1、微生物保藏及基本操作技术
菌种保藏技术方案
菌种保藏技术方案
1、目的:为了保护本实验室微生物菌种资源,避免菌种死亡、退化、变异或污染.
2、方法:-80℃低温冷冻保藏
将菌种保存在-80℃冰箱中可以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。
3、适用范围：本实验室的各类微生物菌种
4、内容:
4．1仪器：-80℃超低温冰箱（价格3万左右）离心管（1ml或2ml）4．2试剂：40%的甘油溶液（保护剂）
4．3步骤：
4．3．1离心管的准备：离心管应清洗干净，并干燥后，贴上标签，标上菌号及时间，121℃下高压灭菌30min，备用；
4．3．2 40%的甘油溶液准备：首先配置40%的甘油溶液，然后高压灭菌后备用
4．3．3 样品的制备：在最适宜的条件下液体培养菌种至静止期或成熟期（细菌大约在24h左右），进行纯度检查后，菌悬液按1：1的比例甘油溶液混合均匀，分装于灭菌的离心管中，分装得时间尽量要短，注意此过程需无菌条件。
4．3．4 冻结保藏：将离心管置于-80℃超低温冰箱中保藏
4．3．5保藏周期：一般1-5年
4．3．6复苏方法：从冰箱中取出离心管，应立即放置38-40℃水浴
中快速复苏并适当快速摇动，直至内部结冰全部溶解为止，约需50s-100s。
开启离心管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
微生物保藏的名词解释
微生物保藏的名词解释微生物保藏是指将微生物种类、品种、菌株等贮藏在特定的条件下，以便进行长期保存和研究的一种方法。
随着科学技术的不断发展，微生物保藏在生物学、农业、医学等领域发挥着重要作用。
本文将主要就微生物保藏的定义、目的、方法以及其在各个领域的应用进行详细解释。
一、微生物保藏的定义微生物保藏指的是将不同类型的微生物在特定的媒体或载体上进行培养和保存的过程。
微生物包括各种细菌、真菌、病毒、藻类等微小的生物体。
通过保藏这些微生物，科学家能够长期保存并进行研究，为科学研究和应用提供基础。
二、微生物保藏的目的1. 科学研究：微生物保藏使得科学家能够获得各类微生物菌株，用于进行病原体识别、生物学机理研究、新药开发等领域的研究。
这些微生物资源对于解析生物学问题、推动疾病诊断和治疗的进展都具有重要意义。
2. 保护物种：微生物保藏有助于保护生物多样性中的微生物物种，避免因为知识和技术的流失而导致物种灭绝。
3. 实用应用：微生物保藏提供了用于产业发展和农业、环境管理等领域的微生物资源。
如利用保藏的微生物菌株进行发酵工业、环境修复、食品加工等过程。
三、微生物保藏的方法1. 冷冻保存：将微生物分离出来后，培养并将菌株保存在低温(-70℃～-196℃)下，通常使用液氮保存。
冷冻保存是一种简单且常用的方法，可以长期保藏微生物。
2. 乾燥保存：将微生物培养物蒸发至干燥状态，并放置在干燥的容器中，摄氏4℃存放。
这种方法适合于真菌和细菌的保存，可以长时间保存。
3. 冻干保存：首先将微生物培养物冷冻，然后通过低温下的真空干燥，使得水分蒸发。
最后将干燥的微生物保存在低温下。
这种方法适用于一些要求较高的微生物，有助于提高保存的成功率。
四、微生物保藏在各个领域的应用1. 农业领域：微生物保藏在农业领域有广泛的应用。
科学家能够通过保藏微生物资源，研究和利用微生物对作物的生长和产量的影响。
此外，通过保藏微生物菌株，也可以研究和应用有益微生物来增进作物的生长和抵抗病害能力。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
snt26322010微生物菌株常规保藏技术规程
snt26322010微生物菌株常规保藏技术规程一、引言微生物菌株的保藏是微生物研究中十分重要的一环，对于维持菌株的活力和纯度，保证研究和应用的可靠性具有重要意义。
本文将介绍一套微生物菌株常规保藏技术规程，以供研究人员参考和实施。
二、常用的微生物保存技术目前常见的微生物保藏技术主要包括冷冻保存法、冻干法、液氮冷冻保存法等。
下面将对各个保存技术进行详细介绍。
1.冷冻保存法冷冻保存法是目前最常用的微生物保藏技术之一。
该方法通过将微生物菌株在培养基中培养至适当生长阶段后，添加适量的甘油或乳糖等保护剂，然后迅速降温至-80°C或-196°C，使生物体内活性蛋白质等分子稳定，并避免细胞内形成冰晶破坏细胞结构。
保存期间，尽量避免频繁地退冰和冷冻，以免影响菌株的存活率和质量。
菌株保存时间可长达十年以上。
2.冻干法冻干法是常用的微生物保藏技术之一。
该方法通过将微生物菌株在培养基中培养至适当生长阶段后，通过负压冻干机将培养基中的水分逐渐蒸发，最终将细胞完全冻干，然后将冻干物以药瓶或其他密封容器保存于-20°C或-80°C冰箱中。
冻干法能够较好地保留菌株的活力和稳定性，保存期限可长达数年。
