经典单克隆抗体技术ppt

杂交瘤技术
通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建 系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗 体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂 交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主 要技术途径。
单克隆抗体制备原理
用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（ 用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT-） 或胸腺嘧啶核苷酸酶（ 或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤细胞变异株与 脾脏的B细胞融合。采用 脾脏的 细胞融合。采用HAT选择性培养基对融 细胞融合 选择性培养基对融 合细胞进行培养和筛选。 合细胞进行培养和筛选。 HAT选择性培养基： 选择性培养基： 选择性培养基 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤 培养基中加次黄嘌呤 ， Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷 及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。 及胸腺嘧啶核苷 。
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为什么要反复注射抗原？？ 为什么要反复注射抗原？？
正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B 淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生 1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常 的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千 万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了 提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使 产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。
单克隆抗体制备原理
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HAT培养基的选择原理 HAT培养基的选择原理
⑴ 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径 合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。 ⑵ 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径 合成DNA而繁殖。 ⑶ B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存 活5~7d，且功能下降)。 ⑷ 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细 胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。
选择性培养基中， 在HAT选择性培养基中，由于变异的瘤 选择性培养基中 细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧 啶核苷激酶， 啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌 呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷 。 呤或胸腺嘧啶核苷而合成 酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA， 酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又 被氨基喋呤所阻断， 被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可 避免也要死亡。 避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴 细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶， 细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过 次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因 ，克服氨基喋呤的阻断， 次黄嘌呤合成 此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。 此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。
加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内
5. 杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基 换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融 合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方 法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应 的阳性孔。
6.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆 阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆
多克隆抗体 (Polyclonal antibody)
给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血 清是多种抗体的混合物, 清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定 簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克 隆抗体。 隆抗体。 抗原决定簇： 抗原决定簇：是指抗原分子中决定抗原特异性的特
多抗与单抗制剂的比较
多抗 （血清） 特异性抗体含量（mg/ml） 无关Ig含量（mg/ml） 其他血清蛋白 均一性 特异性 稳定性 重复性 0.1-1 10 大量 — 多决定簇 较好 差 单抗 单抗 （腹水） （培养上清） 0.5-5 0.5-1 极少 + 单决定簇 略差 好 0.005-0.025 — — + 单决定簇 略差 好
体内——腹腔接种 腹腔接种 体内
克隆化的细胞可以在体外进行大量培养， 克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清 液而获得大量的单一的克隆化抗体。 液而获得大量的单一的克隆化抗体。 不过体外培养法得 到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度， 到的单克隆抗体有限， 其不能超过特定的细胞浓度， 且 每天要换培养液。 每天要换培养液。 而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些 限制。 限制 。 杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞 的遗传特性。 的遗传特性 。 如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排 斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠） 斥杂交瘤的小鼠（ 无胸腺的裸鼠）， 杂交瘤细胞就开始 无限地繁殖，直至宿主死亡。 无限地繁殖 ， 直至宿主死亡 。 产生肿瘤细胞的小鼠腹水 和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体， 和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体， 这 种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。 种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的 倍
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、 淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、 淋巴细胞在抗原的刺激下 增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的 能力。将这种 细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融 能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融 合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化， 合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克 隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能 淋巴细胞的能力， 力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力， 又具有产生特异性抗体的 淋巴细胞的能力 将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小 鼠体内即可获得大量的高效价、 鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性 抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术 单克隆抗体技术。 抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
细胞融合方式
• 物理融合法： 电融合、激光融合 物理融合法： 电融合、 • 化学融合法 ：PEG融合 融合 • 生物融合法 ：仙台病毒
致敏淋 巴细胞
骨髓瘤 细胞 50%PEG 1ml
培养液 10ml
离心 37。C摇动、 离心 1000rpm 由慢渐快1min、 1000rpm 10min 7min 静止1.5min
杂交瘤细胞的冻存
当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细 胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存， 胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在 连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的 连续传代的过程中， 漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。 漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。 另外在长期的培养过程中， 另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以 至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。 至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。
在体外的细胞培养中，单个的或数量 很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其 它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细 胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞 融合和单克隆的选择过程中，就是在少量 的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群 体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。
许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞， 如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等， 常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和 淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方 面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死 亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成 良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤 细胞同系鼠。
杂交瘤细胞通常用含有8％--10%的 二甲亚砜和20％小牛血清的培养基冻存 于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年， 在-80℃中可以作3-6个月短期保存。冻存 细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速 升温，这样可以确保细胞有较高的存活 率。
单克隆抗体的特性
单一特异性，与一个抗原决定簇反应； ① 单一特异性，与一个抗原决定簇反应； 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； ② 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； 一经制出，可无限量地供应； ③ 一经制出，可无限量地供应； 生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原； ④ 生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原； ⑤ 能查出混合物中存在的用常规方法查不出的 少量成分。 少量成分。
3. 骨髓瘤细胞的准备 • 细胞株处于良好的生长状态，本身不 能分泌任何抗体或免疫球蛋白； • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同 一品系，以便两者组织相容性抗原一致； • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
4. 细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养 基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用 50% PEG作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.50.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640 培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用 HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细 胞板中，37℃，5%CO2的细胞培养器皿中培养。
经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行 克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。
克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操 作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
阳性孔的检测
有限稀释法
计数
103/ml
102/ml
隆抗体的制取
制取方式： 体外——培养罐法 体内——腹腔接种 —— 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定——是否针对同一决定簇
殊化学基团，又称表位(epitope)。
抗原
克隆A 表位A 表位B 克隆B 表位C
多 克 隆 抗 体
克隆C
单克隆抗体
单克隆抗体
（monoclonal antibody, McAb） ）
通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某 通过B细胞杂交瘤技术, 一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。 一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。 细胞克隆： 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团。
颗粒性抗原： 颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等
分子量大于5000Da生物物质。
可溶性抗原： 可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于