第八章外源基因的表达
外源基因的表达和传递技术及其在基因治疗中的应用
外源基因的表达和传递技术及其在基因治疗中的应用近年来，随着生物技术的迅猛发展，外源基因表达和传递技术在基因治疗中的应用越来越受到关注。
这项技术可以将基因通过载体进入人体细胞内，并表达出来，从而治疗某些疾病。
本文将介绍外源基因表达和传递技术的种类及其在基因治疗中的应用。
外源基因表达技术外源基因表达技术是将外源DNA转化为蛋白质的过程。
它常用于研究蛋白质功能，并在基因治疗中用于表达治疗蛋白。
下面我们将介绍外源基因表达技术中常用的几种方法。
1.原核细胞表达系统这种系统是将外源基因导入到大肠杆菌中，通过大肠杆菌的机制表达外源基因。
这种方法通常用于表达小分子蛋白，或需要大量表达蛋白的情况，但其缺点是表达蛋白没有折叠后修饰，可能不太适用于一些需要精确功能的蛋白。
2.哺乳动物细胞表达系统这种系统则是将外源基因导入到哺乳动物细胞中，通过哺乳动物细胞的机制表达外源基因。
与原核细胞表达系统不同，哺乳动物细胞表达的外源蛋白经过了正确的折叠、修饰，所以其适用于需要正确功能的蛋白。
3.植物表达系统这种系统使用植物作为表达外源基因的载体，可以通过转化植物某些细胞而来达到目的。
这种技术的优点是生产成本低、表达量大、易于提取，但也有一些缺点，例如大规模生产时会遭受微生物攻击以及可能导致对其他植物产生有害环境影响等。
4.细菌表达系统这种系统同原核细胞表达系统类似，将外源基因导入到细菌中表达，适用于表达小分子蛋白、需要大量表达蛋白的情况。
外源基因传递技术外源基因传递技术通常指的是通过载体将基因导入到细胞中，这项技术的应用广泛，例如基因治疗和基因工程等。
下面我们将介绍几种外源基因传递技术。
1.质粒传递技术这种技术是将基因通过质粒载体导入到细胞中。
质粒是一种环形DNA，可以自主复制，并带有细胞可以利用的selection marker。
这种技术适用于一些比较简单的操作，例如在细胞中表达蛋白。
2.病毒转染这种技术是利用病毒向细胞传递外源DNA，使其表达外源蛋白。
外源基因表达的基本流程
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外源基因的导入和表达机制
外源基因的导入和表达机制随着生物技术的飞速发展，外源基因的导入和表达成为了基因工程领域中的重要课题。
其涉及到基因治疗、转基因作物、药物生产等许多领域。
在导入和表达外源基因的过程中，要考虑到基因的适应性、表达的稳定性、特异性以及对宿主生物的影响等多个方面。
本文将探讨外源基因的导入和表达机制，包括基本原理、工具和技术以及存在的问题和挑战。
基本原理导入和表达外源基因的基本原理是将外源DNA序列引入到宿主细胞中，使其被转录和翻译成蛋白质。
具体而言，一般有两种方式：直接转染和向宿主基因组中嵌入外源基因，后者也称为基因整合。
直接转染是将外源DNA序列直接引入到细胞外，在细胞膜相关的受体介导下，外源DNA序列被进入到细胞质中。
直接转染的DNA所携带的信息将指导它在宿主细胞内的表达。
基因整合是将外源DNA序列整合到宿主细胞染色体上，使其成为宿主细胞的一部分。
基本原理是将外源DNA构建为一个适合于整合的载体，然后具体通过发生基因重组或嵌入基因导入宿主细胞的染色体中。
被整合的外源脱氧核糖核酸(DNA)序列将被遵循宿主细胞一样转录并翻译成蛋白质。
工具和技术导入和表达外源基因要解决的核心问题就是如何将外源DNA 送入宿主细胞。
为此，研究者现有许多的工具和技术可供选择。
电穿孔是将宿主细胞暴露在高电场的冲击下，使细胞膜通透性增强，外源DNA得以进入的技术。
这种技术既可以使用简单的电刺激来进行，也可以通过利用特殊设备专门进行。
这种技术在大多数细胞类型中都是有效的。
群粒化法是利用氟化物和离子溶液百炼生化学反应，在其中产生群粒化团块，通过进一步化学反应打开细胞膜，使外源DNA进入细胞内部。
这种技术适用于一些难以被电穿孔的细胞类型。
病毒载体是将外源DNA序列植入病毒中，通过感染宿主细胞扩增表达，使表达的目标基因在细胞内获得较高的表达水平。
存在的问题和挑战虽然外源基因的导入和表达在许多方面得到了极大的改进，但仍然存在着一些问题和挑战。
外源基因的原核表达
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常见的大肠杆菌表达系统
• PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启 动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或 溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产
物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在
细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之 间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞
与起始密码ATG之间的距离及碱基 的种类；防止核糖体结合位点附近 序列转录后形成发卡结构。
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表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标
基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之 间的距离和碱基组成处于一个适当的范围 内。
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核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