3.液氮冷冻保存法液氮冷冻保存法是用液态氮进行冷冻保存的一种技术。
菌株培养后，直接将其放入液态氮中进行保存。
该方法具有保存期限长、保存质量好的优点，适用于保藏时间较长的菌株。
保存期限可以长达数十年以上。
三、微生物菌株常规保藏步骤下面将介绍微生物菌株常规保藏的具体步骤。
1.菌种培养首先，选择需要保藏的菌株，进行预培养。
将菌株接种到适当的培养基上，在恒温摇床等有效装置上进行培养。
培养时间根据菌株的生长速度和特性而定。
2.准备保护剂在培养基成熟后，准备保护剂。
常用的保护剂有甘油和乳糖。
根据菌株的特点和需求，选择适合的保护剂。
3.菌株混合将保护剂与菌株悬浮液混合，并搅拌均匀，以确保保护剂能够充分包裹菌株。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
微生物菌种常规保藏技术规程
微生物菌种常规保藏技术规程一、前言微生物菌种的保藏是微生物研究中非常重要的一环，它对于保障菌种的长期保存和研究使用具有重要的意义。
本技术规程旨在规范微生物菌种的常规保藏技术，确保其安全、稳定和可持续使用。
二、常规保藏技术1. 冻干法（Lyophilization）：将培养的微生物菌株悬液在前冷冻过程中给予低温、高真空条件，使其中的水分直接从冰态升华为气态，从而避免了常规冻存法中由于结冰时水晶体的生成对菌体的危害，从而达到保存微生物菌株的目的。
操作步骤：a. 微生物培养物经适当稀释后应当倒入试管中，滴入约1ml 20%乳糖溶液在表面形成一层薄膜，待乳糖凝固后，在加入4ml 0.5-0.7%匀浆的2%干燥乳铁粉液，将试管摇匀，再灌入16ml混合液保持无气泡，放置于冰浴上。
b. 待培养物温度达到0摄氏度，再清洗喷雾器，灌入76％露醇20ml，培养物放入冷板上，适当时间后将试管封口放入冷板上经杀菌后真空泵连接，把真空泵打开，通过真空泵提供的条件慢慢降低压强，一般12小时后真空泵关闭。
c. 提供适当温度下作干燥处理，通常使用倍耐安减压干燥器空干40-80小时，干燥后的干燥灸试管，将试管放入吸气瓶中后置入-40—-50摄氏度低温冷冻管内低温保存(一般保存温度为—40摄氏度或更低)，备用空干矿温度—20摄氏度或更低。
2. 酶解冻存法（Enzymatic freezing）：在培养基中添加蔗糖，结合酶解冻存方法，经冻干后的菌种耐冻性和储存时间明显提高。
操作步骤：a. 将微生物分别接种于琼脂平板上，预培养24小时，取2-3份储备品。
菌液于冻干菊花瓶中进行前冷冻，真空抽气消耗20分钟。
b. 平均地用EP管管接受，采用3次“起冻—冷冻”的方法完全冻干，最后0.1至0.3ml真菌液在5摄氏下冷冻6小时，然后在5摄氏下还原18小时。
c. 移除冻存，延长试验保存时间。
必须在-80摄氏下保存。
3. 液氮冻存法（Liquid nitrogen freezing）：液氮冷冻法是现在应用最广泛的冷冻保存方法，在液氮的作用下，微生物菌种在-196摄氏度下冷冻，保持良好的生物活性。
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种保藏是一种重要的微生物资源保护方式，对于研究、应用和开发微生物具有重要意义。
以下是几种常见的菌种保藏方法及其操作步骤。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻是一种常用的微生物保藏方法，适用于大多数真菌、细菌和酵母菌。
其主要原理是将菌株保存在低温下，使其生理活动缓慢，以延长菌种的保藏时间。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，常用的保存液有甘油、甘露醇等。
4. 菌种保存：将菌株用保鲜膜包裹，放入保存管中，加入保存液，密封保存管。
5. 冷冻保存：将保存管放入低温冰箱或液氮罐中进行冷冻保存。
二、干燥保藏法干燥保藏法是一种简便、经济的保藏方法，适用于真菌、细菌、放线菌等微生物。
其基本原理是将菌种与干燥剂混合，使其水分含量降低，从而实现微生物的休眠状态。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备干燥剂：根据不同菌株的需要，选择合适的干燥剂，如硅胶、氧化钙等。
4. 菌种混合：将菌株与干燥剂按照一定比例混合均匀。
5. 干燥保存：将混合物均匀地散布在无菌培养基上，置于通风干燥的环境中进行保存。
三、冷冻冻干保存法冷冻冻干保存法是一种较为复杂的菌株保藏方法，适用于难保存的微生物，如厌氧菌、放线菌等。
其主要原理是将菌株在低温下冻结干燥，从而保护微生物的活力。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，如甘油、甘露醇等。
4. 冷冻过程：将菌株加入保存液中，放入冷冻机冷冻至低温（通常为-80℃）。
