液体种子的制备

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02菌种扩大培养

（一）孢子的制备 1、细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间1~2d，产芽孢的细菌培养5~10d。 2、霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14d。 3、放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间5~14d。
例如:
生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g 葡萄糖和20g琼脂于1L水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2-3d。再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2d. 移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培养35d即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。
第二章发酵的流程及菌种扩大培养
2009.10
第一节发酵的特点及流程
一、发酵的特点发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下： 1、发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。 2、发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。

实验8-3红曲液体菌种的制备

实验8-3 红曲液体菌种的制备
一、实验目的
1. 了解红曲霉液体菌种的制备方法。

2. 为下一步实验准备足够的红曲种子。

二、实验原理
红曲霉是一种好氧性微生物，种子的制备除了可用三角瓶固体培养基外，还可以用液体摇瓶培养的方法来获得。

液体摇瓶培育法制备种曲快速方便，作为种子与固体培养基（饭粒）的接触比较均匀，但因含水量大，接种时接种量不能太高，否则因湿度太大而容易导致细菌污染。

三、实验器材
1. 豆芽汁培养基
2. 器材三角瓶、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅等。

四、实验步骤
1. 配制豆芽汁培养基（或其他合适的培养基）。

2. 500 mL三角瓶中装豆芽汁培养基100 mL，以8层纱布封口，加牛皮纸包扎后0.08 MPa 灭菌30 min。

3. 冷却后，每瓶豆芽汁中接入1/2支红曲斜面菌苔。

4. 30℃恒温摇床中180 r/min摇瓶培养3～5 d，至培养液深红色即可。

5. 4℃冰箱保存备用。

五、注意事项
1. 注意无菌操作。

2. 夏季若室温高于30℃，应打开摇瓶机的门，后则，温度过高影响种子质量。

最好用带制冷设备的摇瓶机或在空调房间内培养。

3. 三角瓶中液体培养基的装量不能太多，否则摇瓶时容易晃出，而且会造成液体中溶解氧含量的不足；另外摇床转速不能太慢，否则菌丝体会结成大球。

摇床转速快，结成的球数量多，体积小，有利于接种时分布均匀。

六、思考题
1. 比较液体种子与固体种子的优缺点。

2. 为什么摇瓶培养时摇床转速快，结成的球数量多而体积小，摇床转速慢，结成的球数量少而体积大？。

发酵工程资料知识讲解

发酵工程资料1、染菌率：总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。

染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。

这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法。

2、微生物生长曲线：在适宜的培养基中接入少量微生物，以后每隔一定时间取样测定细胞数目，以细胞群体量的对数对培养时间作图绘制出变化曲线。

3、临界溶氧浓度及其变化曲线：CCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。

CL：溶解氧浓度 CCr ：临界溶解氧浓度只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。

如果溶氧浓度低于临界值：则菌体代谢受到干扰。

4、自然选育：在发酵过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，直接进行筛选，选育出优良菌种的过程。

5、诱变育种：通过诱变剂处理菌种的突变几率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。

（速度快、收效大、方法简单。

6、辅料分批培养：根据菌体生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。

7、抗生素及其营养缺陷型突变株抗生素是生物在其生命活动过程中产生的、在低微浓度下能选择性地抑制或影响他种生物功能的相对分子量低的化学物质。

营养缺陷型：某一野生型菌株因发生基因突变而丧失一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在培养基上正常生长繁殖的变异类型。

8、前体及其作用10、前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。

作用：前提必须通过产生菌的生物合成过程，才能参加到分子结构中。

在一定条件下，前提可以起到控制菌体代谢产物的合成方向和增加产量的作用。

9、次级发酵中的分叉中间体:在微生物代谢过程中，一些中间代谢产物a-氨基已二酸一样，既可以被微生物用来合成初级代谢产物，也可以用来合成次级代谢产物，这样的中间体被称为分叉中间体。

