瘤胃中小韦荣球菌H2基因组文
奶牛亚急性瘤胃酸中毒_SARA_防治措施
[25] 姜秋水, 沈华.膨化大豆对断奶仔猪生产性能的影响.浙江畜牧 兽医，2003(5)：3-4.
[26] 费枫，华卫东，翁经强.膨化全脂大豆替代部分豆粕饲喂断奶仔 猪的效果试验[J].浙江畜牧兽医，2002(2)：1-2.
[27] 邱树武，马春全.膨化豆粕对肉仔鸡消化吸收率及增重的影响[J]. 黑龙江粮油科技,2000,11(3)：46-48.
胃 pH 值，降低瘤胃 NH3-N 浓度，总挥发性脂肪酸
2.3 日粮中使用缓冲剂
（VFA）浓度，各处理组与对照组相比乙酸与丙酸比值
在日粮中添加一定量的缓冲物质能起到稳定 pH 有降低的趋势（P＞0.05），说明沙葱提取物均能够促进
值的作用。并被提倡应用到治疗急性瘤胃酸中毒，并 瘤胃发酵，优化瘤胃环境，并未改变瘤胃发酵类型。张
1.5%的 NaHCO（3 以精料干物质为基础）。
能够刺激瘤胃内主要的乳酸利用菌之一反刍兽月形
2.4 日粮中使用抗生素
单胞菌对乳酸的利用。苹果酸充当瘤胃内反刍兽月形
日粮中使用抗生素在预防奶牛发生 SARA 能起 单胞菌丁二酸-丙酸途径中的氢电子库。添加这些物
到一定作用。主要是因为有些抗生素可以控制瘤胃内 质有利于乳酸的利用，减少乳酸的积累，降低 SARA
牛 链 球 菌 及 乳 酸 杆 菌 菌 种 产 生 乳 酸 （Owens 等 ， 的发生。Callaway 等（1996）发现，在体外瘤胃微生物
1998）。离子类抗生素如沙里菌素和莫能菌素能够有 混合培养发酵时，添加苹果酸不仅能有效地促进了反
效的防止 SARA 的发生，另外，四环素类、硫肽菌素等 刍兽新月单胞菌利用乳酸的能力，同时增加了发酵终
少得到应用（朱森阳等，2005）。
不同生理阶段荷斯坦奶牛瘤胃细菌多样性研究
不同生理阶段荷斯坦奶牛瘤胃细菌多样性研究李子健;李大彪;高民;王典;兰儒冰【摘要】本试验旨在探究不同生理阶段荷斯坦奶牛瘤胃细菌多样性.选取处于围产前期、泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期的经产荷斯坦奶牛各4头,共16头,采集瘤胃液用于测定瘤胃发酵参数和提取微生物DNA,采用Illumina Miseq PE300平台测定瘤胃细菌组成.结果表明:1)围产前期奶牛瘤胃微生物蛋白、乙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度与乙酸/丙酸显著高于泌乳期(P<0.05).围产前期奶牛瘤胃丙酸浓度显著低于泌乳期(P<0.05).2)在门的水平上,围产前期奶牛瘤胃内的优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门,泌乳期奶牛瘤胃内的优势菌门则为拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门.围产前期奶牛瘤胃内的拟杆菌门、SR1细菌、蓝菌门、柔膜菌门、TM7细菌和纤维杆菌门的相对丰度显著高于泌乳期(P<0.05),而泌乳期各阶段之间差异不显著(P>0.05);围产前期奶牛瘤胃内的变形菌门的相对丰度显著低于泌乳期(P<0.05).3)在科的水平上,围产前期奶牛瘤胃内的优势菌科为普雷沃氏菌科,而泌乳期奶牛瘤胃内的优势菌科为琥珀酸弧菌科和普雷沃氏菌科.围产前期奶牛瘤胃内的普雷沃氏菌科、瘤胃菌科、理研菌科、BS11细菌、RF16细菌、SR1细菌、Gastranaerophilales、克里斯滕森菌科、TM7细菌、RF9细菌和纤维杆菌科的相对丰度显著高于泌乳期(P<0.05);围产前期奶牛瘤胃内的琥珀酸弧菌科、毛螺菌科和韦荣球菌科则显著低于泌乳期(P<0.05).综上得出,奶牛从围产前期进入到泌乳期,瘤胃细菌多样性显著降低;泌乳期各阶段瘤胃细菌组成差异较小.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2018(030)008【总页数】9页(P3017-3025)【关键词】荷斯坦奶牛;生理阶段;瘤胃细菌;多样性【作者】李子健;李大彪;高民;王典;兰儒冰【作者单位】内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018;内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018;内蒙古自治区农牧业科学院动物营养研究所,呼和浩特 010031;内蒙古优然牧业有限责任公司,呼和浩特 010107;内蒙古优然牧业有限责任公司,呼和浩特 010107【正文语种】中文【中图分类】S823奶牛瘤胃中栖息着数量庞大，种类繁多的微生物，它们能够降解动物摄取的纤维物质，使其转化成能被自身所利用的营养物质。
瘤胃微生物多样性与定量
瘤胃微生物多样性与定量马涛;刁其玉【摘要】Ruminants are able to utilize fibrous feed as a source of energy and nutrients due to the ruminal mi-crobes, composed mainly of bacteria, fungi, and ciliate protozoa. Ruminal microbes play different roles in feed digestion and act synergistically to ferment dietary carbohydrates and proteins. This review reported the latest methods for assessment of ruminal microbial diversity, particularly molecular techniques, which allows people to gain new insights into rumen functions.%反刍动物由于瘤胃微生物的存在能够分解并利用饲料中的纤维素来提供能量和蛋白质. 瘤胃微生物主要包括细菌、真菌和原虫,三者在消化饲料过程中分工明确,共同实现碳水化合物和蛋白质的分解. 本文综述了定量瘤胃微生物群落多样性的新方法,尤其是分子生物学的应用,进一步提高人们对于瘤胃功能的认识水平.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2015(027)012【总页数】6页(P3649-3654)【关键词】瘤胃微生物;细菌;古细菌;厌氧真菌;原虫【作者】马涛;刁其玉【作者单位】中国农业科学院饲料研究所,农业部饲料生物技术重点实验室,北京100081;中国农业科学院饲料研究所,农业部饲料生物技术重点实验室,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S823;S826瘤胃具有复杂的微生物区系，主要包括细菌、原虫和真菌这3大类，由于微生物的功能使得反刍动物能够利用饲料中的营养成分生成挥发性脂肪酸以及微生物蛋白质[1]，因此瘤胃微生物的研究是反刍动物营养领域一个永恒的课题，直到20世纪80年代16S rRNA基因序列分析技术出现之前，研究人员广泛应用培养基的方法对微生物进行研究，涉及到分离、计数以及功能鉴定等技术步骤，应用该方法目前已经完成了200多种细菌和100多种原虫及真菌的鉴定。
韦荣球菌属
韦荣球菌属
(一)分类
韦荣球菌属为临床常见的革兰阴性厌氧球菌，共有9个种。
人类标本中以小韦荣球菌和产碱韦荣球菌最常见，不典型韦荣球菌、殊异韦荣球菌和蒙彼利埃韦荣球菌也偶有报道。
DNA G+C含量为36～
43mol％。
(二)临床意义
韦荣球菌属是人和动物口腔、胃肠道和女性生殖道的正常菌群，可作为条件致病菌引起内源性感染，以混合感染多见，是临床最常见的革兰阴性厌氧性球菌。
小韦荣球菌较常见于上呼吸道感染，也可引起中枢神经系统和泌尿生殖道感染，产碱韦荣球菌多见于肠道感染。
(三)生物学特性
韦荣球菌属为革兰阴性球菌，菌体极小，直径0. 3～O．5μm，成对或短链状排列，有时呈不规则聚集。
无鞭毛，无芽胞。
专性厌氧，但生长时需要有CO2。
最适生长温度为30～37℃，最适pH 6．5~8．0。
营养要求高，接种含万古霉素(7．5μg／ml)的乳酸盐琼脂平板(韦荣球菌培养基)有助于本菌的分离。
培养48小时后，形成直径1～2mm、圆形、凸起、不溶血、灰白色或灰绿色菌落。
在紫外灯照射下，菌落能出现红色荧光，但暴露于空气5～10分钟后，荧光逐渐消失。
韦荣球菌生化反应不活泼，不分解糖类，氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阳性，触酶试验一般阴性，但某些菌种能产生不典型触酶。
(四)微生物学检验
临床标本直接涂片镜检，如发现革兰阴性细小球菌、成对或短链状排列，可初步判断“疑似韦荣球菌”。
分离培养可接种血琼脂平板、厌氧血琼脂平板或韦荣球菌专用培养基，分别在厌氧和需氧环境中培养48～72小时，观察菌落形态和紫外线照射下的荧光特征，准确答定可选用商品化鉴定系统。
微生物基因组学
2,799 79 220 205
2. 原核生物基因组的编码序列
(Coding sequence)
ORF • 占原核生物基因组总序列的90％ • 基因的平均大小为1kb
2. 原核生物基因组的编码序列－－
不同生物编码序列的比较
Organism
Genome (kb) ORFs ORF size Coding Sequence(%)
Dictyostelium discoideum Chr. 2
6
Leishmania major Friedlin Chr. 1
36
Plasmodium falciparum 3D7 Chr. 3 14
Plasmodium falciparum 3D7 Chr. 2 14
Hale Waihona Puke 8,000 2571,060 947
Vibrio cholerae: 两条环状闭合双链DNA 2,961,146 bp (Chr I) 1,072,314 bp(Chr II)
Borrelia burgdorferi B31：
910,725 bp （ linear Chromosome） 21 linear and circular plasmids
系列1
研究现况及内容
细菌
研究内容
病原菌
毒力因子、致病岛、 耐药基因、耐药机制 以及与寄主的关系等
极端环境 极端环境下的生存机
生长的细 制，如嗜热菌的热稳
菌
定性
工业和环 境有影响 的细菌
CO2固定、固氮、硫 氧化 和氢代谢等
代表菌株
肺炎链球菌、致病性 大肠杆菌、沙门氏 菌等
詹氏甲烷球菌、热自 养甲烷杆菌、甲烷 嗜热菌、腾冲嗜热 菌等
瘤胃发育过程中微生物菌群和microRNA的调控作用
瘤胃发育过程中微生物菌群和microRNA的调控作用王磊【摘要】传统的藏羔羊生产方式因营养因素造成羔羊胃肠道发育迟缓、断奶过渡期长,影响了羔羊生产潜力发挥及断奶后的育肥.成年动物瘤胃已建立了十分成熟稳定的微生物生态系统,其瘤胃宿主与微生物菌群之间存在很强的特异性,外源性干预一旦停止,瘤胃微生物菌群结构和发酵谱又恢复到初始状态或干预前的状态.然而,新生或出生早期反刍动物瘤胃的发育为改变或干预瘤胃微生物生态系统提供了唯一的机会.因此,羔羊瘤胃的发育规律及瘤胃与瘤胃微生物和相关基因之间的关系成为当前反刍动物研究的热点.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2019(040)003【总页数】5页(P1-5)【关键词】瘤胃发育;微生物菌群;microRNA;调控【作者】王磊【作者单位】青海大学畜牧兽医科学院,西宁810016;青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S811.5藏羊养殖是青海高原特色、现代、生态畜牧业的支柱产业之一，对青海地区农业和畜牧业的发展起到至关重要的作用。
目前，藏羊存栏量达1 100多万只，年出栏589万只，年产藏羊肉7.5×104 t、藏羊毛1.72×104 t。
但由于青藏高原缺氧、寒冷、干燥的气候环境，牧草生长期短暂而枯草期漫长，导致牧草产量和营养供给能力下降，再加上牧民养殖知识贫乏和饲养管理粗放，藏羊的生长、生产和繁殖性能受到严重制约[1]。
传统天然放牧条件下，由于过长的哺乳期(150 d)，母乳已无法满足羔羊的生长发育需要，造成羔羊胃肠道发育迟缓，进而影响羔羊后期的生长发育和母羊的繁殖性能[2]。
早期断奶技术虽在牧区已开展应用，但其对羔羊瘤胃发育(尤其是瘤胃上皮细胞的分化)的影响机理尚不清楚，同时对羔羊后期的生长发育、生产繁殖性能也缺乏长期的追踪性调查。
因此，通过运用分子手段和基因组测序技术，了解清楚羔羊瘤胃的发育规律及瘤胃与瘤胃微生物和相关基因之间的互作关系，才能为羔羊的断奶和培育提供理论基础。
细菌种属
需氧革兰 阴性杆菌 —发酵菌 （非肠杆 菌科） 巴斯德菌 巴斯德菌属 科 假单胞菌属 昏迷单胞菌属 窄食单胞菌属 产碱杆菌属 需氧革兰 伯克霍尔德菌 阴性杆菌 假单胞菌 金色杆菌属 —非发酵 科 黄杆菌属 菌、非肠 杆菌科 莫拉菌属 不动杆菌属 玫瑰单胞菌 鞘氨醇单胞菌 放线杆菌属 阿菲菌属 巴尔通体属 鲍特菌属 鞘杆菌属 弯曲杆菌属 二氧化碳嗜纤 维菌属 心杆菌属
厌氧革兰 韦荣球菌 韦荣球菌属 阴性球菌 科 放线菌属 Actinomyces 隐秘杆菌属 阿托波菌属 革兰阳性 双歧杆菌属 无芽胞杆 放线菌科 菌 真杆菌属 乳杆菌属 动弯杆菌属 丙酸杆菌属 厌氧革兰 阴性杆菌 —形成芽 梭菌科 梭菌属 线状杆菌属 孪生球菌属 消化球菌属 消化链球菌属 厌氧革兰 阳性球菌
多杀巴斯德菌 铜绿假单胞菌（绿脓杆菌） 微小假单胞菌 睾酮单胞菌 粪产碱杆菌 洋葱伯克霍尔德菌 脑膜败血症金色杆菌 IIe群黄杆菌 卡他莫拉菌 非液化莫拉菌 鲍曼不动杆菌 洛菲不动杆菌 颈玫瑰单胞菌 血神经鞘单胞菌 人放线菌 克利夫兰阿菲菌 杆状巴尔通体 百日咳杆菌 肉芽肿鞘杆菌 大肠弯曲杆菌 芽龈二氧化碳嗜纤维菌 人心杆菌 肺炎衣原体 沙眼衣原体 鹦鹉热衣原体 伯氏考克斯体（Q热病原体） 犬埃里希体 土拉热弗朗西丝菌 流感嗜血杆菌 幽门螺杆菌 金氏菌 嗜肺菌团菌 静止嗜冷杆菌 斑疹伤寒立克次体 念珠状链杆菌 产吲哚萨顿菌 脆弱拟杆菌 核梭杆菌 不解糖卟啉单胞菌 口颊普雷活菌 产琥珀酸厌氧螺菌 叉型棍状厌氧菌 简明弯曲杆菌 惰性脱硫单胞菌
类 螺旋体
支原体
需氧革兰 阳性球菌
需氧革兰 阴性球菌
需氧革兰 阴性杆菌