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尽量提高核糖体结合位点本身和附近 的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意 的事项。
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
外源基因的表达和转基因生物的鉴定
5、β -葡萄糖酸苷酶（GUS）基因
GUS基因所编码的β -葡萄糖酸苷酶可催化裂解人工合成的 底物4-甲基伞形花酮-β -D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲 基伞形酮，可用荧光光度计进行定量测定。
GUS X-gluc————————————————→ 蓝色物质
(5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸) （5，5’-二溴-4，4’-二氯靛蓝）
CAT基因是由大肠杆菌易位子Tn9所编码的，它可以催化 乙酰CoA转乙酰基到氯霉素分子的某些基团。
氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制 肽酰基转移酶的活性，从而阻碍肽键的形成，使蛋白质合 成受到抑制，最终抑制植物的生长。而乙酰化的氯霉素就 会失去与核糖体50S亚基结合的能力，所以携带有CAT基 因的转基因植株就具有了对氯霉素的抗性。
3、通过减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）基因产物的诱导表达
该方法是当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的 表达；而当宿主细胞的生物量达到饱和时，再诱导外源 基因的表达。 例：温度敏感的转录调控蛋白λ cI857
（2）表达载体的诱导复制 该方法是在宿主细胞大量生长时，抑制重组质粒的 复制；而当细胞生物量积累到一定水平时，再诱导细胞 中重组DNA的复制。
1、胭脂碱和章鱼碱检测
这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物 材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱 和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的 荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有 胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。 冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）＋菲醌 2天后呈蓝色 紫外光下呈黄色荧光
异源性表达（heterologous expression）则指来源于其它物 种的基因在植物中的表达。
外源基因的表达
RNA聚合酶： 核心酶(α2ββ′)＋σ亚基＝全酶( α2ββ′ σ)
s factor:
7.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活 性的DNA顺式作用序列，又称强化子。
7.2.3 终止子(terminator )
本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特 殊的RNA结构区内实现终止作用。 依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅 助因子。
7.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序 列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱 基（A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成 对启动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动 子功能的重要因素。
基因表达在原核生物与真核生物中的差别 在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行 的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构 基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时， mRNA立 即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完 毕时转译也完成。 在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行 的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连 接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能 在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过 加工、糖化、形成高级结构。
The prokaryotic promoter
5’ -35 -10 16-19 bp 3’
TTGACA T82T84G78A65C54A45
TATAAT 5-9 bp