发酵工程第五章种子制备

第二节工业发酵种子的制备
一、实验室种子制备二、生产车间种子制备
一、实验室种子制备阶段
1. 培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：
1.不产孢子和芽孢的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
2.产孢子的 ——获得一定数量和质量的孢子 ——获得一定数量和质量的菌体
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
如卡那霉素发酵，双种比单种的产量提高8%。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
如链霉素发酵，倒种法比单种法的产量提高12%。
5、种龄（Cell age）
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。
三、种子扩大培养的工艺流程
沙土孢子或冷冻干燥孢子→斜面孢子→摇瓶液体培பைடு நூலகம்（茄子瓶斜面培养或固体培养基培养）→种子罐培养→发酵罐发酵
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见
设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车
间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
四、种子扩大培养的方法
1.孢子进罐法：
以孢子形式的种子直接进罐的方法 – 先在固体培养基（固化培养基）上生长繁殖成
大量孢子，将孢子直接接入种子罐扩大培养。 – 优点：一次可以制备较大量的孢子，易于保存。
既可以节省大量的人力、物力和时间，又可减少杂菌污染的机会。 – 缺点：砂土管或冷冻管的用量大。

生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏

2. 通过寄主体进行复壮 3. 淘汰已衰退的个体
（三）菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种保藏期评价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年简便
沙土保藏法
干燥、无营养产孢子微生物 1~10年简便有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮：狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离法）
第四节菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。
一、菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离（多次划线分离纯化） 3. 连续传代（减少传代次数） 4. 其他因素（温度、湿度、培养基成分）
（二）菌种的提纯与复壮
菌种的提纯：从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以

食用菌生产技术液体菌种

3.制作饮料、保健品 3.制作饮料、制作饮料食用菌液体培养物经过粉碎→研磨打浆→ 食用菌液体培养物经过粉碎→研磨打浆→热水浴浸提→过滤→稀释或浓缩→调配，水浴浸提→过滤→稀释或浓缩→调配，可研制成功能饮料、保健品。制成功能饮料、保健品。 4. 制作畜禽饲料食用菌液体培养物，经过浸提或提取有用成食用菌液体培养物，分后的废弃物，还可制作畜禽饲料。分后的废弃物，还可制作畜禽饲料。
五、液体菌种制作的主要工艺 1.液体种子制备 1.液体种子制备液体种子制备的目的是大量繁殖足够数量的、液体种子制备的目的是大量繁殖足够数量的、健壮的、高纯度的菌丝体。健壮的、高纯度的菌丝体。 ⑴ 斜面菌种制备制备方法（培养基配方和操作步骤）同试制备方法（培养基配方和操作步骤）管斜面母种的制备，在此不再多讲了。管斜面母种的制备，在此不再多讲了。 ⑵ 摇瓶种子制备主要操作步骤：称量→煮制→分装→灭菌→ 主要操作步骤：称量→煮制→分装→灭菌→ 无菌检验→接种→ 无菌检验→接种→振荡培养管理
四、液体菌种制作的主要设备 1.摇床食用菌为需氧菌，液体菌种培养需摇床食用菌为需氧菌，摇床食用菌为需氧菌要增加氧气的供应，因此，要增加氧气的供应，因此，不断振荡有利于菌丝体的快速生长。利于菌丝体的快速生长。摇床是液体菌种生产常用的设备 2.种子罐和发酵罐种子罐和发酵罐一级种子罐通常为50-100L，二级种子罐一级种子罐通常为，为500-1000L。。
六、液体菌种制作的主要参数
1.菌龄 2.接种量 3.温度 1.菌龄 2.接种量 3.温度 4.通气量 5.搅拌速度 6.酸碱度 4.通气量 5.搅拌速度 6.酸碱度 7.罐压 8.泡沫控制 7.罐压 8.泡沫控制 9.发酵特点 9.发酵特点

金针菇工厂化液体菌种制备关键技术

s PECIAL ECONOMIC ANIMALS AND PLANTS金针菇工厂化液体菌种制备关键技术•王伟霞"张婷2仝乐涛"李福后停漲（1.江苏海洋大学食品科学与工程学院江苏连云港222005;2.江苏省海洋资源开发研究院江苏连云港222005;3.连云港市质量技术综合检验检测中心江苏连云港222006;4.连云港友和食用菌有限公司江苏连云港223500）摘要：本文对用于金针菇工厂化栽培的液体菌种制备关键技术进行了综述，包括培养基配方、制备工艺以及注意事项等，以期进一步推动金针菇工厂化栽培的发展。