细菌类、科、属、种 种 属 密螺旋体属 梅毒螺旋体 密螺旋体 疏螺旋体属 回归热螺旋体 科 钩端螺旋体属 钩端螺旋体 短螺旋体属 B aallborgi 支原体属 肺炎支原体 Mycoplasma 人支原体 支原体科 脲原体属 解脲脲原体 Ureaplasma 微球菌属 四联球菌 Micrococcus 微球菌科 葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌 Staphylococcu 表皮葡萄球菌 s 凝固酶阴性葡萄球菌 化脓性链球菌 无乳链球菌 链球菌属 犬链球菌 Streptococcus 肺炎链球菌 轻型链球菌 唾液链球菌 肠球菌属 粪肠球菌 Enterococcus 屎肠球菌 链球菌科 气球菌属 草绿色气球菌 Aerococcus 孪生菌属 麻疹双球菌 Cemella 溶血双球菌 片球菌性 乳酸片球菌 Pediococcus 微细片球菌 明串珠菌属 乳链球菌 Leuconostoc 类肠系膜链球菌 奈瑟球菌 奈瑟球菌属 脑膜炎奈瑟球菌 科 Neisseria 淋病奈瑟球菌 放线菌属 伊氏放线菌 放线菌科 Actinomyces 牛放线菌 炭疽芽孢杆菌 芽孢杆菌属 蜡状芽孢杆菌 芽孢杆菌 Vacillus 枯草芽孢杆菌 科 短杆菌属 表皮短小杆菌 Brevibacteriu 白喉棒状杆菌 棒装杆菌 棒状杆菌属 棒状杆菌JK 科 丹毒丝菌属 红斑丹毒丝菌 乳杆菌属 链状乳杆菌 乳杆菌科 李斯特菌属 产单核细胞李斯特菌 结核分支杆菌 分支杆菌 分支杆菌属 麻风杆菌 科 科
宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性
畜牧兽医学报 2023,54(7):2932-2941A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.024开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性吴祎程1,2,冉 涛3,4*,周传社1,2*,谭支良1,2(1.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室畜禽养殖污染控制与资源化技术国家工程实验室湖南省动物营养生理与代谢过程重点实验室农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站,长沙410125;2.中国科学院大学,北京100049;3.兰州大学草地农业科技学院,兰州730020;4.兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室,兰州730020)摘 要:反刍家畜瘤胃内微生物丰富多样,病毒(主要是噬菌体)亦是其重要组成部分㊂瘤胃内所有的病毒可统称为瘤胃病毒组(r u m i n a l v i r o m e ),可以利用宏基因组学(m e t a ge n o m i c s )技术进行研究㊂解析山羊瘤胃病毒组的组分及功能有望更全面地了解其在瘤胃微生态区系中的地位和作用㊂为使测序结果能覆盖瘤胃中绝大部分病毒群落,不仅在样品的预处理阶段要尽量避免病毒样颗粒的损失,而且要保证瘤胃病毒组总D N A 的提取质量和产量均满足宏基因组测序的要求㊂本研究比较了制备瘤胃液病毒组分的4种流程:(P 1)离心+稀释㊁(P 2)离心+稀释+过滤㊁(P 3)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀㊁(P 4)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀+氯仿处理㊂提取核酸后采用I l l u m i n a N o v a s e q 6000平台对瘤胃病毒基因组D N A 进行测序,并对病毒群体结构进行分析比较,以筛选出瘤胃病毒组样品制备的最优流程㊂结果表明,聚乙二醇沉淀有助于病毒核酸提取,而氯仿处理过度影响病毒组分产量;山羊瘤胃内病毒群落主要是尾状病毒目的长尾病毒科㊁肌尾病毒科和短尾病毒科噬菌体㊂研究结果为深入分析噬菌体在山羊瘤胃微生态区系中的作用奠定了基础㊂关键词:瘤胃病毒;病毒宏基因组学;高通量测序技术;D N A 提取;多样性中图分类号:S 852.65 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-2932-10收稿日期:2022-08-30基金项目:国家自然科学基金(U 20A 2057);兰州大学 双一流 建设人才项目(561120213)作者简介:吴祎程(1997-),女,湖北武汉人,硕士生,主要从事瘤胃环境病毒提取及功能研究,E -m a i l :w u y i c h e n g19@m a i l s .u c a s .a c .c n ,T e l :0731-*********通信作者:周传社,主要从事反刍家畜蛋白质营养调控与农牧复合生态系统研究,E -m a i l :z c s @i s a .a c .c n ;冉 涛,主要从事传统动物营养学㊁分子营养学及胃肠道微生物组学研究,E -m a i l :r a n t @l z u .e d u .c nE v a l u a t i o n o f t h e V i r a l C o m m u n i t y C o m po s i t i o n i n G o a t R u m e n F l u i d ,B a s e d o n M e t a g e n o m i c A n a l ys i s WU Y i c h e n g 1,2,R A N T a o 3,4*,Z HO U C h u a n s h e 1,2*,T A N Z h i l i a n g1,2(1.S o u t h C e n t r a l E x p e r i m e n t a l S t a t i o n o f A n i m a l N u t r i t i o n a n d F e e d S c i e n c e i n t h e M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e ,H u n a n P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a l N u t r i t i o n a l P h y s i o l o g y an d M e t a b o l i c P r o c e s s ,N a t i o n a l E n g i n e e r i n g L a b o r a t o r y fo r P o l l u t i o n C o n t r o l a n d W a s t e U t i l i z a t i o n i n L i v e s t o c k a n d P o u l t r y P r o d u c t i o n ,K e y L a b o r a t o r y f o r A g r o -E c o l o gi c a l P r o c e s s e s i n S u b t r o p i c a l R e g i o n ,I n s t i t u t e o f S u b t r o p i c a l A g r i c u l t u r e ,C h i n e s e A c a d e m y o f Sc i e n c e s ,C h a n g s h a 410125,C h i n a ;2.U n i v e r s i t y o f C h i n e s e A c ade m y of S c i e n c e s ,B e i j i ng 100049,Chi n a ;3.C o l l e g e o f P a s t o r a l A g r i c u l t u r e S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,L a n z h o u U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730020,C h i n a ;4.S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f H e r b a g e I m p r o v e m e n t a n d G r a s s l a n d A g r o -e c o s ys t e m s ,L a n z h o u U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730020,C h i n a )7期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性A b s t r a c t:V i r u s e s,m a i n l y b a c t e r i o p h a g e,a r e s i g n i f i c a n t c o m p o n e n t s o f t h e r u m i n a l m i c r o b i o t a i n r u m i n a n t s.A l l t h e r u m i n a l v i r u s e s a r e c a l l e d r u m i n a l v i r o m e,a n d c o u l d b e s t u d i e d b y m e t-a g e n o m i c s.U n d e r s t a n d i n g t h e c o m p o n e n t s a n d f u n c t i o n s o f g o a t r u m i n a l v i r u s e s i s e x p e c t e d t o p r o v i d e a m o r e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f r u m e n m i c r o e c o l o g y.A c c u r a t e p r o f i l i n g o f c o m-p l e x r u m e n v i r o m e r e q u i r e s D N A e x t r a c t i o n m e t h o d s t h a t p r o v i d e a d e q u a t e q u a l i t y a n d q u a n t i t y, a s w e l l a s s u f f i c i e n t c o v e r a g e o f t h e o r i g i n a l c o mm u n i t y.I n t h i s s t u d y,f o u r p r o c e d u r e s t o e x t r a c t v i r u s e s-l i k e p a r t i c l e s(V L P s)f r o m r u m e n f l u i d w e r e c o m p a r e d:(P1)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n, (P2)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n,(P3)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n+p o l y-e t h y l e n e g l y c o l(P E G)p r e c i p i t a t i o n,(P4)c e n t r i f u g a t i o n+d i l u t i o n+f i l t r a t i o n+P E G p r e c i p i-t a t i o n+c h l o r o f o r m t r e a t m e n t.T h e n u c l e i c a c i d i n f o u r p r o c e d u r e s w a s e x t r a c t e d a n d D N A c o n-c e n t r a t i o n,p u r i t y a n d i n t e g r i t y w e r e c o m p a r e d.T h e n g e n o m i c D N A s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g I l l u m i n a N o v a s e q6000a n d v i r u s p o p u l a t i o n s t r u c t u r e w a s a n a l y z e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e p o s i t i v e e f f e c t s o f f i l t r a t i o n a n d P E G p r e c i p i t a t i o n o n v i r a l n u c l e i c a c i d q u a l i t y. T h e c h l o r o f o r m t r e a t m e n t,s e v e r e l y r e d u c i n g v i r u s-l i k e p a r t i c l e s(V L P s)y i e l d,s h o u l d b e u s e d w i t h c a u t i o n w h e n p e r f o r m i n g h i g h-t h r o u g h p u t s e q u e n c i n g.T h e v i r a l c o mm u n i t i e s i n t h e r u m e n w e r e d o m i n a t e d b y b a c t e r i o p h a g e s b e l o n g i n g t o t h e v i r a l o r d e r C a u d o v i r a l e s(i.e.,M y o v i r i d a e, P o d o v i r i d a e,a n d S i p h o