05-11,酶5维1 第六节 酶的分离纯化和活力测定
酶学第三章酶活性的测定及分离纯化
第三章酶活性的测定及分离纯化在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。
酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。
3.1 酶活性单位酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。
酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即u/ml或u/mg。
3.1.1 实用单位不同的酶采用不同的标准。
如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。
ACC合成酶的单位是：30℃，1小时转化SAM生成1nmol ACC所需的酶量。
3.1.2 国际酶活性单位1961年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下，1分钟转化1μmol底物，或转化1μN底物有关基团所需的酶量为1个单位(u)。
这是酶活性的国际单位。
3.1.3 Katal1972年，国际酶学委员会提出了一个新的酶活单位，叫katal(kat)，katal是一个很大的酶活单位，1 katal是指1秒钟转化1mol底物，或转化1N底物有关基团所需的酶量。
1 katal＝6×10u。
3.1.4 转换数在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数，可表示为：1/Kp称为一个催化循环，单位为分钟。
3.1.5 比活性酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为u/mg protein。
酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。
【高中生物】高中生物知识点：酶的制备和活力的测定
【高中生物】高中生物知识点：酶的制备和活力的测定酶的制备和活力的测定：酶活力（enzymeactivity）：也称为酶活性，是指酶在催化一定的化学反应时表现出来的能力，通常用酶促反应的速率即酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力的高低会受温度、pH、激活剂等多种因素的影响。
酶的提取一般选择在低温和适合的pH下进行，有时还要加入酶的激活剂以提高酶活力。
例如，从植物材料中提取果胶酶就是在低温、偏酸性的提取液和NaCl作激活剂的条件下进行的。
一、制备果胶酶1、实验材料和器具：新鲜的水果或蔬菜；质量分数为10%的NaCl溶液，0.1mol/L冰醋酸；研钵，剪刀，漏斗，纱布或滤纸，烧杯，精密pH试纸，试管，酒精灯，离心机，榨汁机等。
2、果胶酶的制备：（1）将50g新鲜的水果或蔬菜洗净，在预冷的研钵内用剪刀迅速剪碎后研磨，边研磨边加入质量分数为10%NaCl溶液50mL，制成匀浆。
（2）漏斗中放置滤纸或5层纱布过滤匀浆液，收集滤液。
（3）以4000r/min的离心速率离心滤液15min。
注意使用同一规格的离心管，离心管内滤液的高度不超过离心管长度的2/3，离心前要确保在离心机中对称放置的离心管（内含滤液）的质量相等。
（4）离心完毕后，果胶酶主要存在于离心管的上清液中，迅速地将上清液倒入洁净的小烧杯内，用0.1mol/L冰醋酸将pH调至3～4，在0～4℃下保存备用。
二、观察果胶酶对苹果匀浆液的作用1、用榨汁机制作苹果匀浆液，将匀浆液置于90℃的恒温水浴中保温4min。
冷却后再过滤，收集滤液。
2、取两支试管，编号为1和2，分别加入30mL滤液，再向试管1中加入30mL保存备用的上清液，向试管2中加入经过90℃水浴保温4min后的上清液30mL，振荡摇匀两支试管，置于室温下。
3、观察两支试管中苹果匀浆液的澄清程度变化，并将结果记录在下表中。
项目苹果匀浆液/mL上清液/mL90℃水浴保温4min后的上清液/mL现象澄清时间试管1 （样品管）3030试管2 （对照管）3030知识点拨：注意事项：在温度、pH影响酶活性的实验中，始终都贯穿着对照原则，而在设置对照实验时最重要的是运用单一变量原则，其中的变量就是我们所研究的对象，所以在分析实验问题时，要紧紧抓住研究变量，把其他可能影响实验结果的变量变为常量，才能保证对照实验结果的严密性和准确性。
南开大学生物化学重点及《现代生物化学》第二版课后答案
第一章蛋白质化学（17学时）【目的要求】⒈ 掌握蛋白质的概念和化学组成；蛋白质的基本结构单位——氨基酸的分类及结构；蛋白质各级分子结构的内容和特点。
2．熟悉氨基酸、蛋白质的理化性质及分离鉴定方法。
3．了解蛋白质的分子结构与功能的关系及蛋白质一级结构的测定。
【教学内容】第一节蛋白质通论一、蛋白质是生命的物质基础二、蛋白质的分类：形状；功能；组成；溶解度三、蛋白质的元素组成第二节蛋白质的基本结构单位——氨基酸一、氨基酸的基本结构特征二、氨基酸的分类及结构三、蛋白质中不常见的氨基酸四、非蛋白质氨基酸五、氨基酸的理化性质1．一般物理学性质2．氨基酸的化学性质：酸碱性质，等电点六、氨基酸的化学反应1．茚三酮反应2．亚硝酸反应3． 2．4—二硝基氟苯反应（FDNB）4．甲醛反应5．二甲基氨基萘磺酰氯反应（DNS-Cl）6．与酰化剂的反应7．α-羧基的成酯反应8．侧链基团参加的反应七、氨基酸的分离和分析鉴定1．蛋白质的水解2．氨基酸的分离鉴定：离子交换柱层析，纸层析，薄层层析第三节蛋白质的结构一、蛋白质的一级结构1．肽键和肽链2．二硫键3．蛋白质的一级结构测定——片段重叠法二、蛋白质的二级结构1．酰胺平面和蛋白质的构象：肽平面，双面角，构象，构型2．维持蛋白质构象的作用力：氢键，离子键，范德华力，疏水作用，配位键，二硫键3．蛋白质二级结构的主要类型：α-螺旋，β-折叠，β-拐角，无规卷曲三、蛋白质的超二级结构和结构域1．超二级结构2．结构域四、纤维状蛋白质结构1．角蛋白：α-角蛋白，β-角蛋白2．胶原蛋白五、蛋白质的三级结构三级结构的特点：（1）（2）（3）（4）六、蛋白质的四级结构四级结构的特征：（1）（2）（3）（4）（5）第四节蛋白质的结构与功能一、蛋白质一级结构与空间结构的关系二、一级结构与功能的关系1．