关键词：金针菇；液体菌种；制备金针菇是我国食用菌工厂化栽培的主要品种之一。

目前，金针菇工厂化栽培已成为金针菇生产的主要模式，液体菌种使用逐步代替固体菌种用于金针菇工厂化生产是今后的发展趋势。

开展金针菇液体菌种研发和工厂化生产应用，可有效提高企业的经济效益，促进产业可持续发展。

1培养基金针菇液体菌种制备主要涉及三种培养基，分别是PDA固体培养基、摇瓶发酵培养基和发酵罐培养基等。

目前已报道了多种摇瓶发酵培养基和发酵罐培养基配方，都取得了明显实效H。

1.1摇瓶发酵培养基配方1：葡萄糖20g,蛋白豚2g,磷酸二氢钾lg,硫酸镁0.5g,柠檬酸三钠lg,氯化钙O.lg,硫酸亚铁lmg,硫酸猛lmg,V B10.1gg, V B20.1|ig,水］OOOmL。

配方2：可溶性淀粉40g,葡萄糖10g,蛋白M3g,磷酸二氢钾lg,硫酸镁0.5g,V B110gg, V B250jig,水］OOOmLo1.2发酵罐培养基配方1：马铃薯150g,鉄皮30g,蔗糖20g,磷酸二氢钾lg,硫酸镁0.5g,水］OOOmLo 配方2：豆粕粉40g,白砂糖10g,磷酸二氢钾lg,硫酸镁0.5g,V B1100p.g,V B2500|ig,水1000mL o配方3：玉米粉50g,鉄皮30g,磷酸二氢钾lg,硫酸镁0.5g,V B1O.lgg,V B20.5gg,水1000mL o在发酵罐培养基中，一般加入适量的消泡剂，如聚二甲基硅氧烷乳液等，可有效防止泡沫的形成，避免泡沫对液体菌种发酵过程造成影响。

菌种岗位操作规程

菌种岗位操作规程一、菌种岗位工艺流程安培管无糖斜面斜面摇瓶种液生产种液接种上罐二、开安培管制备无糖斜面1、目的：将经过休眠的安培管菌种扩大培养到无糖斜面上。

2、操作规程：2.1前期准备工作：先将无菌间、摇瓶间、缓冲间擦拭干净，擦拭部位包括摇瓶机、冰箱、超净工作台、培养箱、桌子、凳子、吊顶、墙面、地板以及其他无菌室内必须的物品和工具。

擦拭过程应先用清水擦拭，再用消毒液擦拭。

然后将无菌风通入，调试好摇瓶间的温度控制装置。

通风2天待无菌室、摇瓶间温度稳定并符合要求后，做无菌平板，检验无菌度合格后，无菌室才能投入使用。

2.2进无菌室前准备工作：进无菌室前半小时，先打开无菌室超净工作台使之运行，然后将消毒过的需要使用的物品和未经接种的经过挑选空白无糖斜面放入缓冲间，最后依次打开超净工作室、无菌室、缓冲间的紫外灯。

进入无菌室应先关闭紫外灯，然后打开日光灯，进入缓冲间前应先用75%酒精棉球擦拭手和需要使用的器皿，然后将安培管放进用75%酒精棉球擦拭过的100ml烧杯中（烧杯内部与先放入消毒过的纱布垫好）一起带入缓冲间，先用消毒液洗手然后更换无菌衣，然后将待接种斜面和安培管一起带入无菌室，进入无菌间每道门应侧身迅速进入，并迅速关闭每道门。

进入无菌间后动作要轻，先用消毒液洗手，关闭超净工作台上的紫外灯，打开台面日光灯，然后用消毒液擦拭超净工作台台面，然后将待接种的斜面和安培管用消毒液擦拭，轻轻有序的放在超净工作台台面上，然后取75%酒精棉球擦手和安培管外表面，在试管斜面背面用记号笔做好标示，将包裹在斜面口上的牛皮纸拿掉，解取斜面口上扎纱布的绳子，准备接种。