v i r i d a e).T h e r e s u l t s p r o v i d e t h e b a s i s f o r f u t u r e i n v e s t i g a t i o n s r e g a r d i n g t h e e c o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f v i r u s e s i n r u m e n m i c r o b i a l e c o s y s t e m s.K e y w o r d s:r u m e n v i r u s;v i r a l m e t a g e n o m i c s;h i g h-t h r o u g h p u t s e q u e n c i n g t e c h n o l o g y;D N A e x-t r a c t i o n;d i v e r s i t y*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Z HO U C h u a n s h e,E-m a i l:z c s@i s a.a c.c n;R A N T a o,E-m a i l:r a n t@ l z u.e d u.c n反刍家畜瘤胃是一个复杂且多样的微生态系统,其内栖息了细菌㊁真菌㊁原虫㊁古生菌和病毒等多种微生物,瘤胃内病毒主要由噬菌体(b a c t e r i o-p h a g e)构成[1]㊂在微生物生态系统中,病毒尤其是噬菌体的侵染作用会极大地影响微生物群落的结构及功能[2]㊂但由于病毒基因组缺乏合适标记基因和分析基准,且多数病毒无法被归类或找到对应宿主,因此,难以通过P C R等常规技术来检测未知病毒序列[3],以致病毒组研究相对滞后㊂近年来,宏基因组学和生物信息学的发展极大地促进了宏病毒组的研究,并已应用于研究不同环境样本中的病毒群落,如海洋[4]㊁土壤[5]㊁人类粪便[6]等㊂研究人员很早便关注瘤胃液中的病毒群落,陆续分离鉴定了多种瘤胃噬菌体,包括以坏死梭杆菌(F u s o b a c t e r i u m n e c r o-p h o r u m)㊁白色瘤胃球菌(R u m i n o c o c c u s a l b u s)㊁溶纤维丁酸弧菌(B u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s)和瘤胃拟杆菌(P r e v o t e l l a r u m i n i c o l a)等为宿主菌的10种噬菌体[7]㊂但是,目前仍缺乏对瘤胃病毒群落的整体认知㊂宏病毒组测序的关键在于从待测样品中富集病毒组分(v i r u s-l i k e p a r t i c l e s,V L P s),获取高质量的病毒核酸用于宏基因组测序㊂已有研究发现,D N A 病毒占据了病毒的绝大部分,本研究仅关注D N A 病毒㊂由于病毒的基因组非常小,如果直接对样品中所有的微生物组D N A进行宏基因组测序,虽然能够获得部分病毒的基因序列,但是容易丢失那些读长短㊁丰度低的病毒序列,不能真实反映病毒的群体构成[8]㊂同时,病毒组分中的噬菌体具有溶源性㊁溶菌性和慢性感染等生命周期,其中溶源性噬菌体在溶源性周期中将遗传物质整合到其细菌宿主的基因组中[9],通过生物信息学分析可以从细菌宏基因组数据中挖掘到溶源性噬菌体的基因序列,但是不能有效获取仅有溶菌性周期的噬菌体㊂因此,V L P s 的富集对全面解析样品中游离病毒组分尤为重要㊂由于瘤胃液样本具有特殊性,如存在饲料大颗粒㊁厌氧环境㊁中性偏酸环境,因此有必要建立专门的瘤胃病毒颗粒分离方法[10]㊂理想情况下,该方法应能快速㊁高效获得病毒组分,易于在实验室中操作㊂氯化铯(C s C l)密度梯度离心是病毒浓缩和纯化的常用技术之一,但是该方法需要用到超速离心3392畜牧兽医学报54卷机,不仅价格昂贵,而且操作耗时较长,更重要的是可能导致大量病毒组分的损失[11]㊂氯仿处理被认为是一种可代替C s C l密度梯度离心的快速纯化病毒的方法,其可通过破坏细菌的胞膜结构,以达到有效去除细菌的效果[12]㊂鉴于此,本研究在提取瘤胃液病毒组分基因组D N A之前,参考C a s t r o-M e jía 等[13]对人粪便样品采用的聚乙二醇(P E G8000)沉淀法,设计4种流程瘤胃液病毒组分富集流程: (P1)离心+稀释㊁(P2)离心+过滤+核酸酶处理㊁(P3)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀㊁(P4)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀+氯仿处理㊂P E G 8000广泛应用于病毒(噬菌体)的纯化过程,可使病毒沉淀,而不受其他有机质的干扰㊂本研究旨在比较过滤㊁P E G沉淀以及氯仿处理对瘤胃液样品中游离病毒组分D N A质量(产量㊁纯度和完整性)的影响,并利用I l l u m i n a N o v a s e q6000平台对获得的瘤胃病毒基因组D N A进行测序,通过对瘤胃病毒群体结构进行分析来评价不同流程对瘤胃病毒组分富集的效果,以期为进一步研究瘤胃病毒功能提供技术支撑㊂1材料与方法所有动物程序均遵循动物护理和使用指南,并经中国科学院亚热带农业研究所动物护理委员会批准(批准号I S A-W-201609)㊂选用3只体重相近((31.13ʃ3.72)k g)㊁体况良好的成年雄性湘东黑山羊作为试验动物,安装永久性瘤胃瘘管,按本团队成员曾波等[14]的报道进行术后护理和饲喂㊂试验羊的基础日粮由52%玉米秸秆㊁21.52%玉米㊁16.96%麦麸㊁5.98%豆粕㊁0.86%菜籽饼㊁1.08%尿素㊁0.60%食盐以及1%预混料组成㊂日粮营养水平为10.72%粗蛋白㊁58.76%中性洗涤纤维以及27.79%酸性洗涤纤维㊂1.1瘤胃液样品采集步骤山羊晨饲后4h,通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物,用无菌搅拌棒搅动使瘤胃内容物样品混匀,经4层无菌纱布过滤至50m L无菌离心管,离心管装至2/3处后立刻盖严,投入液氮罐中速冻,置于干冰上迅速转移至实验室,于-80ħ冰箱中保存备用㊂1.2瘤胃液病毒组分制备试验流程参考C a s t r o-M e jía的方法[13],并加以修改,以有效分析瘤胃液病毒组㊂为消除动物个体差异,将3头黑山羊的瘤胃液等体积混合,分成3份,操作流程如图1所示㊂离心:将解冻瘤胃液在4ħ下以5000ˑg离心15m i n,将液体部分转移至新的无菌离心管中,以去除瘤胃液样品中的饲料残渣;接着在4ħ下以15000ˑg转速离心30m i n,以去除其他小颗粒碎片,收集上清液㊂稀释:将上述含有游离病毒样颗粒的上清液与预冷的S M缓冲液(200m m o l㊃L-1N a C l,10m m o l㊃L-1 M g S O4,50mm o l㊃L-1T r i s p H7.5)进行1ʒ2稀释㊂过滤:通过1.0μm的玻璃纤维滤纸(W h a t-m a n,G F/C,U K)过滤,以去除瘤胃液中的粒径较大的细菌㊁原虫等,随后经过孔径为0.45μm的P V D F无菌滤膜(M i l l i p o r e B i l l e r i c a,MA,U S A)过滤,进一步去除细菌等㊂P E G沉淀:将200g P E G8000与146.1g N a C l 溶于1L蒸馏水中,经高压蒸汽灭菌后获得P E G-N a C l溶液㊂将过滤步骤后得到的上清液转移到新离心管中,向每个样品中加入25%(v/v)的P E G-N a C l溶液,于4ħ下震荡孵育22h,孵育结束后将样品于4ħ㊁13000ˑg离心45m i n,弃上清,沉淀即为病毒组分,并将其溶解于1m L预冷的0.01m o l㊃L-1磷酸盐缓冲液(P B S)中㊂氯仿处理:向获得的病毒组分浓缩液中加入等体积的氯仿,涡旋1m i n,使氯仿与样品均匀混合,形成乳状物,于4ħ㊁15000ˑg离心5m i n,小心吸取上清液至新的无菌离心管,即为病毒组分㊂1.3瘤胃液基因组D N A提取核酸酶处理:在提取D N A之前,用1.25μL D N a s e I和1.25μL R N a s e A处理样品30m i n,以消除游离D N A和R N A污染,随后在37ħ水浴中孵育10m i n,接着加入1μL100mm o l㊃L-1E D T A 使核酸酶失活,最后在65ħ下水浴孵育10m i n终止E D T A反应㊂使用D N A提取试剂盒(O m e g a D3892-01V i r a l D N A K i t,U S A)提取制备的瘤胃液病毒组分样品的核酸,提取步骤严格按照试剂盒说明书进行㊂完成病毒基因组D N A抽提后,使用Q u b i t D N A广谱分析仪(T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f-i c)测定浓度㊁O D260n m/280n m及O D260n m/230n m,并使用1.0%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测基因组D N A的完整性㊂提取的D N A样品储存在-20ħ,直至文库制备及测序㊂检测合格的D N A样品采用C o v a-r i s M220超声破碎仪将样品D N A随机打断成长度43927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性将瘤胃液混合后,分成三份按照四组流程进行处理,命名为P 1至P 4,下同㊂步骤1(离心)㊁2(稀释)为所有流程的共同步骤,且P 1只执行步骤1和2,P 2执行步骤1㊁2和3(微孔滤膜过滤),P 3执行步骤1㊁2㊁3和4(聚乙二醇沉淀),P 4执行步骤1㊁2㊁3㊁4和5(氯仿处理)T h e r u m e n f l u i d o f t h r e e g o a t s w e r e c o l l e c t e d a n d m i x e d ,t h e n d i v i d e d i n t o t h r e e p a r t s a n d p r o c e s s e d a c c o r d i n gt o f o u r r o u t e s n a m e d P 1t o P 4,t h e s a m e a s b e l o w.S t e p s 1(c e n t r i f u g a t i o n )a n d 2(d i l u t i o n )a r e t h e c o mm o n s t e p s o f a l l pr o c e s s e s ,a n d P 1o n l y p e r f o r m s s t e p s 1a n d 2,P 2p e r f o r m s s t e p s 1,2a n d 3(m i c r o p o r o u s m e m b r a n e f i l t r a t i o n ),P 3p e r f o r m s s t e ps 1,2,3a n d 4(P E G p r r e c i p i t a t i o n ),a n d P 4p e r f o r m s s t e ps 1,2,3,4a n d 5(c h l o r o f o r m t r e a t m e n t )图1 从山羊瘤胃液中分离富集病毒组分的流程示意图F i g .1 S c h e m a t i c r e pr e s e n t a t i o n o f t h e p r o c e d u r e s f o r t h e e x t r a c t i o n o f v i r u s e s f r o m g o a t r u m e n f l u i d 约为450b p 的片段,经末端修复㊁加入A 尾㊁加测序接头㊁纯化㊁P C R 全基因组扩增等步骤完成文库制备,质检合格的文库将采用I l l u m i n a N o v a s e q 6000平台进行测序(上海凌恩生物技术有限公司)㊂1.4 数据质控由于I l l u m i n a N o v a s e q 6000的原始测序数据中包含测序接头序列㊁低质量读段㊁N 率较高序列及长度过短序列,这将严重影响后续组装的质量㊂为保证后续的生物信息分析的准确性,首先对下机的原始测序数据进行质控,过滤掉低质量片段和宿主片段从而得到高质量的测序数据(c l e a n d a t a),以保证后续分析的顺利㊂原始数据已递交G e n B a n k ,登录号为P R J N A 788346㊂1.5 生物信息学分析按照R o u x 等[15]描述的方法,使用M e ga h i t (h t -t p s ://g i t h ub .c o m /v o u t c n /m e ga h i t )对高质量序列进行拼接㊁组装,挑选ȡ2000b p 的组装序列,使用如下软件进行病毒序列鉴定:V i r F i n d e r (h t t ps ://g i t h u b .c o m /je s s i e r e n /V i r F i n d e r )㊁V i r S o r t e r 2(h t -t p s ://g i t h u b .c o m /s i m r o u x /V i r S o r t e r )㊁C A T (h t -t p s ://gi t h u b .c o m /d u t i l h /C A T ),并对初步鉴定为病毒的序列进行v O T U s (v i r a l o pe r a t i o n a l t a x o -n o m i c u n i t s)分析㊂鉴定得到病毒序列后,获得其物种分类学信息,并使用V P F -C l a s s 工具对病毒进行物种注释和宿主预测㊂挑选置信度(C o n f i d e n c e _S c o r e )>0.36的结果,进行病毒科水平物种注释;挑选置信度(C o n f i d e n c e _S c o r e )>0.5且成员比对率(M e m b e r s h i p_R a t i o )超过0.3的结果,进行病毒(噬菌体)潜在宿主预测[16]㊂1.6 数据分析利用M i c r o s o f t E x c e l (M i c r o s o f t I n c .,W a s h -i n gt o n ,U S A )对数据进行初步统计,随后用S P S S 19.0(S P S S I n c .,C h i c a go ,U S A )对不同流程提取的基因组D N A 质量相关指标进行单因素方差分析(A N O V A )[17]㊂对宏基因组数据进行正态检验和方差齐性检验,符合方差分析的数据用S P S S 进行5392畜牧兽医学报54卷A N O V A分析,不符合方差分析的数据用S P S S软件进行非参数分析,P<0.01表示差异极显著, 0.01ɤP<0.05表示差异显著,0.05ɤP<0.10表示存在趋势㊂瘤胃液病毒相对丰度图㊁箱线图分别利用凌恩生物在线云平台(h t t p://c l o u d.b i o m i c r o-c l a s s.c o m/C l o u d P l a t f o r m)和联川生物在线云平台(h t t p s://w w w.o m i c s t u d i o.c n/t o o l)的工具在线绘制㊂2结果2.1不同提取流程对瘤胃病毒核酸提取质量的影响各流程提取的基因组D N A质检结果见图2㊂由图2a可知,P2流程中D N A产量显著高于P1㊁P3和P4处理流程(P<0.001)㊂P1㊁P2与P3流程获得的D N A的O D260n m/280n m均>1.90,说明提取的核酸相对纯净(图2b)㊂经氯仿处理(P4)的基因组核酸D N A,因产量过低(图2a)而不满足高通量测序需求,故没有进行后续上机建库及组学分析㊂a.