一级结构的微小差别可导致生理功能的重大不同（镰刀型细胞贫血症）2．同功能蛋白质中氨基酸顺序的种属差异与生物进化三、蛋白质的空间结构与功能1．蛋白质的变性与复性2．胰岛素的结构与功能3．血红蛋白与肌红蛋白的结构与功能4．免役球蛋白的结构与功能第五节蛋白质的理化性质一、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的两性性质和等电点三、蛋白质的沉淀作用1．可逆沉淀作用：盐析与盐溶2．不可逆沉淀作用四、蛋白质的紫外吸收性质五、蛋白质的沉降作用第六节蛋白质的分离纯化与鉴定一、蛋白质分离纯化的基本原则二、细胞粉碎及蛋白质的抽提三、蛋白质分离纯化的主要方法1．离子交换柱层析法2．凝胶过滤法（分子筛）3．亲和层析法4．疏水层析法5．蛋白质沉淀法：等电点沉淀，盐析法，有机溶剂沉淀法四、蛋白质分子量的测定1．凝胶过滤2． SDS-PAGE五、蛋白质的纯度鉴定1．电泳2．等电聚焦：纯度，等电点六、蛋白质含量测定1．紫外吸收法2．染料结合法（Bradford）[返回索引]第二章核苷酸与核酸（13学时）【目的要求】1. 掌握核酸的化学组成; DNA的分子结构及生物学意义; RNA的种类及结构。
酶的分离与纯化PPT课件
2）非机械法：酶法、化学法、物理法 • 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通
透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌 外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐 酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性 差，效率低，毒性
(NH4)2SO4饱和度表
• 温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液 中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质 的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强 度溶液中，25℃时的溶解度比0℃时明显减小。这主要是 因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升 高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除 非这种酶对温度比较敏感。
蛋白质的盐析
盐析应用最广泛的是硫酸铵
• 优点 1）溶解度大 25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大 约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶 都可以被盐析沉淀出来。 2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如 0℃时，硫酸 铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对 于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格 低廉，容易获得。 • 缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。
（五）沉淀分离
1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓 度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响
酶的分离纯化
mol催化活性(Molar Catalytic Activity)表示在单位时间内，酶 分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程：
Vmax=Ko[E] Ko=Vmax/[E] Ko即为转换率(也用Kcat表示),如果每一个酶分子只有一个催 化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性.如果一个酶分子 有几个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n. 每种酶的转换率不同.下表列出了几种酶的转换率:
测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同 的仅是在加入缓冲液后再加入10 μl待测样品即可。酶活力计 算方法：
单位体积活力（u/ml）=｛ （[（0.07—样品速率）/0.07] ×100%）/50%｝×反应 液 总体积×（反应液稀释倍数/样液体积）
总活力=单位体积活力（u/ml）× 原液总体积
连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸 收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测 反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便， 一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能 用该法测定。 （1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、 旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光 度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪 的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 下表即是几种连续法的例子：
是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量， 从而计算出酶的活性.