2.3开安培管：接安培管需二人配合用小砂轮片在安培管上口部位磨一圈，然后在酒精灯火焰附近打开安培管，若开不了，在酒精灯火焰上烘烤划口部位，再在划扣部位滴75%的酒精使加热部位急剧冷却，在酒精灯火焰附近用酒精棉球包住划扣上部掰开安培管。

2.4接种：在酒精灯火焰附近剥开接种环外包裹的牛皮纸，取出接种环，在酒精灯火焰上用火稍微烧一下，然后将接种环放在安培口，同时另一人在酒精灯火焰附近轻轻取出待接种的斜面棉塞，带接种环冷却后用接种环将安培管内的奶粉搅碎，挑取一环奶粉划线涂布到待接种斜面上，接种完毕后另一人将接好种的斜面棉塞先用酒精火焰燎一下，然后塞上棉塞，包好纱布，在接种下一支斜面，打开安培管要一次接完。

生产工艺第二章种子制备第三节种子的扩大培养

第三节种子的扩大培养
此菌丝即可移到发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。又如生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链丝菌，一般采用三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐（5～30L）中进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵的，这称一级发酵。
第三节种子的扩大培养
（2）霉菌孢子的制备霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25～28℃，培养时间为4～14天。
（3）细菌培养物的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。细菌培养温度大多数为37℃，少数为28℃，细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。
第三节种子的扩大培养
3．种子质量的判断由于菌种在种子罐中的培养时间较短，可供分析的参数较少，使种子的内在质量难以控制，为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期取样测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正常。在生产通常测定的参数为：①pH；②培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量；③菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）；④其他参数，如接前抗生素含量、某种酶活力等。用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试，如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。从表 2-4可以看出如种子液化淀粉能力强即淀粉酶活力高的，则接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。因此，在选用种子时，用测定种子液中淀粉酶的活力来判断种子质量的方法是可取的。
种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量延长菌丝体（培养物）在发酵罐中生物合成产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率[产物/(ml·h)]。

种子的培养过程

微生物制药工艺及反应器（第一章）

二、发酵种子制备工艺
1. 种子制备分两个阶段完成，实验室阶段和种子罐培养阶段。
⑴ 实验室阶段固体培养向液体培养转化——菌种斜面活化培养和三角瓶液体培养。
⑵ 种子罐培养阶段由实验室阶段的液体培养——向种子罐液体发酵培养转化。
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2. 种子制备的一般流程：种子→斜面种子活化培养→试管或三角瓶液体种子扩大培养→一级种子罐培养→二级种子罐培养→发酵罐发酵。
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3. 种子应具备条件
⑴ 菌种活力强，移种后能迅速生长，延迟期短；
（活力强）
⑵ 生理状态稳定；
（状态稳）
⑶ 菌体总量及浓度满足大容量发酵罐要求；
（量多浓度够）
⑷ 无杂菌污染，保证纯种发酵 ;（无污染）
⑸ 保持稳定的生产能力。（高稳产）
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微生物制药工艺及反应器（第一章）

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第一章种子的扩大培养
微生物制药工艺及反应器
生物工程系讲师：赵德胜

微生物制药工艺及反应器（第一章）
第一章种子的扩大培养
第一节基本概念
1. 什么叫种子：处于休眠状态的菌种，经过斜面活化和液体培养后，成长为能够迅速生长成合格菌体的菌种，就是种子。
⑷ 制备好的种子移种至发酵罐，开始发酵。
记忆方法：（活化培养、扩大培养、制备种子、移种发酵）
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微生物制药工艺及反应器（第一章）
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发酵工程复习重点

微生物生物技术重点第一章1 发酵的概念传统概念：指酵母作用于果汁或发芽谷物，进行酒精发酵时产生CO2的现象。

生物学概念：发酵是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物质开释能量的过程。

（生化）工业生物学家概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程现代概念：培养生物细胞（含动植物和微生物）来制取产物的所有过程2 生物工程（Microbial engineering ）是利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。