核酸浓度;b.核酸纯度㊂*表示P<0.05,**表示P<0.01a.C o n c e n t r a t i o n o f n u c l e i c a c i d s;b.Q u a l i t y o f n u c l e i c a c i d s.*P<0.05a n d**P<0.01图2四种流程处理后所提取的山羊瘤胃液病毒组分的核酸质量(n=3)F i g.2Q u a l i t y o f n u c l e i c a c i d s o f r u m i n a l v i r a l-l i k e p a r t i c l e s e x t r a c t e d f r o m t h e g o a t r u m e n f l u i d i n f o u r g r o u p s(n=3)2.2不同提取流程对瘤胃病毒群落α多样性的影响使用I l l u m i n a N o v a s e q6000平台对符合测序要求的9个样本进行了病毒宏基因组学测序,共获得1058773724个r e a d s,每个样品的平均r e a d s数为117641525,范围为105495627至125358829㊂不同提取流程的瘤胃病毒α多样性指数见图3,不同提取流程对测序时获得的g o o d s_c o v e r a g e比例没有显著影响(图3a),同时不同流程间C h a o1指数(P=0.834)和S h a n n o n指数(P=0.255)均无显著差异㊂a.g o o d s_c o v e r a g e;b.C h a o1指数,用于估计群落中v O T U丰度;c.S h a n n o n指数,用来描述群落中病毒多样性a.g o o d s_c o v e r a g e;b.C h a o1i n d e x,r e p r e s e n t s t h e r i c h n e s s o f v O T U;c.S h a n n o n i n d e x,r e p r e s e n t s t h e d i v e r s i t y o f v i r u s 图3不同处理流程获得的瘤胃液病毒的α多样性指数F i g.3A l p h a d i v e r s i t y i n d e x e s o f r u m i n a l v i r o m e o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e63927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性2.3不同提取流程对瘤胃病毒群落β多样性的影响为评估不同样品处理流程对瘤胃病毒群落组成的影响,进行了基于B r a y-C u r t i s距离的P C o A分析及A N O S I M分析㊂在P C o A图中,P2流程与P1和P3在P C o A2上分开(26.01),但差异不显著(A N O S I M R=0.695,P>0.05;图4)㊂结果表明,虽然不同D N A提取流程会导致病毒群落组成的差异,但对群落组成的影响较小㊂2.4不同提取流程对瘤胃病毒群落分类学特征的影响宏基因组测序结果表明,不论采用何种瘤胃液样品病毒组分富集流程,均显示山羊瘤胃中的D N A 病毒主要为噬菌体(图5)㊂其中,绝大多数噬菌体序列来自长尾病毒科(S i p h o v i r i d a e,63.29%)㊁肌尾病毒科(M y o v i r i d a e,11.87%)和短尾病毒科(P o d o v i r i d a e,5.64%),这3个病毒科同属于有尾病图4不同处理流程对瘤胃病毒组分的主坐标分析(基于B r a y-C u r t i s距离,n=3)F i g.4P r i n c i p a l c o-o r d i n a t e s a n a l y s i s b a s e d o n B r a y-C u r t i sd i s t a n ce s of r u m i n a l v i r o m e o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n tp r o c e s s i n g p r o c e d u r e(n=3)毒目(C a u d o v i r a l e s)㊂进一步分析了不同富集流程对瘤胃病毒相对丰度的影响,结果表明P E G处理对S i p h o v i r i d a e(P<0.05)及A c k e r m a n n v i r i d a e科(P<0.01)的病毒有显著富集效果(图6)㊂a.总体瘤胃微生物组成;b.总体病毒组分组成;c.不同处理流程瘤胃液中病毒相对丰度(科水平)a.O v e r a l l c o m p o s i t i o n o f r u m e n m i c r o b i a l;b.O v e r a l l c o m p o s i t i o n v i r u s-p a r t i c l e s;c.R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r u s e s i n d i f-f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s(f a m i l y l e v e l)图5黑山羊瘤胃液中微生物组成F i g.5C o m p o s i t i o n o f r u m e n m i c r o b i a l o f b l a c k g o a t*表示P<0.05,**表示P<0.01*m e a n s P<0.05a n d**m e a n s P<0.01图6在不同流程中病毒相对丰度(n=3)F i g.6R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r a l f a m i l y i n d i f f e r e n t p r o c e s s i n g p r o c e d u r e s(n=3)7392畜牧兽医学报54卷2.5瘤胃病毒群落宿主预测利用V P F-C l a s s工具对山羊瘤胃中最丰富的4个D N A病毒科噬菌体成员进行了宿主预测,并列出了噬菌体与宿主间的对应关系(图6)㊂结果显示瘤胃病毒的宿主多为细菌,优势宿主预测排序结果为:节杆菌属(A r t h r o b a c t e r)㊁芽孢杆菌属(B a c i l-l u s)㊁噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)㊁梭菌属(C l o s-t r i d i u m)㊁乳酸球菌属(L a c t o c o c c u s)㊁分岐杆菌属(M y c o b a c t e r i u m)㊁绿脓杆菌属(P s e u d o m o n a s)㊁里氏杆菌属(R i e m e r e l l a)㊁链球菌属(S t r e p t o c o c c u s)㊂其中,M y o v i r i d a e科的噬菌体主要侵染芽孢杆菌属(B a c i l l u s)细菌,P o d o v i r i d a e科的噬菌体主要侵染噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)的细菌,而S i p h o v i r i d a e 科的噬菌体主要侵染芽孢杆菌属(B a c i l l u s)㊁梭菌属(C l o s t r i d i u m)㊁里氏杆菌属(R i e m e r e l l a)和噬纤维素属(C e l l u l o p h a g a)等属的细菌㊂图7山羊瘤胃病毒群落的潜在宿主种类预测F i g.7P r e d i c t i o n o f p o t e n t i a l h o s t s o f r u m i n a l v i r u s e s i n r u m e n f l u i d o f g o a t s2.6不同生境病毒群落比较本研究将山羊瘤胃病毒群落与其他环境,如人类粪便[4]㊁海洋[5]或土壤[6]病毒群落进行比较(图8)㊂结果表明,不同生境中病毒群落构成存在很大差异:在生境病毒群落多样性方面,以土壤生境最高;在病毒群落相对丰度方面,人类粪便和山羊瘤胃病毒群落的相似性更高,均为以S i p h o v i r i d a e科的病毒为主,但二者又有区别,体现在山羊瘤胃病毒群落具有更高丰度的M y o v i r i d a e科病毒;在病毒核酸类型方面,人类粪便和山羊瘤胃中的D N A 病毒以双链D N A(d o u b l e-s t r a i n D N A,d s D N A)病毒为主,而土壤生境中还含有微病毒科(M i c r o v i r i-d a e)㊁球状病毒科(G l o b u l o v i r i d a e)㊁矮化病毒科(N a n o v i r i d a e)等单链D N A(s i n g l e-s t r a i n D N A,s s-D N A)病毒㊂3讨论瘤胃微生物组成十分复杂,绝大多数瘤胃细菌是严格厌氧或兼性厌氧,且目前仅有很少的瘤胃细菌被分离培养,这导致基于传统培养手段的瘤胃病毒(主要是噬菌体)研究开展起来困难重重㊂近年来宏基因组学广泛运用于动物胃肠道微生态的研究,可规避体外培养微生物的限制㊂该技术也逐步应用于病毒组的研究,借助各种生物信息学分析工具,极大地推进了病毒特异性序列数据集(病毒组)的获取和分析[18]㊂高通量测序过程中,样品D N A的质量尤为关键,提高瘤胃病毒组分基因组D N A的产量及质量,可以有效地提高后续生物信息学分析的准确性㊂在核酸提取和上机测序之前,病毒组分预处理的主要作用为病毒富集和病毒纯化[11]㊂具体步83927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性图8 山羊瘤胃液㊁人类粪便[4]㊁海水[5]及土壤[6]中的病毒相对丰度F i g.8 R e l a t i v e a b u n d a n c e o f v i r a l c o m m u n i t i e s i n g o a t r u m e n f l u i d ,h u m a n f a e c e s [4],s e a w a t e r [5]a n d s o i l [6]骤需要根据所研究的样本类型进行调整㊂本研究参考C a s t r o -M e jía 等[13]提出的方法,设置了4种流程来评估过滤步骤㊁P E G 沉淀以及氯仿处理对D N A 提取质量以及宏基因组测序结果的影响㊂O D 260n m /280n m 是衡量DN A 提取质量的重要指标,会受R N A 污染以及D N A 降解的影响[19]㊂P 3流程所获得的核酸产量并不是最高的,但P 3流程O D 260n m /280n m在数值上最高,P 4流程所获得的核酸产量最低㊂病毒学研究过程中常使用传统的苯酚-氯仿提取法对病毒基因组进行提取[20],而如今市场上已经出现了多款用于从环境样品中提取病毒基因组D N A 的试剂盒[9,21]㊂本研究选用了价格为Q i a ge n 试剂盒1/5的O m e g a 病毒D N A 提取试剂盒,该试剂盒原用于提取血清病毒基因组,本研究表明,该试剂盒也能用于提取瘤胃液样品中的病毒基因组,且满足测序需求㊂不同流程间瘤胃病毒多样性并没有显著差异,这可能是由于病毒组在整体微生物组中所占比例过小,正如H e s s 等[22]报道的,即使在大多数环境中噬菌体的数量级为细菌的10倍,但由于宿主D N A (细菌和真核生物)的污染,病毒r e a d s 只占可注释D N A 的2%~5%㊂病毒群落结构分析表明,本试验选用的山羊瘤胃中的优势病毒群落依次为长尾病毒科(S i ph o v i r i -d a e )㊁肌尾病毒科(M yo v i r i d a e )和短尾病毒科(P o d o v i r i d a e ),这与前人发表的瘤胃病毒群落以长尾病毒科㊁肌尾病毒科和短尾病毒科占主导地位一致[9]㊂过滤步骤需考虑滤膜孔径大小,常用微孔滤膜孔径为0.22或0.45μm ㊂先前研究表明胃肠道中最丰富的长尾病毒科(S i ph o v i r i d a e )及肌尾病毒科(M yo v i r i d a e )都大于0.22μm [9],故本研究选用了孔径为0.45μm 的微孔滤膜㊂本研究中丰度最高的为长尾病毒科(S i ph o v i r i d a e ),也证明了0.45μm 滤膜的有效性㊂由于病毒颗粒小,在核酸提取之前,通常使用P E G 配合N a C l 来沉淀样品中的V L P s 以实现病毒的浓缩㊂本研究表明,P E G 可显著富集有尾病毒目中的长尾病毒科(S i ph o v i r i -d a e )及A c k e r m a n n v i r i d a e 科噬菌体㊂本研究还发现疱疹病毒科(H