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。 〔对照〕孵育液内加0.01M NaF（13.9mg / 33ml）→ （—） 〔注意事项〕 ① 铅离子的浓度 →关键问题，没有底物，有 些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF 抑制酶活性→排除假阳性反应。 ② 孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。
植物组织中酸性磷酸酶与多酚氧化酶的组织定位
植物组织中酸性磷酸酶与多酚氧化酶的组织定位一、实验目的（1）熟悉酸性磷酸酯酶与多酚氧化酶的功能；（2）掌握两种酶的组织定位方法及原理（3）观察酸性磷酸酯酶与多酚氧化酶在植物组织中的分布。
二、实验原理通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅沉淀物。
但因其是无色的，需再经过与硫化铵作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布；PO43-+Pb2-→ Pb3(PO4)2 ↓（沉淀）；Pb3(PO4)2+(NH4) 2S→PbS(棕黑色)↓邻苯二酚在多酚氧化酶的作用下生成褐色的邻苯二醌，通过显微镜观察褐色的部分即为多酚氧化酶在组织中的位置。
三、实验材料与实验试剂材料与仪器：玉米根，甘蓝叶，蒜苔，显微镜；冰箱；保温箱试剂：底物溶液；丙酮；0.5% (NH4) 2S溶液；PH 7.2 磷酸缓冲液；1%邻苯二酚。
四、实验步骤1、酸性磷酸酶（酯酶）的组织定位（1）取完整根系或叶片的表皮；（2）将材料放置在冰冻的丙酮中，固定15min之后用水冲洗1~2次；（3）将固定好的材料移入底物液中，37℃，反应1h；（4）将上述材料移入0.5%(NH4)2S中年浸泡1~2min;（5）将材料做成切片，在显微镜下观察，被染成黑色部位即多酚氧化酶作用的部位。
2、多酚氧化酶的组织定位（1）取完整根系或叶片的表皮；（2）滴一滴PH7.2的磷酸缓冲液，在冷藏室中放置5min;（3）将上述材料移入1%的邻苯二酚中，进行染色，37℃，保温30min；（4）将材料做成切片，在显微镜下观察，被染成棕色的部位即多酚氧化酶作用的部位。
五、实验结果六、注意事项1、实验过程中要用到许多有机毒性试剂，在操作时一定要注意通风；2、作用液中铅离子的浓度至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核染色的现象。
酸性磷酸酶
酸性磷酸酶编辑本段酸性磷酸酶（ACP）(酶学检测)酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。
在溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。
ACP在酸性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉淀而被显示出来。
正常值King-Armstrong法117～467nmol·s-1／L Bodansky法0～1.1U Roy Brower和Hayden法0.11～0.50U／L (1.8～10.0nmol·s-1／L) 前列腺(RIA)法＜3.0μg／L临床意义增高：前列腺癌者常显著升高，故血清ＡＣＰ测定主要用于本病的辅助诊断。
甲亢、乳腺癌、溶血性贫血、骨硬化症亦可升高，但程度不及前列腺癌。
超敏反应（hypersensitivity ），即异常的、过高的免疫应答。
即机体与抗原性物质在一定条件下相互作用，产生致敏淋巴细胞或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应。
又称变态反应。
目录应原的性质、进入机体的途径、参与因素、发生机制和个体反应的部分肾小球肾炎，外源性哮喘等。
阿尔图斯反应是一种局部的Ⅲ型超敏反应。
在反复注射抗原（如狂犬病疫苗、胰岛素）后，局部可出现水肿、出血、坏死等炎症反应。
Ⅳ型超敏反应又称迟发性变态反应。
为细胞介导免疫的一种病理表现。
它是由T细胞介导的。
常见的类型是：化学药品（例如染料）与皮肤蛋白结合或改变其组成，成为抗原，能使T细胞致敏。
再次接触该抗原后，T 细胞便成为杀伤细胞或释放淋巴因子引起接触性皮炎。
另一个类型称为传染性变态反应，是由某些病原体作为抗原性刺激引起的，见于结核病、梅毒等。
实验巨噬细胞酸性磷酸酶显示-PPT文档
3、粘附：将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每人2片，每片 2～3滴，将玻片水平放到冰箱内（4℃），让细胞自行铺 展、粘附30min。 将其中1片样品置湿盒内放50℃温箱中30min，使酶失活
4、固定：将玻片插入盛有10％中性福尔马林（已预冷）的 染色缸内，冰箱内4℃固定30min。
1. 糖类显示法
最常用的显示方法是过碘酸雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。 基本原理是：糖被强氧化剂 过碘酸（HIO4)氧化后，形 成2-醛基；后者与Schiff试剂 中的无色品红亚硫酸复合物 结合，形成紫红色反应产 物,PAS反应阳性部位即表示 多糖的存在。
2. 酶类显示
蒸馏水
0．2mol／L醋酸缓冲液(pH4．6)
5％硝酸铅 3.2％β—甘油磷酸钠
90ml
12ml
2ml 4ml
配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份， 一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者 缓缓混合，边混边搅匀。 若pH不到5．0，可加少量醋酸的调整。 注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用 前配制，不能贮存。
酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存 在，而不是酶的本身。
将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液 中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物， 它再与某种捕捉剂相反应，形成显微镜下可视 性沉淀，即最终反应产物。
3．脂类显示
脂类物质包括脂肪与类 脂。
标本可用甲醛固定、冷 冻切片、用油红、苏丹 Ⅲ、苏丹Ⅵ、苏丹黑B、 尼罗蓝等脂溶性染料染 色；亦可用锇酸固定兼 染色，脂类呈黑色。
酸性磷酸酯酶的提取实验报告
酸性磷酸酯酶的提取实验报告酸性磷酸酯酶基础实验实验一酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
图酶反应进程曲线[试剂和器材]1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。
实验六酸性磷酸酶的显示
学习酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶的显示方法有多种，包括 化学染色法、荧光染色法、同位素示 踪法等。
其中，化学染色法是最常用的一种方 法，通过特定的化学反应将酸性磷酸 酶催化生成的磷酸酯与特定的指示剂 结合，从而显示出酶的活性。
掌握实验操作流程
实验操作流程包括组织或细胞的处理、酶反应、结果观察等 步骤。
的转移和代谢。
在骨组织中，酸性磷酸酶参与骨质的矿化和骨细胞的凋亡过程。
03
显示酸性磷酸酶的化学反应原理
01
02
03
在酸性条件下，酸性磷 酸酶能够催化磷酸单酯 水解，释放出无机磷酸
。
无机磷酸与染色剂（如 茜素红、甲苯胺蓝等） 反应，生成有色产物， 从而显示出酸性磷酸酶
的存在。
染色剂的颜色变化与无 机磷酸的浓度呈正比关 系，因此可以通过观察 颜色变化来判断酸性磷
02 了解其活性调节的分子机制，为药物设计和疾病治疗
提供理论支持。
发展新型酸性磷酸酶显示技术
03
针对现有技术的不足，开发更加灵敏、特异和便捷的
显示方法。
感谢您的观看
THANKS
实验技能提升
通过本次实验，我掌握了酸性磷酸酶的显示方法，提高了实验操作 技能和实验数据分析能力。
理论知识应用
实验过程中，我深刻体会到了理论知识与实际应用的结合，加深了 对相关酶学反应的理解。
团队合作意识
实验需要多人协作完成，锻炼了我的团队协作意识和沟通能力。
实验不足与改进建议
实验操作细节需优化
在实验过程中，我发现有些操作步骤不够严谨，影响了实验结果的可重复性。未来应更 加注重操作的规范性和细节处理。
在实验操作过程中，需要注意实验条件、试剂浓度、反应时 间等因素对实验结果的影响，确保实验结果的准确性和可靠 性。
细胞学实验——精选推荐
目 录1.1.细胞生物学实验细胞生物学实验2.2.实验一实验一实验一 细胞膜的通透性观察细胞膜的通透性观察3.3.实验二实验二实验二 植物细胞骨架的观察植物细胞骨架的观察4.4.实验三实验三实验三 线粒体的超活染色与观察线粒体的超活染色与观察5.5.实验四实验四实验四 叶绿体的分离与观察叶绿体的分离与观察6.6.实验五实验五实验五 线粒体的分离与观察线粒体的分离与观察7.7.实验六实验六实验六 酸性磷酸酶的显示方法酸性磷酸酶的显示方法细胞生物学实验细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。
目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。
本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向全院本科生进行讲授。
实验一实验一 细胞膜的通透性观察细胞膜的通透性观察一、实验目的1.1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2.2.了解溶血现象及其发生机制。
了解溶血现象及其发生机制。
二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。
各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
渗透作用是细胞膜的主要功能之一。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
酸性磷酸酶显示方法的研究
酸性磷酸酶显⽰⽅法的研究鸡肝酸性磷酸酶显⽰⽅法的研究酸性磷酸酶(acid phosphatase ACP)是指⼀组⾮特异性磷酸酯酶，在酸性条件下能⽔解各种磷酸脂。
ACP分布⼴泛，它能够催化磷酸单酯键的⽔解并释放⽆机磷酸，是⽣物磷代谢的重要酶类，ACP活性的⾼低与⼈和动物的病理状态密切相关。
酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。
溶酶体作为细胞内起消化功能的细胞器，含有⼤量酸性⽔解酶，在细胞内外物质代谢过程中起着⼗分重要的作⽤。
ACP的活性变化直接体现溶酶体的功能状态[1]。
在⼤部分组织中，它主要定位于溶酶体内。
在溶酶体膜完整时，底物不易渗⼊，ACP活⼒微弱或⽆活性。
经固定后，在合适的pH条件下，膜本⾝变得不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗⼊，酶活⼒被显⽰。
此酶在pH5.0的环境中发⽣作⽤，分解磷酸脂⽽释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。
