利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法[1]_图文_百.

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图1建立转座子突变株库的技术路线

子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在

差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但

这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化

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进行,使测序工作完全不需要人工的参与,达到省时省力的目的,从而使建库所耗时间和精力大大降低,可以由一个研究组完成而不需要大规模的协作。

图2随机引物PCR测序方法示意图

依据以上的方法,目前已经建立了有铜绿假单胞菌PA01和PAl4两个突变株库。除此之外,针对特定研究目的的某些小规模的突变株库也参考上述方法建立起来,例如Pobigaylo等根据上述方法用mini—Tn5转座子对Sinorhizobium meliloti建立了一个5000个左右的突变株库喁】6

3建立细菌突变株库的意义

建立细菌突变株库的意义不言自明:第一,建立突变株库将大大促进建库细菌的研究。对细菌基因功能的研究依赖于其突变株的构建,而其构建过程往往耗时耗力。如果已经有一个完整突变株库的话,其他研究者就不需要作这个耗时耗力的工作了,

他只需要将研究的靶基因告诉建库单位,该单位就

利用转座子建立细菌单基因突变株库的策略和方法

作者:丛延广, 胡福泉

作者单位:解放军第三军医大学基础部微生物学教研室,重庆,400038 刊名:

微生物学免疫学进展

英文刊名:PROGRESS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 年,卷(期:2008,36(2

被引用次数:0次

参考文献(8条

1.Riley M Genes and proteins of Escherichia coli K-12 (GenProtEC 1997

2.Kobayashi K.Ehrlich SD.Albertini A Essential Bacillus subtilis genes 2003(08

3.Giaever G.Chu AM.Ni L Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome 2002

4.Ecoli genomic project

5.Jacobs MA.Alwood A.Thaipisuttikul I Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa 2003(24

6.Liberati NT.Urbach JM.Miyata S An ordered,nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants 2006(08

7.Garsin DA.Urbach J.Huguet-Tapia JC Construction of an Enterococcus faecalis Tn917-mediated-gene-disruption library offers insight into Tn917 insertion patterns 2004(21

8.Pobigaylo N.Wetter D.Szymczak S Construction of a large signature-tagged Mini-Tn5 transposon library and its application to mutagenesis of Sinorhizobium meliloti 2006(06

相似文献(10条

1.学位论文毕志香Tn916诱变的嗜水气单胞菌突变株的特性分析及转座子插入位点的探讨2005

嗜水气单胞菌(Ah是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。

本文研究对象MJ-1即是采用转座子Tn916诱变技术获得的一株多个毒力因子同时缺失的突变株,将其连传20次后,Tn916仍稳定地存在于MJ-1的染色体上。分析MJ-1的生物学特性,与亲本株相比,其胞外蛋白酶(酪蛋白酶和弹性蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素和S层等几种主要毒力因子不表达;生化特性表