e r p e s v i r i d a e )的病毒在该瘤胃液样本中的存在,但丰度十分低㊂C s C l 密度梯度离心步骤被认为是纯化病毒的最佳方法[12],此法可对特定密度范围内的噬菌体进行纯化,并根据密度将V L P s 与其他组分分离㊂但这一技术耗时㊁昂贵且需要特定的技术技能和实验室设备㊂有研究发现,氯仿处理能代替氯化铯密度梯度离心步骤用于纯化病毒[23],此方法已成功用于9392畜牧兽医学报54卷血清病毒纯化和发酵食品病毒纯化[24-25]㊂但本研究发现,氯仿处理在瘤胃液病毒纯化中会造成大量颗粒损失,以至于不能满足高通量测序的需求㊂这是因为瘤胃细菌仍为瘤胃液的主要部分,氯仿会严重干扰包膜类物质,比如细菌,而且有些病毒也存在膜结构,膜结构被破坏后,病毒的蛋白质外壳会变得不稳定[26]㊂而部分病毒蛋白质外壳也对氯仿十分敏感,氯仿处理则造成这类病毒的大量丢失[27]㊂D N A产量也因此出现显著差异,P4提取流程的核酸因产量过低,不适用于高通量测序建库㊂因此,氯仿处理代替C s C l密度梯度离心步骤用于纯化瘤胃病毒还有待后续试验进一步研究㊂环境中病毒的多样性和丰度与微生物群落息息相关㊂有研究表明同一环境中病毒群落具有很高的相似性,而来自不同环境的病毒及其宿主分布的相似性较低[28-30]㊂反刍动物会从外界摄入大量食物,瘤胃作为一个天然发酵罐,微生物群落共生于一个相对封闭的容器中,这导致瘤胃微生物具有非常独特的群落特征[1],瘤胃液中病毒的丰富度反映了瘤胃微生物宿主的多样性㊂由于病毒宏基因组学建库限制以及测序平台对核酸样品扩增的需求,本研究主只检测了山羊瘤胃液中的D N A病毒,发现样品中主要为d s D N A病毒,它们都属于有尾病毒目㊂之前的大量研究也表明瘤胃病毒以d s D N A为主,其中大部分为有尾病毒目的噬菌体[9,21,31-32]㊂另外,由于技术的局限性,本方法提取的D N A不一定满足长读长测序平台,例如P a c B i o(w w w.p a c b.c o m) o r O x f o r d N a n o p o r e(h t t p s://n a n o p o r e t e c h.c o m)㊂此外,本试验只关注了病毒组分中d s D N A的核酸,此病毒组分富集方法是否适用于s s D N A或R N A 病毒尚不清楚[33]㊂4结论本研究比较了不同D N A提取流程对核酸产量㊁质量㊁病毒多样性以及病毒概况的影响,表明了P E G沉淀步骤对长尾病毒科及A c k e r m a n n v i r i d a e 科噬菌体具有富集作用㊂研究人员可根据试验需求进行选择,当需要重点关注这类噬菌体的情况下,可采用P3流程,即对瘤胃液进行离心㊁稀释以及微孔滤膜过滤操作,若对特定病毒没有富集需求,则采用P2流程即可,即无需进行微孔滤膜过滤步骤,此两种流程均能达到病毒宏基因组测序要求㊂基于以上结果,本试验构建了提取瘤胃液中病毒组分D N A 的流程,此方案可大大促进反刍动物瘤胃液中噬菌体群落的研究进程㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E N G W D,X I D M,MA O H M,e t a l.T h e u s e o fm o l e c u l a r t e c h n i q u e s b a s e d o n r i b o s o m a l R N A a n dD N A f o r r u m e n m i c r o b i a l e c o s y s t e m s t u d i e s:Ar e v i e w[J].M o l B i o l R e p,2008,35(2):265-274. [2] M I L L E R M E B,Y E OMA N C J,C H I A N,e t a l.P h a g e-b a c t e r i a r e l a t i o n s h i p s a n d C R I S P R e l e m e n t sr e v e a l e d B Y A m e t a g e n o m i c s u r v e y o f t h e r u m e nm i c r o b i o m e[J].E n v i r o n M i c r o b i o l,2012,14(1):207-227.[3] G I L B E R T R A,T OWN S E N D E M,C R E W K S,e ta l.R u m e n v i r u s p o p u l a t i o n s:T e c h n o l o g i c a l a d v a n c e se n h a n c i n g c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g[J].F r o n tM i c r o b i o l,2020,11:450.[4] B R E I T B A R T M,HA Y N E S M,K E L L E Y S,e t a l.V i r a l d i v e r s i t y a n d d y n a m i c s i n a n i n f a n t g u t[J].R e sM i c r o b i o l,2008,159(5):367-373.[5] B R E I T B A R T M,S A L AMO N P,A N D R E S E N B,e ta l.G e n o m i c a n a l y s i s o f u n c u l t u r e d m a r i n e v i r a lc o mm u n i t i e s[J].P r o c N a t l A c ad S c i U S A,2002,99(22):14250-14255.[6] K I M K H,C HA N G H W,N AM Y D,e t a l.A m p l i f i c a t i o n o f u n c u l t u r e d s i n g l e-s t r a n d e d D N Av i r u s e s f r o m r i c e p a d d y s o i l[J].A p p l E n v i r o nM i c r o b i o l,2008,74(19):5975-5985.[7]吴祎程,冉涛,周传社,等.反刍动物瘤胃噬菌体的宏基因组学研究方法及进展[J].畜牧兽医学报,2022,53(1):20-31.WU Y C,R A N T,Z HO U C S,e t a l.R u m e nb ac t e r i o p h a g e i n r u m i n a n t s:m e t a g e n o m e a n a l y t i c a lm e t h o d s a n d r e s e a r c h p r o g r e s s[J].A c t a V e t e r i n a r i ae t Z o o t e c h n i c a S i n i c a,2022,53(1):20-31.(i nC h i n e s e)[8] P O P O V V L,T E S H R B,W E A V E R S C,e t a l.E l e c t r o n m i c r o s c o p y i n d i s c o v e r y o f n o v e l a n de m e r g i n g v i r u s e sf r o m t h e c o l l e c t i o n o f t h e w o r l dr e f e r e n c e c e n t e r f o r e m e r g i n g v i r u s e s a n d a r b o v i r u s e s(WR C E V A)[J].V i r u s e s,2019,11(5):477. [9] F R I E D E R S D O R F F J C A,K I N G S T O N-S M I T H AH,P A C H E B A T J A,e t a l.T h e i s o l a t i o n a n d g e n o m es e q u e n c i n g o f f i v e n o v e l b a c t e r i o p h a g e s f r o m t h er u m e n a c t i v e a g a i n s t B u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s[J].F r o n t M i c r o b i o l,2020,11:1588.[10]I S L AM M M,F E R N A N D O S C,S A HA R.M e t a b o l i c04927期吴祎程等:宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性m o d e l i n g e l u c i d a t e s t h e t r a n s a c t i o n s i n t h e r u m e nm i c r o b i o m e a n d t h e s h i f t s u p o n v i r o m e i n t e r a c t i o n s[J].F r o n t M i c r o b i o l,2019,10:2412. [11] T H U R B E R R V,H A Y N E S M,B R E I T B A R T M,e t a l.L a b o r a t o r y p r o c e d u r e s t o g e n e r a t e v i r a l m e t a g e n o m e s[J].N a t P r o t o c o l s,2009,4(4):470-483.[12] B I L L E R S J,M C D A N I E L L D,B R E I T B A R T M,e ta l.M e mb r a n e v e s ic l e s i n s e a w a t e r:H e t e r o g e n e o u sD N A c o n t e n t a n d i m p l i c a t i o n s f o r v i r a l a b u n d a n c ee s t i m a t e s[J].I S M E J,2017,11(2):394-404.[13] C A S T R O-M E JÍA J L,MUHAMM E D M K,K O TW,e t a l.O p t i m i z i n g p r o t o c o l s f o r e x t r a c t i o n o fb ac t e r i o p h a g e s p r i o r t o m e t a g e n o m i c a n a l y s e s o fp h a g e c o mm u n i t i e s i n t h e h u m a n g u t[J].M i c r o b i o m e,2015,3:64.[14]曾波,康劲翮,汤少勋,等.山羊瘤胃微生物基因组D N A提取方法比较[J].农业生物技术学报,2015,23(6):823-830.Z E N G B,K A N G J H,T A N G S X,e t a l.M e t h o d sc o m p a r i s o n o f g e n o m i c D N A e x t r a c t i o n f o r r u m e nm i c r o b i o l o g y i n g o a t s(C a p r a h i r c u s)[J].J o u r n a l o fA g r i c u l t u r a lB i o t e c h n o l o g y,2015,23(6):823-830.(i n C h i n e s e)[15] R O U X S,A D R I A E N S S E N S E M,D U T I L H B E,e ta l.M i n i m u m i n f o r m a t i o n ab o u t a n u nc u l t i v a t ed v i r u sg e n o m e(M I U V i G)[J].N a t B i o t e c h n o l,2019,37(1):29-37.[16] P O N S J C,P A E Z-E S P I N O D,R I E R A G,e t a l.V P F-C l a s s:T a x o n o m i c a s s i g n m e n t a n d h o s t p r e d i c t i o n o fu n c u l t i v a t e d v i r u s e s b a s e d o n v i r a l p r o t e i n f a m i l i e s[J].B i o i n f o r m a t i c s,2021,37(13):1805-1813. [17] S P S S.I B M S P S S s t a t i s t i c s f o r W i n d o w s,v e r s i o n19.0[R].A r m o n k,N Y:I B M C o r p,2010. [18] S U T T O N T D S,H I L L C.G u t b a c t e r i o p h a g e:c u r r e n tu n d e r s t a n d i n g a n d c h a l l e n g e s[J].F r o n t E n d o c r i n o l(L a u s a n n e),2019,10:784.[19] D E S J A R D I N S P,C O N K L I N D.N a n o D r o pm i c r o v o l u m e q u a n t i t a t i o n o f n u c l e i c a c i d s[J].J V i sE x p,2010,22(45):2565.