但因其是⽆⾊的，所以再经过与硫化铵作⽤，形成棕⿊⾊的硫化铅沉淀，由此就能显⽰酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布[2]。
国内外也发布不少有关酸性磷酸酶在细胞中的定位研究的报道，例如：⽯长应等[3]已经利⽤电镜酶细胞化学⽅法，对⼤尾柱⾍(Urostyln grandis)、冠突伪尾柱⾍(Pseudorostyld cristata)、魏⽒拟尾柱(Paraurostyla weissei)三种纤⽑⾍细胞内的酸性磷酸酶进⾏了定位观察。
发现在它们体内ACPase的阳性反应颗粒除分布在消化腔隙内独⽴的泡状结构上和被消化的⾷物组织中外，在细胞质中的⼩圆泡内也有分布。
近年来研究⼈员应⽤超微结构酶细胞化学技术研究了家蚕幼⾍中肠ACPase活性的亚细胞分布[4]，结果表明ACPase主要分布在圆筒形细胞的细胞核内，核周围的内质⽹及溶酶体中，杯形细胞的细胞核，细胞底部的内褶膜上也有少量的酶活性存在。
采⽤酶组织化学⽅法，孙建梅等[5]⾸次报道了ACP在⽂昌鱼组织中分布。
ACP在⽂昌鱼组织中分布⼴泛，在表⽪、消化道及⽣殖腺中均有分布。
酸性磷酸酶的检测实验报告
酸性磷酸酶的检测实验报告一．实验目的1.以Gomori铅法为例学习细胞化学方法检测水解酶的原理和方法。
2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
3.观察巨噬细胞内酸性磷酸酶的分布进一步了解溶酶体的结构和功能。
二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。
连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。
2.由于无法直接观察酸性磷酸酶的分布，可以通过检测酸性磷酸酶代谢产物的方法间接观察。
酸性磷酸酶催化反应。
再通过福尔马林-钙固定，再通过显色与染色过程。
在光镜油镜下可观察到黑色颗粒，也就是硫化铅沉淀，从而观测酸性磷酸酶在巨噬细胞中的分布。
三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉汤的小鼠一只b)酸性磷酸酶工作液，c)福尔马林-钙固定液d)2%硫化铵溶液e)0.1%沙黄染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干c)4摄氏度冷藏柜d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤（一）实验组：1.巨噬细胞采集与附着a)配置6%淀粉肉汤，连续三天向小鼠腹腔内注射，注意不要伤害小鼠器官。
b)用脊髓脱臼法快速处死小鼠。
在白瓷板上用剪刀打开小鼠腹腔，用适量生理盐水冲洗小鼠内脏。
c)用胶头滴管吸取生理盐水冲洗液，滴于洁净的载玻片上，注意不要涂抹，每个载玻片各滴两滴，注意做好编号与正反标记。
d)将载玻片置于有U形玻璃支架的大型培养皿中。
培养皿在4摄氏度的冷藏柜中放置30min。
用吸水纸吸去多余生理盐水，注意不要让细胞完全干燥。
2.酶的反应将玻片置于37摄氏度的酸性磷酸酶工作液中，温浴30min。
生理盐水小心冲洗，吸去多余水分。
3.细胞的固定将玻片置于福尔马林-钙固定液的染缸中，固定5min。
蒸馏水冲洗，吸去多余水分。
4.显色a)2%硫化铵溶液中处理3~5min，取出载玻片，用蒸馏水漂洗。
酸性磷酸酶的.pptx
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3.各上清液中ACP比活性分析
ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生 1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位；
比活性=
酶活性 U/ml 蛋白质含量mg/ml
目的要 求
1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因
素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
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试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
线 5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线
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一、 ACP的分离纯化
1.概况： ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广
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2. ACP的分离纯化方法 ♥ 根据ACP的理化性质，可以用层析、电
泳、透析等多种方法分离纯化。
♥本实验采用分级离心+分段盐析法：
感谢您的观看！
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心
缓慢搅拌
上清液 I
1mol/L MnCl2
4000rpm，10min离心
2ml/100ml上清液 I
（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）
上清液 II
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上清液 II
饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II
4000rpm，8min离心