start site
T80A95T45A60A50T96 Transcriptional
外源基因在植物细胞中的表达
1、电激法：利用高压电脉冲把外源基因导入植物 细胞实现转化的方法。
1985年由斯坦福大学Fromm M等最先将CAT基 因通过电激法导入胡萝卜、烟草、玉米的原生质 体，测得瞬间表达。随后康乃尔大学将外源基因 导入原生质体实现稳定表达。
转化率随质粒DNA浓度、电脉冲强度以及持续 时间增加而增加。
2、基因枪法（particle bombardment） ：是 利用高速微弹粒将外源遗传物质导入细胞或组织 中的方法，也称为微弹射击法、粒子轰击法等。
1985年以后利用该方法将报告基因转入种 植物原生质体，获得瞬间表达或稳定表达。
PEG法转化率低，一般在10-5-10-6。
5、脂质体转化法： 利用磷酸碱或磷酸丝氨酸等脂质构成的 双层膜囊，可以包裹质粒，DNA大分子、病毒 颗粒等，通过脂质体与原生质体融合将外源 基因转入原生质体细胞，或通过注射法实现 转化。 6、真空渗入法： 利用真空作用使外源基因进入植物体，细 胞并实现DNA的整合。
2. 报告基因
报告基因是指用于检测组装的嵌合基因在导入细胞后 是否具有功能的一种指示基因，它通常是编码在离体条件 下易于检测的酶。
具体是将报告基因连接在待研究的目的基因的启动子 的下游，其后再连接真核生物的终止信号，然后将构建的 融合基因转化受体细胞，组织，获得转基因植株。在转基 因植株生长发育的不同阶段，不同器官和组织乃至细胞， 分析其中的报告基因产物-酶活性，从而了解该目的基因 在何时、何处表达。 作为报告基因，其表达产物及产物的类似功能在未转 化细胞中原本并不存在。
（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶， neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ）
Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生 素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化， 使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能 与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步 影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物 合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基 因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。
2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。
4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。
8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。
9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
第七八章-外源基因的表达及其优化策略20201112
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
大肠杆菌基因表达系统
必须用cDNA或者是化学合成的基因。 外源基因不能带有内含子。
除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件： 强启动子、强转录终止子 可诱导性 合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等
理想原核表达载体具备的基本特征
1
2
5
4
3
A dividing E. coli
原核或噬菌体启动子
MCS
SD序列
终止子
条件：
组成结构：
必须选择一个有lacI的宿主菌。
tac P
Lac O
S导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
阻遏物
IPTG
2.分泌型表达载体
如：pIN III系列： 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-A1, pIN III-A2, pIN III-A3,
EcoR I
BamH I
凝血酶
Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser
EcoR I
BamH I
Xa因子
pGEX-3X的插入区：
Sma I
Sma I
其他融合蛋白系统
His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。
细胞质
外膜
内膜
周间质
质粒
染色体
“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
01
碱性氨基酸
Leu、Ile
Arg、Lys
02
N
04
疏水氨基酸核心区
07
AlaGlySer
外源基因表达的基本流程
外源基因表达的基本流程包括以下几个关键步骤：克隆：1.1.选择合适的限制性内切酶将外源基因从其原始DNA中切割出来。
2.将切割后的外源基因插入到表达载体（如质粒、病毒载体等）的多克隆位点，确保正确的阅读框和若为分泌型蛋白还需考虑信号肽序列的一致性。
重组载体构建：1.通过连接酶的作用将外源基因与线性化的载体连接起来形成重组DNA分子。