优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活 性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。
缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪， 并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误 差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。 1.4.2 连续反应法(Continuous Method)
第六节_酶的分离纯化及其活性测定
脂肪酶
甘油 + 脂肪酸
酶活力 反应初速度 测定方法 活力单位
实例
首先 确定反应条件 20℃、pH=7，底物浓度 ℃ ， 6g/l（过量），加入 ），加入 （过量），加入2mg固体脂肪酶 固体脂肪酶 如每小时催化1 第二 确定活力单位 如每小时催化1克底物 1u= 1g/h 第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加 的曲线， 的曲线，量出反应初速度值 ，换算为脂肪的消 耗速度 如 8g/h 8g/h / 1g/h=8u 第四 换算活力 酶蛋白=4u/mg酶蛋白 第五 计算比活 8u/2mg酶蛋白 酶蛋白 酶蛋白
(2) 过程与方法 (3)
注意事项
活性测定
生物 化学
1 分离纯化
(1) (2) (3)
第六节 酶的分离纯化及其活性测定
注意事项
尽量减少酶活性的损失； 5℃， 尽量减少酶活性的损失；低温 0～5℃，有 机溶剂： 15～ 20℃；抽提液加入EDTA EDTA（ 机溶剂：-15～-20℃；抽提液加入EDTA（络合 金属）；抽提液加入巯基乙醇（防止-SH氧化 ）；抽提液加入巯基乙醇 氧化， 金属）；抽提液加入巯基乙醇（防止-SH氧化， 使酶失活）；不能过度搅拌， ）；不能过度搅拌 使酶失活）；不能过度搅拌，以免产生大量泡 使酶变性；测定酶的比活力， 沫，使酶变性；测定酶的比活力，使比活力升 酶易失活，不可烘干。 高。酶易失活，不可烘干。通常先透析出去小 分子，浓缩， 分子，浓缩，结晶或冷冻干燥制成干粉保存于 冰箱。如果是酶液，与等体积甘油混合， 冰箱。如果是酶液，与等体积甘油混合，并适 当加入竞争性抑制剂-20℃长期保存 长期保存。 当加入竞争性抑制剂-20℃长期保存。
生物 西北农林科技大学 化学
动物科技学院生物化学课程组
酶的分离纯化方法(基础教学)
酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
本文从酶原料选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常用的分离纯化方法。
关键词酶、分离纯化、方法、纯度中图分类号O6酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。
一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。
酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。
1 酶原料选择提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
2 酶的分离纯化由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。
为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。
在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。
二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。
此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。
如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。
其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。
酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。
因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。
《酶工程》课件-酶的提取与分离纯化
01
02
03
04
低温保存
将酶保存在低温条件下，如冰 箱或冰柜中，以降低酶的活性
损失。
添加稳定剂
在酶溶液中添加稳定剂，如糖 、甘油等，以增加酶的稳定性
。
真空干燥
将酶进行真空干燥处理，制成 干粉或结晶，以便长期保存。
调节pH值
通过调节酶溶液的pH值，可 以稳定酶的构象，降低酶的失
活速率。
实验操作中的安全防护措施
速率，从而计算酶活性。
荧光法
利用荧光物质作为底物，经酶 催化后产生荧光，通过测量荧 光强度变化来检测酶活性。
化学发光法
利用化学发光物质作为底物， 经酶催化后产生发光，通过测 量发光强度变化来检测酶活性 。
放射性同位素标记法
