过瘤胃体外模型的测定方法

过瘤胃体外模型的测定方法

一、体外-人工模拟消化液法

1，人工唾液配方(MeDougall，1948)-用来模拟动物口腔，测定过瘤胃前的释放率

注：MgSO4（MgC12）

准确称取一定质量1.0g(精确至0.0001g)样品放入250ml碘量瓶内，每个样做三个重复，加入200ml 人工唾液，溶于少量蒸馏水中定容至1000ml)，盖紧胶塞，在39℃的恒温水浴锅内分别消化0、6和12小时(消化过程中每隔1小时振动1次)，测定溶液中产品的含量，从而求得过瘤胃产品的释放率。（先将除CaCl2以外的物质充分溶解，再将CaCl2溶解后倒入前者溶液中。使用前向其中通入二氧化碳，使其pH在8.2左右。并在39℃的水中温浴30分钟。）

➢McDougall E I. Studies on ruminant saliva, 1. The composition and output of sheep’s saliva.

Bilchemical Journal, 1948, 43: 99- 109.

2，人工模拟瘤胃液、真胃和十二指肠消化液

准确称取一定质量(精确至0.0001g)过瘤胃产品，放入50mL具塞试管底部，加入20mL人工模拟消化液(pH为6.6、5.4和2.4的缓冲溶液，分别模拟动物瘤胃、真胃和十二指肠消化道近端的消化液)，盖紧试管塞，在39℃的恒温水浴摇床内消化0、12、24、48小时，取出后冲洗、过滤，滤液定容，测定滤液中产品的含量。

计算公式:

产品瘤胃释放率(W1)=A2/A l x 100%

式中:A l-产品中有效成分的含量；A2-产品在pH 6.6缓冲溶液滤液中有效成分的含量。

产品小肠释放率(W2)=A3/A1 x 100%

式中:A3-产品在pH 2.4缓冲溶液滤液中有效成分的含量。

产品有效释放率（%）=(l-W1) x W2x100%。

➢Papas A M,Sniffen C J,Muscato T V. Effectiveness of rumen protected methionine for delivering methionine postruminally in dairy cows [J]. J Dairy Sci, 1984a, 67: 545~552.

附：人工肠液的制备

磷酸氢二钾胰蛋白酶胰脂肪酶胰淀粉酶氢氧化钠

6.8g 0.25g 9.375g 83.3mg 调pH

注：先将磷酸氢二钾加500ml水溶解，加入胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等，再定容至1000ml，用0.1M氢氧化钠调至适宜pH（6.0-8.0）；

二、体外-瘤胃液培养法

1，瘤胃液的采集

晨饲（6：00）后2小时，由瘤胃内采集足量瘤胃液灌入经预热达到39℃并通有CO2的保温瓶中灌满后，立即盖严瓶口迅速返回实验室，经4层纱布过滤后，持续充入CO2气体5分钟。然后，迅速分装至上述已预热好并通有CO2的培养瓶内，每个培养瓶加20ml瘤胃液，盖紧瓶塞放入39℃水浴摇床培养。2，瘤胃培养底物的制备

培养底物组成：淀粉3g，氯化铵0.1729g，无水硫酸钠0.0269g，以上试剂为分析纯。

3，瘤胃缓冲液的制备

体外批次培养的培养体系为60mL，其中瘤胃液与缓冲液的比例为1：2，培养底物的添加量为0.5g。采取McDougall缓冲液。

每10LGIF缓冲液含（g）：

98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO4·7H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12·H2O。

4，测定方法

称取胆碱样品lg左右，放入已经加入瘤胃液和培养液的培养瓶中(250ml)，摇动混合，向溶液充CO2，使溶液和试管内空间全部充满CO2，然后盖上带有放气阀门的橡皮塞，将其置于水浴摇床培养(39℃)，设置好摇床频率，分别于2、4、8、16、24h，每个样品取出6个瓶子，倾去上清液，剩余物用自来水冲洗三次，至水澄清，除三个样品用于下一阶段的试验，其余三个样品65℃烘干至恒重(48h)，移至干燥器内15min后称重，进行剩余物中胆碱含量，从而测定瘤胃降解率。