发酵工程的发展简史1、传统的发酵时期——天然发几千年酒（古埃及龙山文化）啤酒、黄酒、酱油、泡菜等特点多数产品为嫌气性发酵非纯种培养单凭体会传授技术，使产品质量不稳固（不了解微生物与发酵的关系）2、近代发酵工程时期——纯培养技术1665 英国物理学家Robert Hooke（罗伯特·胡克）细胞壁1680 荷兰列文·虎克(Antonie vanLeeuwenhoek) 活细胞人类认识到微生物的存在特点多数产品为嫌气性发酵非纯种培养单凭体会传授技术，使产品质量不稳固（不了解微生物与发酵的关系）由天然发酵阶段转向纯培养发酵（第一次转折过程特点产品的生产过程较为简单，对生产要求不高，规模不大3、近代发酵工程时期——深层培养技术显现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志青霉素的发觉与大量需求表面培养法(surface culture) 效价40U/mL，纯度20%，收率30%二战期间，青霉素发酵生产成功青霉素发酵生产的成功，给发酵工业带来两大功绩：开拓了以青霉素为先锋的庞大抗生素发酵工业建立深层培养法（submerged fermentation），把通气搅拌技术引入发酵工业。

它使得需氧菌的发酵生产从此走上了大规模工业化生产途径。

枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化

枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化焉兆萍，宋士良，陆克文(上海邦成生物工程有限公司，上海 201506)中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A文章编号：1001-0769(2019)01-0051-05枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境；能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。

该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。

枯草芽孢杆菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2]；其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。

由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。

本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。

1 材料与方法1.1 供试菌种枯草芽孢杆菌，由上海邦成生物工程有限公司菌种保藏室提供。

1.2 培养基LB固体培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH 7.2。

LB液体种子培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖5 g、氯化钠10 g、水 1 000 mL，pH 7.2。

1.3 种子液的制备将菌种接种于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱活化18 h后，挑取单菌落接入装有100 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min振荡培养24 h。

液体菌种制作

6.酸碱度
不同种类的食用菌都有一个最适酸碱度，例如，黑木耳的
最适pH为6.0-6.5、金针菇为6.3、香菇为4.5-6.5。
7.罐压在发酵过程中罐压通常为0.2-0.7Kg/cm。 8.泡沫控制在发酵过程中泡沫过多不利于发酵，目前大多数是加入
0.006%的泡敌做消泡剂消除泡沫。
9.发酵特点
发酵终点是否准确，应参考产物浓度、过滤浓度、氨基酸
六、液体菌种制作的主要参数
1.菌龄菌龄与种子的活力密切相关。通常，摇瓶种子菌龄控制在 4-10d，一级种子和二级种子菌龄为48-96H。 2.接种量一般地，食用菌深层发酵时的接种量为10-20%。 3.温度通常在22-30℃生长最快，得率最高。
4.通气量食用菌深层发酵的通气量以0.2-1.5通气体积/培养液体积 /min为宜。 5.搅拌速度食用菌深层发酵的搅拌速度一般是180-500r/min。
食用菌为需氧菌，液体菌种培养需要增加氧气的供应，因此，不断振荡有利于菌丝体的快速生长。摇床是液体菌种生产常用的设备。
往复式播床：振荡方式为来回振荡旋转式摇床：振荡方式为旋转
四、液体菌种制作的主要设备
2.种子罐和发酵罐许多食用菌种类，其深层发酵培养的菌丝体可作为提取药物成分或生化制品的材料。

四、液体菌种制作的主要设备
3.空气净化设备 4.培养基连续灭菌设备包括配料罐、连消塔、维持塔、喷淋冷却器等。 5．供气设备主要是蒸气锅炉及附属设备
五、液体菌种制作的主要工艺
1.种子制备种子制备的目的是大量繁殖足够数量的、健壮的、高纯度的种子 ①斜面菌种制备。制备方法（培养基配方和操作步骤）同试管斜面母种的制备一样。 ②摇瓶种子制备主要操作步骤：称量→煮制→分装→灭菌→无菌检验→ 接种→振荡培养管理 ③一级、二级种子制备一级种子罐通常为50-100L，二级种子罐为500-1000L。