利用放射性同位素标记的底物 ，经酶催化后测量放射性强度
变化来检测酶活性。
酶的保存方法
回收率评估
计算分离纯化过程中酶的回收率，评估实验效率 和经济性。
活性评估
通过测定酶的活性，比较分离纯化前后的变化， 评估分离纯化的效果。
稳定性评估
比较分离纯化前后的酶在不同条件下的稳定性， 评估分离纯化的效果。
03
酶的活性检测与保存
酶活性检测的方法
比色法
通过酶催化特定底物反应产生 有色产物，通过比色测定反应
确保实验操作场所的清 洁和卫生，避免污染。
在操作过程中要轻柔， 避免剧烈搅拌或晃动， 以免酶失活。
注意控制实验温度和 pH值等参数，确保酶 的稳定性和活性。
在分离纯化过程中，要 密切关注实验进程，及 时处理通过电泳、质谱等技术手段检测酶的纯度，确保 达到实验要求。
佩戴防护眼镜和实验服
在进行实验操作时，务必佩戴防护眼 镜和实验服，以防止试剂溅出伤人和 避免污染衣物。
酶分离纯化过程中需要注意什么问题为什么进行酶活力酶比活力的测定
酶比活力
酶比活力是在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有 的酶活力单位数。比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位 数，一般用u/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡 量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。 利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催 化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
总活力水收率=纯化后总活力/纯化前总活力*100% 由于酶是具有生物活性的催化物质，对反应的条件要求高，所 以反应后会由于环境的变化失活。 2.酶比活力提高比：指的是反应前后的酶比活力的比值。 酶比活力提高比=纯化后比活/纯化前比活
测定酶活力需测定其初速度，如图所示，曲线的斜率表示单 位时间内产物生成量的变化，所以曲线上任何一点的斜率就 是该相应时间的反应速率。随着时间的延长，曲线逐渐平坦， 斜率降低，反应速度也就降低，显然这个时候测得的酶活力 不能代表真实的酶活力。引起酶促反应速率随时间延长而降 低的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加加速了逆反 应进行，产物对酶的抑制等等。因此，测定酶活力，应该测 定酶促反应的出速率，从而避免上述种种复杂因素对反应速 率的影响。
酸溶液提取。提取时需注意溶液的pH不能太低，以免酶变性失活。 如胰蛋白酶可用0.12mol/l硫酸溶液提取。
3.碱性溶液提取： 有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用碱
溶液提取，操作时注意pH不能过高，以免影响酶活，同时加 碱液时要一边搅拌一边缓慢加进，避免局部过碱而引起酶变 性失活。
4.有机溶剂提取： 有些酶与脂类物质结合牢固或含有较多非极性基团，可采
电点时的pH值下，酶分子的溶解度最小。为了提高酶的溶解度， 提取时pH应避开酶的等电点以提高酶的溶解度。
酶的活力测定和分离纯化
④换算活力
8g/h / 1g/h=8u
⑤计算比活
8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白
3. 酶活力的测定方法
测定完成一定反应所需的时间 测定单位时间内酶催化的化学反应量
（1）分光光度法： 利用底物/产物光吸收性质不同 选择适当波长来测定。 紫外/可见光
（2）荧光法： 利用底物/产物荧光性质的差别。
（一） 酶活力与酶促反应速度
酶活力就是酶催化反应的能力 ——能催化多快的反应 通常以测出的酶促反应速度表示
单位时间内底物的减少或产物的增加
1. 酶促反应速度的测定方法
[P]
产
V0
VX
用哪一个速度来表示
物
浓 度
反应初速度 Vo
酶促反应的速度特征呢？
0
X
反应初速度表示酶活力
时间T
产物浓度变化曲线
2.活力单位 (U)
——酶活力单位标准化
（2）Kat
在标准条件下（25 ℃ ，最适pH和最适 底物浓度）每秒钟催化1摩尔底物转化为 产物所需的酶量。 1 Kat =1 mol/s
= 60×106 IU • ——酶活力单位标准化
（3）比活力 (specific activity)
每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。 u/mg酶蛋白
酶单位（U）： 在一定条件下、一定时间内、将一定量的 底物转化为产物所需ห้องสมุดไป่ตู้酶量。
如：一 每小时催化1克底物
定 条
每小时催化1ml某浓度溶液
件 下
每分钟催化1ug底物
一定时间 一定量底物
（1）国际单位（IU）
在标准条件下（25 ℃ ，最适pH和最适底 物浓度）一分钟内催化1微摩尔底物转化 为产物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min
酶的提取纯化与活力测定
酶提取基本的方法
一.酶的分离与提取
A. 了解所分离酶在细胞中分布