（溶解ACP， 沉淀杂 蛋白）
实验三、 细胞中酸性磷酸酶的定位
在高等动物中存在大小两类吞噬细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细 胞），专司吞噬作用，在细胞的非特异免疫功能中发挥重要作 用。 1.单核细胞 单核细胞来自骨髓的前单核细胞，发育成熟后释放到血液中。 血液中单核细胞已向全身各组织并进一步分化成各种组织的巨噬 细胞。血液中单核细胞为圆形或椭圆形，直径14-20微米，在形态 上很难和其他独核细胞相区分。胞质中含有嗜天青颗粒，它是一 种溶酶体，其中含有过氧化物酶，酸性磷酸酶，非特异性酯酶和 溶菌酶等，这些酶与单核细胞的杀伤和消化功能有关。单核吞噬 细胞在血液中约占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为810个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达 数月至数年。
通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷 酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷 酸铅沉淀物。但因其是无色的，需再经过与硫化铵 作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显 示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。
反应如下：
β-甘油磷酸钠---β- 甘油 +PO4 3PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2（沉淀） Pb3(PO4)2 +(NH4)2S----PbS (棕黑色)
2.巨噬细胞的特性
组织中的巨噬细胞则呈显著的多形性，在培养条件下对塑料或 玻璃表面具有极强的粘附性，一次可利用这一特性分离巨噬细 胞并与非粘附性细胞分开，但其作用机制不详。巨噬细胞在体 内可借其表面粘附分子与其它细胞或细胞外基质黏附在一起。 巨噬细胞的另一特性是对异物通过不同机制具有吞噬作用 （phagocytosis）,吞饮（endocytosis）或胞饮作用 （pinocytosis）。可将异物吞入胞内，并借其胞浆内的大量液 泡及颗粒中的内含物和代谢产物将吞入的异物降解，消化和清 除。
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实验原理：
酸性磷酸酶（ acid phosphatase ， ACP ） 主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。在 溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入， ACP 活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件 下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性， 底物可以渗入，酶活力被显示。
实验原理：
ACP在酸性条件下（pH4.7）可使作用
实验步骤
免疫动物：实验 前4～6天用无菌 注射器取已灭菌 的6%淀粉溶液 1ml注射于小鼠 腹腔内，每天一 次。
实验步骤
颈椎脱臼处死小鼠。
实验步骤
吸取少量腹腔液，在玻片上涂层一薄层， 室温晾干。
实验步骤
将涂片滴置于 冰盒中，滴加 适量ACP作用 液，37℃作用 30分钟。取出 后，蒸馏水漂 洗。用10%甲 醛钙溶液后固 定5min。
液中的底物β- 甘油磷酸钠的磷酸根解离
出来，进而与溶液中硝酸铅结合形成磷酸
铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物，需
要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色 PbS
沉淀而被显示出来。
实验用品
1. 器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、 载玻片、盖玻片 2. 试剂：10%中性福尔马林；姬姆萨染液； 6% 淀粉溶液； ACP 作用液； 2% 硫化 铵溶液 3. 材料：小鼠腹腔液涂片
实验步骤
玻片入2%硫化 胺溶液作用2～ 3min，进行显色。 取出后蒸馏水漂 洗，镜检。
对照实验
对照组的作用液中不加β-甘油磷酸钠， 而以蒸馏水代替；或入作用液前先用高温 （50℃）处理30min，使酶失去活性，作 好标记，然后同时进行上述实验 。
实验结果
巨噬细胞的细胞质 中，出现许多棕色或 棕黑色的颗粒和斑块。 部分细胞内，酸性磷 酸酶极为丰富。整个 细胞质区域都有黑色 沉淀。中性粒细胞呈 现阴性反应。
实验目的：
1. 熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及 操作步骤。 2. 观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。
实验原理：
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成
磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵Βιβλιοθήκη 用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能
显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
实验作业
绘图表示酸性磷酸酶在细胞中的分布情况；
说明阴性对照在实验中的作用。