摇瓶种子的制备及菌种的保藏 2

旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到
•
• 培养基配制分装
斜面种子或米孢子
灭菌接种恒温振荡培养摇瓶种子
•
• 图5—1 摇瓶种子制备的工艺流程
（2）培养基配制摇瓶种子以培养具有强生长活性的营养菌体为目的，因而在配制培养基时必须全面、均衡地满足菌体生长对各种营养物质的要求，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH，故在培养基成分的选择时还应考虑培养过程中pH的稳定，可以通过生理酸、碱性物质的平衡搭配及加入磷酸盐、碳酸钙之类缓冲剂
②控速冷冻 a.将安瓿或液氮瓶臵于铝盒或布袋中，然后臵于一较大的金属容器中； b.将此金属容器臵于控速冷冻机的冷冻室中；
c.以1 ～ 2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；
d.补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能
快地发生相变；
e.细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃； f.将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或
温室也应控制一定的湿度。
(5)保存
摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果暂时不用，可臵4℃冰箱中保存，保存期最好不超过3d。
经过保存的摇瓶种子一般不用做生产种子，可用于摇瓶发酵实验或小型发酵罐实验。
2．摇瓶种子的质量标准
• 摇瓶种子是液体培养的种子，在质量的控制方面，除了保证不污染杂菌及生产能力高这类与固体培养种子相同的一般标准外，还有其特殊标准。
(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)冷冻干燥或真空干燥保藏； (2)超低温或在液氮中冷冻保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。

大肠杆菌种子液的制备

大肠杆菌种子液的制备大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛应用于分子生物学和生物工程领域。

在这些应用中，制备大肠杆菌种子液是非常重要的一步。

本文将介绍大肠杆菌种子液的制备过程及相关注意事项。

一、实验材料和试剂准备1. 大肠杆菌菌株：选择合适的大肠杆菌菌株，如DH5α、BL21等。

2. 培养基：常用的培养基有LB培养基、TB培养基等，根据具体实验要求选择适当的培养基。

3. 试管、培养皿、离心管等实验器材：保持清洁、无菌。

4. 磷酸缓冲液（PBS）：用于细胞的洗涤和稀释。

5. 抗生素：根据实验需要添加适当的抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素等。

1. 预培养：从冷冻保存的大肠杆菌菌株中取出一支，接种到含有适当抗生素的液体培养基中，放入恒温摇床，以适当转速、适当时间预培养。

预培养的目的是使菌株尽快进入对应的生长状态，为后续的培养提供更好的生长条件。

2. 大规模培养：将预培养的菌株转移至较大容量的含有适当抗生素的液体培养基中，放入恒温摇床进行培养。

培养的条件包括温度、转速和培养时间等，根据具体的菌株和培养基选择合适的条件。

3. 培养基收获：培养时间一般为12-16小时，当培养基达到适当的菌体浓度时，可以进行下一步操作。

4. 菌体收获：将培养基转移到离心管中，进行高速离心。

离心的目的是将菌体沉淀到管底，去除上清液。

5. 菌体洗涤：用PBS缓冲液洗涤菌体，去除培养基残留物和抗生素等。

洗涤的次数和洗涤液的体积根据需要进行调整。

6. 菌体稀释：将洗涤后的菌体用PBS缓冲液进行稀释，使菌体浓度适合后续的实验需求。

稀释的比例根据具体实验要求进行调整。

三、注意事项1. 实验器材要保持清洁、无菌，避免污染。

2. 在培养过程中，要注意温度、转速和培养时间等条件的控制，以保证菌体的生长和繁殖。

3. 洗涤过程中，要避免过度离心，以免造成菌体损伤和死亡。

4. 制备种子液时要根据实验需求调整菌体的浓度，以保证后续实验的准确性和稳定性。

5. 实验操作要注意无菌操作，避免外源性污染对结果的影响。