三、半体内法-尼龙袋法

1，尼龙袋的制作

选择孔径为35-50μm(250目-400目)的尼龙布，裁剪成15cm x 11cm的长方块，对折，用涤纶线进行双道缝合，制成长x宽为7cm x10cm的尼龙袋。边缘用烙铁熨烫，使其无散边，密封，用油性笔标号，再用自来水冲洗，浸泡50分钟，然后低温烘干至恒重，备用。

十二指肠尼龙袋：选择孔径为35~50μm尼龙布，裁成7 x 6cm的长方形，对折，然后用尼龙线或涤纶线缝双道，制成6 x 2.5cm尼龙袋。

2，实验方法

选用永久性瘘管反刍动物，分别测定不同包被产品在3，6，9，12，24h时间点的降解率。每个时间点设3个重复。预饲期14天，试验期4天，每一试验期结束后转入下一期的预饲期。

3，尼龙袋消化试验及样品的采集制备

将尼龙袋用清水洗净，于65℃烘箱中烘48h，放入干燥器中冷却称重、标号。于每一尼龙袋中准确称取包被产品，每个样品3个重复，每3个平行袋固定在一条小铁链上，按一次投入、在不同时间点取出的原则将尼龙袋分别进行0，3，6，9，12，24h瘤胃培养。

将尼龙袋从瘤胃中取出，用自来水冲洗，将尼龙袋表面的瘤胃内容物及残渣冲洗，停止微生物活动，直至冲洗干净，冲洗过程不能用手挤压袋内样品，以免增大消失率。将尼龙袋放入65℃）恒温真空干燥箱内烘干至恒重，然后将烘干恒重的尼龙袋残余物磨碎，-20℃保存待测。

具体操作程序参考rskov等（1980）的方法。

➢Rskov E R, DeB Hovell FD, Mould F .The use of the nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs [J].Animal Production, 1980, 5(3):195-213.

四、体外-小肠液冻干粉

1，小肠液冻干粉（GIF）的制备

牛/羊屠宰后立即收集全小肠食糜(十二指肠-回肠末端)，立即放在-50℃冷库中速冻，回到试验室后经冷水解冻，用双层纱布过滤后，于4℃，4000r/min离心约15min，用吸管吸去上层浮油，将上清液倒入表面皿中，置于FTS冻干机冻干，然后将冻干粉迅速分装于可封口塑料袋内，-20℃保存。

2，McDougall缓冲液的配制

每10LGIF缓冲液含（g）：

98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO4·7H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12·H2O，用0.2M盐酸调至pH 7.0。

3，胰蛋白酶活性和淀粉酶的检测

胰蛋白酶和淀粉酶的活性测定参照南京建成生物试剂盒说明书的测定方法进行。

4，操作方法

a.过瘤胃产品非降解残渣的制备

称取一定质量1.0 g(精确至0.0001g)过瘤胃胆碱于尼龙袋内，饲喂后1~2h，将尼龙袋投入到装有永久性瘤胃屡管牛/羊的瘤胃内，每只放4个尼龙袋，待饲料在瘤胃内培养16h取出，在-20℃保存备用。

b.测定方法

取出上述样品，解冻，冲洗干净，分别放入50mL三角瓶中，加入提前预热至39℃含o.4gGIF(与试验得出，McDougall缓冲液中GIF的用量为0.4g/30mL)的缓冲液30mL，放入39℃恒温水浴摇床内中速振荡16h，取出冲洗，65℃烘干，然后测定残渣中氯化胆碱的含量。

（16 h 为人工瘤胃体外培养最佳时间也是精料在瘤胃内的滞留时间）

5，计算公式

瘤胃释放率W1(%)=(A1-A2)/A1xl00%

小肠消化率W2(%)=A3xl00%。

过瘤胃有效释放率(%)=(l-W1)xW2x100%。

式：A l一袋中氯化胆碱起始质量；A2一袋中残渣中氯化胆碱.的质量；

A3一产品在小肠冻干粉缓冲液中的氯化胆碱释放率。

五、体内-真胃和小肠释放率-移动尼龙袋法