2.验证重组体是否成功构建，通常采用PCR、酶切分析或测序技术。
2.转化：1.将重组载体导入宿主细胞，常见宿主有大肠杆菌、酵母菌或其他哺乳动物细胞系。
2.转化方法可以是电穿孔法、热激法、PEG介导法或者原生质体融合法等。
3.筛选与鉴定：1.在含有合适选择标记（如抗生素抗性基因）的培养基上筛选转化成功的细胞。
2.进一步通过PCR验证、Southern blotting 或 Westernblotting等方法确认外源基因是否已整合入宿主染色体并正确表达。
4.诱导表达（对于可调控表达系统）：1.如果使用的是诱导型表达系统，会在适当时间加入诱导剂（如IPTG对 lac 操纵子的诱导），促使外源基因开始转录和翻译。
5.表达产物检测与纯化：1.表达出的蛋白质可以通过SDS-PAGE、Western blotting等方法进行定性和定量分析。
2.对于需要进一步应用的重组蛋白，还需要通过亲和层析、离子交换层析等多种纯化策略得到高纯度的目的蛋白。
功能鉴定：1.最后，对外源基因编码的蛋白质进行生物学功能的测定，以证明其活性和用途，比如在药物研发、疫苗生产或遗传疾病治疗中的应用。
外源基因表达机制
B）构建重组异源蛋白表达系统 将SD序列和启动子安装在外源基因的5’端 ATG碱基前的正确位置，使外源基因高效表达序 列正确的天然蛋白． C）构建分泌型异源蛋白表达系统 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因 拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直 接进入到培养基中． 优点：增大表达蛋白的稳定性大大简化后续 的分离纯化步骤．
原核生物启动子
转录起始位点。多数细菌启动子转录起始区序列为 CAT． Pribnow框。在距转录起始位点上游6bp处存在一个六联 体保守序列： TATAAT ，由于中间的碱基位于转录的起始 点上游的 10bp 处，又称为 -10 序列区。少数 Pribnow 框 中间碱基的位置在-9-18之间变化。 Sextama 框。在转录启动区的另一个六联体保守序列位 于距转录起 始位点上游 35bp 处，通常称为 -35 区，该 保守序列为TTGACA，它是 RNA聚合酶的识别位点。 间隔区。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基 组成对启动子的功能并不十分重要。但间隔序列的长 度却是影响启动子功能．
5 绝缘子
* 绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中， 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元 件．在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子， 它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启 动子起增强或抑制作用．
* 果蝇中绝缘子SCS和SCS’分别位于果蝇多线染色 体87A7座位hsp70基因两侧的核酸酶高度敏感 区，它们是一种具有顺式调控作用的边界元件， 能使其界定的染色体结构域上的基因免受区域 外两端正调控和负调控信号的影响．
Ⅲ型启动子。 * 内启动子:转录起始位点的下游，如tRNA和5sRNA 的启动子。 * 外启动子:转录起始位点的上游，如脊椎动物U6 核小RNA和7SK RNA启动子，其结构类似于真核生 物Ⅱ型启动子。
离子交换层析的基本操作
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
子交换层析的基本原
理 离子交换介质的基本性 质 离子交换介质的选择原
则 离子交换层析的基本操 作
离子交换层析的基本原理
目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定； 使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合； 使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。
(2) 样品进柱
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出
然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来
亲和层析（affiuity chromatography）
原理：
a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性
离子交换纤维素：
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利 用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技 术。
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的基本性 能 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物
如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离 子起交换作用
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(3)核糖体结合位点(SD) AGGAGG 翻译起始密码子与SD的距离 SD后为AAAA或UUUU效率最高
(4)密码子 (5)选择标记
2.宿主菌 蛋白水解酶缺陷型 菌株如:BL21等