[20] D HUM IÈR E S C,T O U C HO N M,D I O N S,e t a l.As i m p l e,r e p r o d u c i b l e a n d c o s t-e f f e c t i v e p r o c e d u r e t oa n a l y s e g u t p h a g e o m e:F r o m p h a g e i s o l a t i o n t ob i o i n f o r m a t ic a p p r o a c h[J].S c i R e p,2019,9(1):11331.[21] N AMO N Y O S,WA G A C HA M,MA I N A S,e t a l.Am e t a g e n o m i c s t u d y o f t h e r u m e n v i r o m e i n d o m e s t i cc a p r id s[J].A r c h V i r o l,2018,163(12):3415-3419.[22] H E S S M,S C Z Y R B A A,E G A N R,e t a l.M e t a g e n o m i cd i s c o ve r y of b i o m a s s-d eg r a d i n g g e n e s a n d g e n o m e sf r o m c o w r u m e n[J].S c i e n c e,2011,331(6016):463-467.[23] G U O P,E l-G OHA R Y Y,P R A S A D A N K,e t a l.R a p i d a n d s i m p l i f i e d p u r i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n ta d e n o-a s s o c i a t e d v i r u s[J].J V i r o l M e t h o d s,2012,183(2):139-146.[24] W I L L N E R D,F U R L A N M,S C HM I E D E R R,e t a l.M e t a g e n o m i c d e t e c t i o n o f p h a g e-e n c o d e d p l a t e l e t-b i n d i n g f ac t o r s i n t h e h u m a n o r a l c a v i t y[J].P r o cN a t l A c a d S c i U S A,2011,108(S1):4547-4553.[25] D U G A T-B O N Y E,L O S S O U A R N J,D E P A E P E M,e t a l.V i r a l m e t a g e n o m i c a n a l y s i s of t h e c h e e s es u r f a c e:A c o m p a r a t i v e s t u d y o f r a p i d p r o c e d u r e s f o re x t r a c t i n g v i r a l p a r t i c l e s[J].F o o d M i c r o b i o l,2020,85:103278.[26] C O R D O V A A,D E S E R N O M,G E L B A R T W M,e ta l.O s m o t i c s h o c k a n d t h e s t r e n g t h o f v i r a l c a p s i d s[J].B i o p h y s J,2003,85(1):70-74.[27] F O R T E R R E P,S O L E R N,K R U P O V I C M,e t a l.F a k e v i r u s p a r t i c l e s g e n e r a t e d b y f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y[J].T r e n d s M i c r o b i o l,2013,21(1):1-5.[28] B O N I L L A-R O S S O G,S T E I N E R T,W I C HMA N NF,e t a l.H o n e y b e e s HA R B O R A d i v e r s e g u t v i r o m ee n g a g i n g i n n e s t e d s t r a i n-l e v e l i n t e r a c t i o n s w i t h t h em i c r o b i o t a[J].P r o c N a t l A c a d S c i U S A,2020,117(13):7355-7362.[29] B R E I T B A R T M,R OHW E R F.H e r e a v i r u s,t h e r e av i r u s,e v e r y w h e r e t h e s a m e v i r u s?[J].T r e n d sM i c r o b i o l,2005,13(6):278-284.[30] R O D R I G U E Z-B R I T O B,L I L L,W E G L E Y L,e t a l.V i r a l a n d m i c r o b i a l c o mm u n i t y d y n a m i c s i n f o u ra q u a t i c e n v i r o n m e n t s[J].I S M E J,2010,4(6):739-751.[31] P A R MA R N R,J A K H E S A R A S J,MOHA P A T R AA,e t a l.R u m e n v i r o m e:A n a s s e s s m e n t o f v i r a lc o mm u n i t i e s a nd t he i rf u n c t i o n s i n t h e r u m e n o f a nI n d i a n b u f f a l o[J].C u r r S c i,2016,111(5):919-925.[32] A N D E R S O N C L,S U L L I V A N M B,F E R N A N D O SC.D i e t a r y e n e r g y d r i v e s t h e d y n a m i c r e s p o n s e o fb o v i n e r u m e n v i r a lc o mm u n i t i e s[J].M i c r o b i o m e,2017,5(1):155.[33] R O U X S,S O L O N E N K O N E,D A N G V T,e t a l.T o w a r d s q u a n t i t a t i v e v i r o m i c s f o r b o t h d o u b l e-s t r a n d e d a n d s i n g l e-s t r a n d e d D N A v i r u s e s[J].P e e r J,2016,4:e2777.(编辑范子娟)1492。
益生菌在肿瘤免疫治疗中的研究进展
·专家论坛·益生菌在肿瘤免疫治疗中的研究进展姜帅铭，张家超（海南大学食品科学与工程学院，海口570228）摘要：肿瘤免疫治疗是利用免疫系统、恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。
肠道菌群能够与宿主相互作用，共同维持机体的稳态与宿主健康，在人体生理活动过程中发挥着重要作用。
肠道菌群影响肿瘤的发生、发展，各类肿瘤患者肠道菌群的紊乱情况及潜在机制也逐渐被解析。
同时在肿瘤免疫治疗过程中，患者肠道菌群也发挥了重要作用，对免疫反应的调控也会直接影响肿瘤治疗效果。
人为干预改变肠道菌群可作为提高肿瘤免疫治疗效果，实现肿瘤精确和个性化治疗的新策略，单独或与常规免疫治疗联用，干预手段有抗生素、益生菌等。
其中益生菌作为一类安全有效的微生态制剂，在干预肠道菌群进行肿瘤免疫治疗方面具有较大的发展潜力，但仍需要更多临床数据支持及机制探讨。
本文介绍了肠道微生物组与肿瘤发生、发展的关系及其相关机制，并对益生菌在肿瘤免疫治疗中的研究进展进行探讨，为益生菌的应用及益生菌干预肠道菌群影响宿主健康的机制研究提供理论支持。
关键词：益生菌；肠道菌群；肿瘤免疫治疗Research progress of probiotics in tumor immunotherapyJiang Shuaiming,Zhang JiachaoCollege of Food Science and Engineering,Hainan University,Haikou570228,Hainan,ChinaAbstract：Tumor immunotherapy is a therapeutic method that uses the immune system to restore the body′s normal anti⁃tumor immune response,to control and remove the tumor.Intestinal microbiota can maintain the homeostasis and the health of the body by interacting with the host and play a crucial role in the process of human physiological activities.More and more studies have found that intestinal microbiota affects the occurrence and development of tumors.And the disorders of intestinal microbiota and potential mechanisms in patients with tumors have also been gradually analyzed.At the same time,the intestinal flora of patients also plays a decisive role,it has been found that the regulation of immune response by intestinal microbiota may directly affect the therapeutic effect of cancer in the process of tumor immunotherapy.Artificial intervention to change intestinal microbiota can be used as a new strategy to improve the effect of tumor immunotherapy and achieve accurate and personalized treatment of cancer in combination with conventional immunotherapy.The intervention measures include antibiotics,probiotics, and so on.Among them,probiotics,a kind of safe and effective microecological agents,have great potential in tumor immunotherapy used to interfere with intestinal microbiota,but more clinical data and mechanisms are still needed.This paper introduces the relationship between intestinal microbiota with tumor and the research progress of probiotics in tumor immunotherapy,which provides theoretical support for the application of probiotics and the mechanism of probiotics affecting host health.Key words：Probiotics;Intestinal microbiota;Tumor immunotherapy1肠道微生物和益生菌概述肠道菌群是指生活在人体胃肠道的微生物群体，肠道菌群数量庞大，细菌数量约有10万亿［1］，与细胞比例接近1∶1，其中严格厌氧菌占据主导地位［2］。
一株牛瘤胃微生物的分离纯化及其赖氨酸合成能力的测定
国内长期 以来一直将研究的重点集中于过瘤 胃蛋 白 质保护技术上，认为只要满足到达真 胃及小肠 的非 降解蛋 白质的量就 能平衡小肠对 氨基酸 的需求 ，提 高生产性能 。但该方法有一定 的局限性。一方面， 过瘤 胃蛋 白质保护技术可能会影响瘤 胃微生物的正 常生长 ，不但减少了菌体蛋 白的产量 ，还有可能导致 瘤 胃微生 物 区系 的失 衡 ，引发 新 的问 题 ；另 一方 面 ， 到达真胃和小肠 的过瘤 胃蛋 白并不能保证可以平衡 小肠的氨基酸需求 ，反而会引起氮排出量增加 。赖 氨酸是动物所需必需氨基酸 中最为重要 的一种 ，现 已成为国际市场上发展前景最好的产品ｌｇ］。大量 的 实验研究认为牛的第一限制性氨基酸是赖氨酸 。当 赖氨酸与蛋氨酸的比例为 ３：１时，能够有效 的提高 奶牛的产奶量［１］。因此 ，满足到达小肠的赖氨酸量 ， 就能够在一定程度上解除牛体 的营养限制，提高蛋
ｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｏｆ １．２０ ｍｇ／Ｌ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ｌｙｓｉｎｅ．
ＫＥＹＷＯＲＩ￣ ：ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｍ ｅｎ；ｌｙｓｉｎｅ；１６ ＳｒＤＮＡ ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｅ ｍ ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｎｌｅｎ ａｎ ｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｌｙｓｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｂｉｌｉｔｙ ＦＵ Ｓｈｕａｉ ，ＴＩＡＮ Ｙｕ－ｍｉ￣ ，ＺＨ ＡＮＧ Ｌｉ－ｌｉ ，ＳＵ Ｙｕ－ｈｏｎｇ ，ＸＵ Ｙｕｎ－ｈｅ ，ＤＩＮＧ Ｈｏｎｇ－ｔａｏ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎｚｈｏｕ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１００１，Ｃｈｉｎａ ２．Ｃｏ ｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｉｎｚｈｏｕ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１００１，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔＯ ｓｏｌｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｔｈａｔ ｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｍｅｎ ｃａｎ ｔ ｆｉｔ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｌｙｓｉｎｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｍｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｊｕｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｆｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６ ＳｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓ ｔｈｅ ｍ ｏｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ，ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍ ｉｌａｒｉｔｙ ｉｓ ９９ ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃｏ— ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ，ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ．Ｔｈｅ ｌｙｓｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｓ ４．０１ ｍｇ／Ｌ，ｓｉｇｎｉｆｉ—
奶牛瘤胃中小韦荣球菌的分离鉴定
１０ ２ ； ３ ０ ６
［ 收稿 日期］ ０ １— ７— ３ ［ ２１ ０ ０ 文献标识码 ］ ［ Ａ 文章编号 ］０ ２—１８ ２ １ ）０ —０ １ ０ ［ １０ ２ ０（０ ２ １ ０３— ３ 中图分类号］ ８ ２６ ￥ ５ ．
［ 摘
要］ 采取健康奶牛瘤 胃液， 用小韦荣球菌特异性培养基从瘤 胃液 中初步分离小韦荣球菌， 再
奠定 基础 。
丙酸的厌氧球菌 ， 但是不发酵碳水化合物 ， 却能发
酵短链 脂 肪酸 如琥 珀 酸盐 和丙酮 酸盐 等 。 反刍动 物 的能量代 谢不 同于单 胃动物 ， 主要 靠 瘤 胃微 生 物发 酵 产 生 的 乙酸 、 酸 、 丙 丁酸 等 挥 发 性
脂肪酸供能。体 内 ９ ％的葡萄糖是 由糖异生供给 ０ 的 ， 中生糖 先质 丙酸 经肝 脏糖 异 生生 成 的葡 萄 糖 其
等 购 自 Ｓｇ 公 司 。生化 反 应 管 （ １种 ） 自杭 州 ｉ ｍａ ３ 购
小韦荣 球菌 （ ｅｌ ｅａｐ ｒ ｌ） 瘤 胃内 的一 Ｖｉｏ ｌ ａｖ ａ 是 ｌｎ ｌ ｕ 种革 兰 氏阴性菌 ， 唯一能 发酵 乳 酸盐 产 生 乙酸 和 是
微 生物 发酵产 生丙 酸 的 比例 ， 防治 围产 期奶 牛能 为
量代谢障碍性疾病开辟新 的途径。
研究 主要 是 针 对 小 韦荣 球 菌 能 利 用 乳 酸 发 酵 产生 丙 酸的特 点 ， 用瘤 胃微生 态理 论 ， 离 、 定瘤 分 鉴 胃内丙 酸生成优 势 菌一小 韦 荣球 菌 ， 为研 制 通过 调 控瘤 胃微 生 物发 酵 乳 酸 而 生 成 丙 酸 的微 生 态 制 剂
约 占 ５ ％ 一６％ 。 干物质 摄入减 少 ， ０ ０ 能量负 平衡 是
肠道微生态
肠道微生态失衡与重症
18
正常的肠道微生态
• 正常情况下，肠道微生态是动态平衡且相对稳定 • 微生态系统组成：正常微生物群与其宿主的微环境 • 肠道微生物群主要由肠道菌群构成，包括3大类：
与机体共生的 生理性菌群
潜在的 条件致病菌群
侵入性病原菌群
微生态 生理状态
Round JL, Mazmanian SK. Nat Rev Immunol. 2009 May;9(5):313-23 Clemente JC, et al. Cell. 2012 Mar 16;148(6):1258-70
抗生素后 耐药菌蔓延
抗生素减少肠道益生菌，增加机体感染的易感性
Science. 2016 Apr 29;352(6285):535-8
抗生素影响肠道菌群
伪膜性肠炎
金黄色葡萄球菌肠炎
病毒性肠炎 霉菌性肠炎
伪膜性肠炎：主要发生于结肠的急性粘膜坏死性炎症，并覆有伪膜 常见于应用抗生素治疗之后
营养素与肠道微生态影响机体代谢
中枢机制
食欲，饱腹感 能量消耗 代谢功能 能量平衡 代谢功能 肝 胰脏 胃肠道组织
免疫 细胞
胃肠 激素
传出 神经元
胃肠道管腔内
营养素 肠道微生态 黏液层 胆汁酸
肠道微生态、黏液层、胆汁酸和营养素之间的相互作用相结合影响体内新陈 代谢和能量平衡
Nieuwdorp M, et al. Gastroenterology. 2014 May;146(6):1525-33 13
重症感染导致肠道菌群失衡
• 入选病例:N=25,严重SIRS， CRP >10 mg/dL, ICU治疗 2天+
双歧杆菌
瘤胃中小韦荣球菌H2基因组文
乳酸代谢示意图
一、小韦荣球菌的分离鉴定
1 小韦荣球菌的分离 对健康奶牛进行瘤胃穿刺，抽取瘤胃
液，滤网过滤，在小韦荣球菌特异厌氧培 养基上进行分离培养，根据菌落特征，选 取可疑菌落，纯培养后进行形态学、染色 特性、生化特性等初步鉴定 。
图1 小韦荣球菌株的形态学鉴定结果 fig1.Resultof mophoric identification for
veillonella parvula
2 小韦荣球菌的鉴定
⑴生化反应鉴定法：
鉴阿木鼠山葡甘果半蔗麦纤乳蕈淀菊
定拉
李梨萄露
乳
芽维
管伯糖糖糖糖糖糖糖糖糖二糖糖粉糖
糖
糖
结- - - - - - - - - - - - - - 果
鉴甘山赤肌侧苦水七尿还靛半硫明胆
定露梨藓
金杏杨叶
原基固化
管醇醇醇醇盏仁苷苷素硝质体氢胶汁
反刍动物的能量代谢不同于其他动物，
主要靠瘤胃微生物发酵产生的乙酸、丙酸、 丁酸等挥发性脂肪酸供能，而由生糖先质丙 酸经肝脏糖异生生成的葡萄糖约占45～ 50%。根据这些特点，运用微生态理论，通 过筛选、改造与丙酸生成有关的瘤胃发酵 菌，调控瘤胃微生物发酵产生乙酸、丙酸的 比例，为防治围产期奶牛能量代谢障碍性疾 病开辟新的途径 。
M2：1kbMarker
5kb3kb图6 DNA鉴定图三、中目的基因的克隆
筛选基因是分子生物学研究中获得目的基 因的主要方法，通常使用放射性同位素标记的核酸探 针进行。放射性同位素标记的探针虽然进行膜杂交灵 敏度高,但其有放射性污染, 探针保存时间短,实验周 期长。本研究运用地高辛标记探针技术筛选，地高辛 是一种类固醇半抗原化合物，其抗体与其他任何固醇 类似物无交叉反应，用地高辛标记探针对人无害，不 受半衰期限制，实验操作简单, 实验周期短, 探针可 保存1酸
16SrRNA指纹分析技术在瘤胃微生物研究中的应用
16SrRNA指纹分析技术在瘤胃微生物研究中的应用饲料研究FEED RESEARCH NO .2,201110综述16SrRNA 指纹分析技术在瘤胃微生物研究中的应用艾丹郭春华尹永志严锦绣于婷婷曹龙凯西南民族大学生命科学与技术学院收稿日期：2010 - 09 - 29基金项目：四川省科技厅应用基础项目（编号：07JY029-129）通信作者：郭春华在瘤胃微生物多样性的研究中，前人通常将动物消化道微生物群落与宿主的关系归纳为共栖或互惠共生。
但是，共栖不能正确地描述动物消化道微生物群落个体对于其他个体或宿主的有益作用（Backhed 等，2005）。
现在，许多研究者将瘤胃微生物看作一个群体，去研究整个群体中一些菌所起的作用，研究不同微生物代谢和次生代谢间的关系等，最终期望组建有明确目的的微生物群体等。
近年来，以细菌核糖体RNA 序列(16SrRNA)分析为基础的未培微生物研究技术的发展大大拓展了瘤胃微生物研究的内容，通过对细菌的分类和进化标记基因16SrRNA 基因进行测序，全面深入地反应环境微生物群落结构的多样性，使人们对瘤胃微生物有了新的认识（Janssen 等，2008）。
1 瘤胃微生物的多样性瘤胃微生物群落体现出典型的动物消化道群落结构特点。
瘤胃中的微生物主要分为细菌、古菌和真核生物3类。
成年牛瘤胃中栖息的微生物包括，细菌(超过200种，活菌数高达1 000 亿个/mL)、原虫(超过25个属，其数量为1万~100 万个/mL)、真菌（5个属，真菌孢子0.1~10 万个/mL）和古菌，噬菌体颗粒数可达0.1~10 亿个/mL。
1.1 瘤胃细菌细菌约占瘤胃生物量的50 ％~80 ％,并在瘤胃发酵中起着决定性作用。
目前在瘤胃微生物的研究中，以细菌的研究最为深入。
16SrRNA 系统分类表明厚壁菌门，革兰阳性菌约为59.7 ％~76.7 ％,而革兰阴性菌比例约为22.5 ％~34.4 ％,另外还含有比例较少的螺旋原虫，放线菌门和变形菌门等类群（Ozutsumi 等，2005；Sundset 等，2007；Tajima 等，2007）。
利用微生态制剂治疗奶牛瘤胃酸中毒
利用微生态制剂治疗奶牛瘤胃酸中毒张洪伟1，赵伍祥1，于滨1，毛森1，许翊冉1，武震钢1，张彤1，宋连杰1，王亚男1*，佟建南2（1.承德市农林科学院，河北承德067000；2.秦皇岛市山海关区农业综合行政执法大队，河北秦皇岛066200）摘要：奶牛瘤胃酸中毒病是奶牛养殖过程普遍存在的、最为常见的一种营养代谢疾病，往往是由于奶牛采食了富含碳水化合物的精料或酸度较高的青贮类饲料导致，临床上分为急性和亚急性病例，通常表现为奶牛腹泻、产奶量下降、食欲不振、精神萎靡、角弓反张、呻吟磨牙等状况。
奶牛瘤胃酸中毒的发生不仅会给奶牛健康带来影响，同时也会给奶牛生产性能、繁殖性能带来危害，最终导致养殖场经济损失。
生产过程中，兽医人员通过实践摸索和总结得出，当奶牛出现瘤胃酸中毒时可使用复合型微生态制剂进行治疗，可为牧场节约生产成本。
关键词：奶牛；瘤胃酸中毒；微生态制剂中图分类号：S816.7；S858.23文献标志码：A文章编号：1001-0084（2022）03-0033-04Treatment of Rumen Acidosis in DairyCows with MicroecologicsZHANG Hongwei 1,ZHAO Wuxiang 1,YU Bin 1,MAO Sen 1,XU Yiran 1,WU Zhengang 1,ZHANG Tong 1,SONG Lianjie 1,WANG Yanan 1*,TONG Jiannan 2(1.Chengde Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Chengde 067000,Hebei China;2.Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Team of Shanhaiguan District,Qinhuangdao 066200,Hebei China)Abstract:Dairy cow rumen acidosis is a common nutritional metabolic disease in dairy cow breeding.It isoften caused by the intake of carbohydrate-rich concentrate or silage with high acidity.For acute and subacute cases,it is usually manifested as diarrhea,decreased milk production,loss of appetite,lethargy,opisthotonus,moaning and molaring,etc.The occurrence of rumen acidosis in dairy cows will affect the health of dairy cows,meanwhile,it will also bring harm to the production performance and reproductive performance of dairy cows,and eventually lead to economic losses of the farm.During the production process,veterinarians have found through practical exploration and have gotten the summary,when dairy cows have rumen acidosis,compound probiotics canbe used for treatment,which can save production cost for pastures.Key words:dairy cow;rumen acidosis;probiotics收稿日期：2022-04-07基金项目：河北省二期农业产业技术体系奶牛产业创新团队高效养殖岗位（HBCT2018120202）作者简介：张洪伟（1988—），男，辽宁丹东人，畜牧师，硕士，研究方向为奶牛高效生产技术。