细胞产生的酶有二类： 1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通 常含量高，容易得到。 2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，该类酶在细胞内往 往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。
一.酶的分离与提取
1.主要步骤：抽提、纯化、结晶 浓缩：抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐 或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。 纯化：纯化过程就是去除杂质的过程。原则：一方面是要提高酶的纯度，另一方面却也使 酶的总量不可避免有所损失。
酶提取基本的方法 C. 酶分离纯化的主要步骤
2. 酶活力与单位
二.酶活力及
在最适条件下，酶每秒钟催化1 mol 底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的 量定义为 1个Kat 。
1 Kat = 60×106 IU
2. 酶活力与单位
二.酶活力及其测定
C. 自定义的活力单位
造成的逆反应的加快
❖ 产物的抑制作用
❖ 酶本身逐渐失活
0 时间
2. 酶活力与单位 常用的酶活力单位有三种：
二.酶活力及其测定
A. 国际单位 (IU)
这种单位是由国际酶学委员会规定的。
在标准条件(25℃、最适pH、最适底物浓度)下，酶每分钟催化 1 mmol 底物转化， 这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 (IU)。
1.主要步骤为：抽提、纯化、结晶 抽提：破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮 粉或进行冰冻融解 ；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。
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四．抗体酶(abzymes)
抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了酶的属性，所以又称“催化性抗体”。
抗体酶是将抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新方法。
制备：用过渡态的类似物作为半抗原免疫动物获得有催化活性的抗体（因为催化作用的实质是专一结合的相互作用形成过渡态）。
第六节酶的分离纯化和活力测定
一．酶分离纯化的一般原则
1．材料选择：新鲜、酶含量丰富
2．所有蛋白质分离纯化的方法都适合酶
3．特别注意酶活性的保护，避免一切能引起蛋白变性的因素
4．每一步都要进行酶活力的测定，跟踪酶的去向，评价纯化方法。
二．酶活力与测定
1．酶活力：是指在一定条件下，酶催化某一化学反应的能力，以反应速度表示。
酶活力与反应速度呈正比。
2．反应速度：指单位时间内底物的减少量或产物的生成
量。
由于底物是过量的，减少量不易测准，所以通常
以测定产物的生成量为准。
3．酶活力单位：
（1）以国际单位（IU）表示,一个国际单位指在最适条件下，每分钟催化1微摩尔(μmol)底物减少
或1微摩尔产物生成所需要的酶量（250C）。
（2）Katal (kat) : 为1972年推荐新的酶活力国际单位，规定为：在最适条件下，每秒钟能催化1摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量定为1Kat。
Kat与国际单位的换算如下：1Kat = 6x107IU
4. 酶的比活力比活力= 活力单位数/毫克蛋白
5. 转换数每单位时间内，每个酶分子转换底物的分子数
转换数= V/ [E t] ，催化常数：Kcat = K2（K3）6. 测定酶活力的一般方法：在一定量的酶和过量底物的
存在下，在酶最适反应条件下，（温度、pH、离子强度
等），于反应的不同时间测定体系中产物生成量，计算
反应速度。
产物测定方法有：比色法、量气法、滴定法、
分光光度法、荧光测定法、同位素测定法、酶偶联分析
等。
例如：
三．回收率和纯化倍数
回收率= 每次总活力/第一次总活力x 100%
纯化倍数=每次比活力/第一次比活力
第四章维生素与辅酶
第一节维生素的概念与分类
一．什么是维生素（vitamin）:
维生素是参与生物生长、发育和代谢，维持生物机体正
常生命活动所必需的一类微量有机小分子物质。
二．维生素的命名和分类
1.脂溶性维生素：A 、D、E、K
2.水溶性维生素：B族，C
三．维生素的功能及分布
第二节脂溶性维生素
一．维生素A ( V A1, V A2 )
二．维生素K ( VK )
三．维生素E
四．维生素D (VD1 , VD2 )
第三节水溶性维生素与辅酶一．维生素C (VC)
二．B族维生素
1 . 维生素B1与焦磷酸硫胺素
2．维生素B2与FMN ，FAD
3．维生素B3 ( 泛酸) 与辅酶A
4．维生素B5 ( 烟酸、烟酰胺) 与NAD 、NADP
5．维生素B6 及磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺
6．维生素B7 ：生物素
7．硫辛酸
8．维生素B9 （叶酸）与四氢叶酸
9．维生素B12 钴胺素。