第三节 外源基因表达系统
原核表达系统 真核表达系统
目前广泛应用的为原核系统特点
大肠杆菌、芽胞杆菌、链霉菌等
①单细胞、生长快、易控制 ②基因组结构简单 ③含质粒或噬菌体 ④生理代谢途经与基因表达调控比较清楚 ⑤不具备真核生物蛋白加工系统 ⑥内源蛋白酶会降解外源蛋白，表达产物不稳定
一.大肠杆菌表达系统
包涵体表达的缺点： 表达的外源蛋白丧失了原有生物活性，必须经过 有效的变性、复性操作，才能得到具有正确空间 构想的活性蛋白体
融合蛋白
外源蛋白基因与受体菌蛋白基因重组，不改变两 个基因的阅读框，表达的蛋白为融合蛋白
A
B
Gene
A
B
N
C Protein
融合蛋白的优点：
在自身蛋白引导下，形成良好的杂合构象，可很 大程度封闭蛋白水解酶切割位点 某些情况下，具有水溶性和一定生物活性 易于分离纯化
5.目的基因沉默 基因沉默(gene silencing) 位置效应 转录水平(TGS) 甲基化 转录后(PTGS) siRNA
第二节 基因表达调控元件
1.启动子(promoter) ①序列特异性 ②方向性 顺式调控元件 ③位置特性 转录区上游 ④种属特异性
(1)原核生物启动子
①转录起始位点 ②Pribnow框 ③Sextama框 ④间隔区
原核生物避免序列存在衰减子(attenuator) 带有正常转录终止序列 受体细胞情况
trp衰减子
A 序列与poly(A) 渗入位点 poly(A)渗入信号序列AAUAAA
受体细胞情况
原核生物 最佳选择RNase缺失个体 真核生物 mRNA正确加工，提高稳定性
3.外源基因mRNA的有效翻译
原核生物
①AUG(ATG)首选起始密码子 ②SD序列 ③SD与起始翻译密码子间合适距离 ④翻译起始区周围不易形成明显的二级结构
真核生物
具有类似于SD序列的保守区CCA(G)CCATGG 对于翻译效率仍然十分重要
密码子偏爱性 主密码子(major codon) 罕用密码子(rare codon)
包涵体的形成 ①折叠状态的蛋白聚集作用
高表达导致水难溶的折叠态蛋白分子间相互作 用而聚在一起
②非折叠态的蛋白聚集作用
在较高培养温度的细菌中，热稳定性差的蛋白 处于非折叠态，以二硫键等结合在一起
③蛋白折叠中间体的聚集作用
由于折叠中间体的难溶而聚在一起
包涵体表达的优缺点 包涵体表达的优点： 简化外源表达蛋白的分离 保持表达产物结构稳定
3.常见大肠杆菌表达系统 ①Lac和Tac标达系统 以lac操纵子调控机 制为基础设计和构建 的表达系统
阻遏蛋白过量表达
当带lac操纵区的基因多拷贝存在，lacI表达的阻遏蛋 白不够用时，采用阻遏蛋白过量表达突变体
lacI突变体lacIq
温度敏感型突变体lacIq(ts) 30°C抑制表达 42°C转录保持开放
③过滤膜结合法 ④PCR方法
2.增强子(enhancer) ①双向性 ②重复序列 ③与所处位置无关 ④特异性 ⑤可增强异源基因
3.终止子(terminator) 常用大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2 噬菌体上TΦ
4.衰减子(attenuator) 5.绝缘子(insulator) 6.反义子(antisense RNA)
(2)真核生物启动子
I型启动子 rRNA II型启动子 mRNA
TATA框 CAAT框 GC框 III型启动子 tRNA 5SrRNA sRNA
(3)启动子与转录的启动
原核σ亚基参与起始
真核生物转录启动较复杂
(4)启动子的分离
①随机克隆法
HindIII EcoRI
②聚合酶保护法
加入聚
A
合酶
B
AB
外源基因的表达
第一节 基因表达的机制
1.外源基因的转录 2.mRNA的延伸与稳定性 3.外源基因mRNA的有效翻译 4.表达蛋白在细胞中的稳定性 5.目的基因的沉默
1.外源基因的转录
启动子类型： 组成型启动子
原核生物T7启动子 诱导型启动子
原核生物lac、trp等
组织特异性表达启动子
2.mRNA的延伸与稳定性
寡聚型外源蛋白 低拷贝质粒，多基因串联排列。目的蛋白高表达， 非目的蛋白低表达。
多个转录元排列 大分子量蛋白 同于转录元，多编码框排列 中等分子量蛋白 同一编码框，多肽段排列 小分子量蛋白
整合型外源蛋白 分泌型外源蛋白
在信号肽引导下分泌到胞外或周质中
5.高效表达外源基因的策略 优化载体设计 密码子偏爱性 mRNA稳定性 表达蛋白稳定性 优化发酵过程
②PL和PR表达系统 cI基因表达蛋白阻遏PL和PR表达 cI基因温度敏感型突变体cI857(ts)
③T7表达系统 T7噬菌体RNA聚合酶高效率转录 在大肠杆菌内，存在T7噬菌体RNA聚合酶 下，T7启动子可高效转录
4.外源基因在大肠杆菌表达的形式 外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能 存在于： 细胞质、细胞周质、细胞外培养基
翻译终止 UAA UAG UGA
释放因子(release factor)
原核 RF1 UAA UAG RF2 UAA UGA
真核 两种eRF UAA 终止效率最高
4.表达蛋白在细胞中的稳定性
受体细胞存在的蛋白水解酶可降解外源蛋白 避免或降低被水解的途径: ①构建融合蛋白表达系统 ②构建分泌蛋白表达系统 ③构建包涵体表达系统 ④选择蛋白水解酶缺陷型受体系统
表达蛋白形式 可溶性蛋白 不可溶性蛋白
包涵体 (inclusion body)表达蛋白
一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中 积累，并致密地聚集在一起，形成无膜的或被膜 的裸露结构
分布位置
主要存在于细胞质中，也存在于细胞周质
构成
主要为表达的外源蛋白，还有RNA聚合酶、核糖 核蛋白体等，此外还包括一些DNA、RNA、脂 多糖等非蛋白成分
二.酵母表达系统