韦荣球菌属
韦荣球菌属
(一)分类
韦荣球菌属为临床常见的革兰阴性厌氧球菌，共有9个种。
人类标本中以小韦荣球菌和产碱韦荣球菌最常见，不典型韦荣球菌、殊异韦荣球菌和蒙彼利埃韦荣球菌也偶有报道。
DNA G+C含量为36～43mol％。
(二)临床意义
韦荣球菌属是人和动物口腔、胃肠道和女性生殖道的正常菌群，可作为条件致病菌引起内源性感染，以混合感染多见，是临床最常见的革兰阴性厌氧性球菌。
小韦荣球菌较常见于上呼吸道感染，也可引起中枢神经系统和泌尿生殖道感染，产碱韦荣球菌多见于肠道感染。
(三)生物学特性
韦荣球菌属为革兰阴性球菌，菌体极小，直径0. 3～O．5μm，成对或短链。
状排列，有时呈不规则聚集。
无鞭毛，无芽胞。
专性厌氧，但生长时需要有CO
2最适生长温度为30～37℃，最适pH 6．5~8．0。
营养要求高，接种含万古霉素(7．5μg／ml)的乳酸盐琼脂平板(韦荣球菌培养基)有助于本菌的分离。
培养48小时后，形成直径1～2mm、圆形、凸起、不溶血、灰白色或灰绿色菌落。
在紫外灯照射下，菌落能出现红色荧光，但暴露于空气5～10分钟后，荧光逐渐消失。
韦荣球菌生化反应不活泼，不分解糖类，氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阳性，触酶试验一般阴性，但某些菌种能产生不典型触酶。
(四)微生物学检验
临床标本直接涂片镜检，如发现革兰阴性细小球菌、成对或短链状排列，可初步判断“疑似韦荣球菌”。
分离培养可接种血琼脂平板、厌氧血琼脂平板或韦荣球菌专用培养基，分别在厌氧和需氧环境中培养48～72小时，观察菌落形态和紫外线照射下的荧光特征，准确答定可选用商品化鉴定系统。
瘤胃微生物总DNA快速提取法研究
第27卷第1期家畜生态学报Vol.27No.1 2006年1月Acta Ecologiae Animalis Domastici J an2006瘤胃微生物总DNA快速提取法研究淡瑞芳1,龙瑞军1、23,杨予海3(1.甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州 730070;2.中国科学院西北高原生物所,青海西宁 810008;3.青海省三角城种羊场,青海刚察 812300)[摘 要] 本文介绍了一种简便快速地提取瘤胃微生物细胞总DNA的方法,该法是对提取植物的CTAB法进行改进而成。
与经典反复冻融+SDS/蛋白酶K裂解法相比,该法可在数小时内高效地提取瘤胃内容物总DNA,经琼脂糖凝胶电泳对所提取瘤胃微生物总DNA进行检测,证明所获得的瘤胃总DNA符合分子生物学操作要求。
[关键词] 瘤胃微生物;DNA提取;C TAB;SDS[中图分类号] S811.5[文献标识码] A [文章编号] 100425228(2006)0120018204 反刍动物瘤胃微生物一直是一个研究热点,但由于瘤胃是一个特殊的厌氧环境,采用传统的微生物培养不但耗时耗力,而且不能全面了解瘤胃微生物。
直接提取样品中微生物总DNA进行分析的方法,避开了纯培养的步骤,减少了处理时间[1],而且能对很多难培养的微生物进行分析。
目前报道的瘤胃微生物的DNA提取方法有三种:十二烷酰-肌氨酸/蛋白酶K裂解法,是用终浓度含2%的十二烷酰-肌氨酸和2mg/mL蛋白酶K的缓冲液裂解细胞抽提其总DNA[3](T ajima等,1999);反复冻融+SDS/蛋白酶K 裂解法[4](Barns等,1994),是将样品与抽提缓冲液混合后在-80℃和65℃间反复冷冻-消融,使细胞壁裂解,然后用SDS和蛋白酶K处理获得总DNA。
和玻璃珠破碎法是利用机械力破坏细胞壁暴露DNA[5] (Stahl等,1988)。
在这两种方法中,第二种所获得的总DNA所包含的微生物较为广泛,而第一种方法偏好于“较易裂解”的革兰氏阴性细菌,其覆盖范围相对较窄[3](T ajima,1999),第三种方法应用较为广泛,已多为研究者采用[6、7](Wood等,1998、T ajima等, 2000)。
奶牛瘤胃中小韦荣球菌的分离鉴定
奶牛瘤胃中小韦荣球菌的分离鉴定杨文艳;刘国文;逄晓阳;王哲【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)001【摘要】The experiment was conducted to isolate and identificate Veillonella parvula. The mmen fluid was adopted from healthy cow, Veillonella parvula was preliminary isolated in the rumen by specific medium, micro -biochemical reactions and 16S rDNA technique and morphology were adopted to further determine the Veillonella parvula.%采取健康奶牛瘤胃液，用小韦荣球菌特异性培养基从瘤胃液中初步分离小韦荣球菌，再用微量生化反应管和16SrDNA技术对分离菌株的生化特性和遗传特性进行鉴定，结合形态学观察结果判定所分离到的菌株为小韦荣球菌。
【总页数】3页(P13-15)【作者】杨文艳;刘国文;逄晓阳;王哲【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,长春130118;吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春130026;吉林省产品质量监督检验院,长春130022;吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春130026【正文语种】中文【中图分类】S852.6【相关文献】1.韦荣球菌与龋病和链球菌间的关系 [J], 王玉霞;周学东;李明云2.瘤胃表皮葡萄球菌的分离鉴定及其β-葡聚糖酶基因的克隆和在乳酸球菌中表达的研究 [J], 呼和;苏少锋;刘永志;刘红葵;王蕴华3.瘤胃中小韦荣球菌H2基因文库的构建 [J], 杨文艳;刘国文;王哲4.奶牛瘤胃中牛链球菌的分离鉴定 [J], 欧海龙;吴凌;夏成;赵明娟5.奶牛瘤胃中粪肠球菌的分离鉴定 [J], 赵明娟;吴凌;夏成;欧海龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
瘤胃微生物总DNA提取方法的比较
瘤胃微生物总DNA提取方法的比较李旦;杨舒黎;罗淑萍;王加启【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2006(22)9【摘要】目前如何获得完整的瘤胃微生物总DNA是对瘤胃微生物在分子水平研究中关键的一步。
瘤胃微生物总DNA分子片段很大,大概在15kb￣20kb,因此需要选择一种合适的提取方法来获得完整的总DNA片段。
笔者研究采用物理方法如玻璃珠研磨震荡法、反复冻融法、超声波破碎法、液氮研磨法等,化学方法如表面活性剂十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)、溴化十六烷三甲基铵(CetyltrimethylAmmoniumBromide,CTAB等),酶解法(溶菌酶、蛋白酶K等)相结合,并对其进行比较,选择最佳的提取方法,使其符合以后PCR扩增要求以及其它后续研究工作。
试验结果表明用玻璃珠研磨震荡加CTAB提取液的方法、反复冻融加SDS提取液的方法提取的瘤胃微生物总DNA的效果高于其它方法,并且通过电泳以及PCR检测,所提取的DNA的量适于进一步的分子生物学研究。
【总页数】5页(P1-5)【关键词】瘤胃微生物;总DNA;提取方法【作者】李旦;杨舒黎;罗淑萍;王加启【作者单位】中国农业科学院畜牧研究所动物营养学国家重点实验室;新疆农业大学农学院;新疆农业大学农学院【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.体外培养瘤胃微生物总DNA的提取与纯化 [J], 田晓娟;张志红;黄江丽;黄黄;张国华;王东升;丁建南2.山羊瘤胃微生物基因组DNA提取方法比较 [J], 曾波;康劲翮;汤少勋;王敏;韩雪峰;周传社;颜琼娴;贺志雄;谭支良3.水牛瘤胃微生物总DNA提取方法的研究 [J], 邹彩霞;周俊华;杨炳壮;韦升菊;邹优敬;张艳超4.秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法的比较试验 [J], 徐文华;韩金涛;蔡涛;辛小玲;白延琴;刘超;辛亚平5.崂山奶山羊瘤胃微生物总DNA提取方法的优化 [J], 隋昶生;王利华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小韦荣球菌
小韦荣球菌（Veillonella Pryvula）是瘤 胃中的G-小球菌，是一种不发酵碳水化合物，发 酵乳酸盐生成乙酸、丙酸两种挥发性脂肪酸的丙 酸生成优势菌。由于目前对小韦荣球菌的遗传学 背景知之甚少,它的很多功能基因及其调控序列 尚属未知,这些因素大大限制了实ACK、PTA基因) 提供 前提条件，然后根据目的要求对基因进行分子操维素膜 进行原位转移, 再行变性、中和、交联等处理。PCR 法扩 增出ＡＣＫ 探针, 随机引物法进行地高辛标记, 与处理 后的尼龙膜杂交,挑选出阳性克隆，扩增并进行测序，并 用分子生物学软件分析测序结果。
1 M 2 2
522bp
567bp
图7 DNA探针回收纯化后图片 1:ACK2 2:ACK1 M:DL2000
5kb3kb图6 DNA鉴定图三、中目的基因的克隆
筛选基因是分子生物学研究中获得目的基 因的主要方法，通常使用放射性同位素标记的核酸探 针进行。放射性同位素标记的探针虽然进行膜杂交灵 敏度高,但其有放射性污染, 探针保存时间短,实验周 期长。本研究运用地高辛标记探针技术筛选，地高辛 是一种类固醇半抗原化合物，其抗体与其他任何固醇 类似物无交叉反应，用地高辛标记探针对人无害，不 受半衰期限制，实验操作简单, 实验周期短, 探针可 保存1 年以上，并可反复使用。
反刍动物的能量代谢不同于其他动物， 主要靠瘤胃微生物发酵产生的乙酸、丙酸、 丁酸等挥发性脂肪酸供能，而由生糖先质丙 酸经肝脏糖异生生成的葡萄糖约占45～ 50%。根据这些特点，运用微生态理论，通 过筛选、改造与丙酸生成有关的瘤胃发酵 菌，调控瘤胃微生物发酵产生乙酸、丙酸的 比例，为防治围产期奶牛能量代谢障碍性疾 病开辟新的途径 。
苦 杏 仁 苷 -
水 杨 苷
七 叶 苷
尿 素
还 原 硝 酸 盐 +
靛 基 质
半 固 体
硫 化 氢
明 胶
胆 汁
结 果
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
（2）小韦荣球菌16S rRNA鉴定
根据GeneBank中小韦荣球菌 (AY196919)的16S rRNA序列，设 计、合成如下的引物序列： 5’-CTGAAGGAGGGGATTGCGTCTGAT-3’ 5’-ATAGACGGAAGCGAGATCGCGAGA-3’， 目的片段大小为1054bp。
乳酸代谢示意图
一、小韦荣球菌的分离鉴定
1 小韦荣球菌的分离 对健康奶牛进行瘤胃穿刺，抽取瘤胃 液，滤网过滤，在小韦荣球菌特异厌氧培 养基上进行分离培养，根据菌落特征，选 取可疑菌落，纯培养后进行形态学、染色 特性、生化特性等初步鉴定 。
图1 小韦荣球菌株的形态学鉴定结果 fig1.Resultof mophoric identification for veillonella parvula
2 小韦荣球菌的鉴定
⑴生化反应鉴定法：
鉴 定 管 阿 拉 伯 糖 木 糖 鼠 李 糖 山 梨 糖 葡 萄 糖 甘 露 糖 果 糖 半 乳 糖 蔗 糖 麦 芽 糖 纤 维 二 糖 乳 糖 蕈 糖 淀 粉 菊 糖
结 果 鉴 定 管
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
甘 露 醇
山 梨 醇
赤 藓 醇
肌 醇
侧 金 盏 花 醇 -
图2 16sRNA电泳图 M：DL2000 1：16sRNA电泳图 1054bp
M
library ）是 含有某种生物体全部基因的随机片段的重 组DNA克隆群体。理论上应含有基因组内 全部基因片段、携带全部遗传信息，对任 何感兴趣的基因片段的重组子，均可通过 标记探针
瘤胃中小韦荣球菌H2基因组文 库的构建及ACK基因的克隆
报告人：杨文艳 刘国文 逄晓阳 导 师：王 哲 教授
国家自然科学基金重点项目( 30230260)资助
吉林大学动物营养代谢病与中毒病研究室
前言
以围产期能量代谢障碍为病理学基础 的酮病和脂肪肝（妊娠毒血症、肥胖综合 征）是奶牛重要的群发性常见多发病，目 前认为其主要机理是能量供给不足而需求 增加所致的能量负平衡，从而导致糖和脂 肪代谢紊乱。目前国外学者主要采用补充 生糖先质（葡萄糖、丙二醇等）的办法来 防治，但存在着费时费力的主要特点。
Ampr 1
puc-18 2986bp SmaI
Ampr 1
puc-18 2986bp SmaI insert SmaI图3：构建示意图M源自1
M1
1
M2
23kb
４kb ３kb
图4 小韦荣球菌基因组DNA M：λDNA-HindIII 1：基因组DNA
图5回收3-4kbDNA 片断 M1: DL2000 1：回收3-4kbDNA片段 M2：1kbMarker
探针的获得：
根据肠道几十种菌的的保守序列设计ＡＣＫ探 针： V-ACKLL-F1：ATCAATTACTTGATATGAC V-ACKLL-R1: TACGTAGATCAGACATG 扩增长度：567bp V-ACKLL-F2：AACTGAAACAGAATTGGC V-ACKLL-R2: ATCAATTCAGCGCAACG 扩增长度：522bp
图8 也是分子生物学的基础．本实验 分离ＡＣK、PTA基因，为下一步对基因的分 子操作奠定了基础，为缓解或纠正围产期能量 负平衡，防治酮病、脂肪肝等能量代谢性疾病 的发生，也为研制通过调控瘤胃微生物发酵乳 酸而生成丙酸的微生态制剂奠定基础。