5. 冻干过程：将冷冻的菌株经过真空排气、结冰降温等步骤进行冻干处理。
微生物的菌种保藏
培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培
养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，
垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。
— 1—
• 菌种保藏方法
微 生
3.砂土管保藏法
物
将砂与土分别洗净、烘干、过筛，
的 菌 种
装于小试管中，砂土的高度约1cm， 121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3
保 藏
次。50℃烘干后经检查无误后备用。 将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子
— 1—
斜面低温保藏法操作步骤
1.斜面低温保藏法 2.固体穿刺保藏法 3.液体石蜡保藏法 4.沙土管保藏法 5.甘油保藏法
— 2—
• 菌种保藏方法操作步骤
微
生
1.斜面低温保藏法
物 的 菌
（1）贴标签 将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。 （2）接种 将待保藏的菌种用斜面接种法移接至注明菌名的试管
悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也
可直接刮下孢子与载体混匀，而后置
于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰
熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥
器中，在室温或4℃冰箱内保藏。
— 1—
• 菌种保藏方法
微
生 物 的
4.甘油悬液保藏法 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本
菌 种 保
法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃， 保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。
— 2—
• 菌种保藏方法
微
生 物 的
1.斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长
菌 种 保
完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定 时间再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保
微生物菌种保存方法及技术要点
微生物菌种保存方法及技术要点摘要：微生物保存是依据菌种变异快的特点，通过一定方法降低微生物的代谢活性，从而延长其保存期限。
本文对微生物菌种保存方法进行概述，并分别阐述药品微生物菌种的主要保存方法和工业微生物菌种主要保存方法。
只要选择恰当的保存方法，才达到良好的保存效果，真正实现保存的目的。
关键词：微生物菌种;保存方法;技术要点现阶段，微生物产业已具相当大的规模，其中在发达国家占有生产总值比重较高。
在微生物产值的不断增长的前提下，其中在工业、医药、农业等多个领域发挥着重要作用。
本文主要对工业微生物菌株和药品微生物菌株的保存方法进行分析研究，可以得出其保存方法是否合理对保持菌株的优良特性十分重要。
1、微生物菌种保存方法概述微生物菌种是一个基本的分类单元，其表型特征极其相似，并且与同属其他菌种有差异很大[1]。
环境条件对微生物菌种的繁殖过程有一定的影响，其保存的主要目的是保持菌种的原有活力和形状，更好的完成微生物检验等工作。
基于此，要做好优良的菌种的选择工作，将其代谢水平降低到最低，保证菌种不发生变异并保持相应的活性。
菌种保存方法还要考虑到保存方法的经济性与便捷性，主要是操作成本以及生产推广使用的可行性。
2、药品微生物菌保存方法阐述2.1 斜面低温保藏法此方法是一种经常使用的保藏法，主要是将微生物菌种转移培养到斜面培养基中，待到微生物菌种全部覆盖于整个斜面之后，将其低温保藏，温度一般为4℃。
通过一段时间之后，对微生物菌种按照相同的方法进行转培，通过保藏方法以及不断转培进行菌种的保藏。
该方法具有的优势主要体现在操作简单、对操作设备要求低，并且菌种的存活率比较高。
此方法适用于多种微生物菌种的短期保藏，其保存菌种的时间为几个月，并不适合需要长期保藏的菌种。
在温度为4℃的情况下，菌种一般还具有一定的代谢水平，会使菌种的活性降低。
同时，反复多次的培养菌种，容易使菌种发生变异，引发感染现象等。
2.2 石蜡油封藏法此方法主要适用于培养成熟微生物菌种斜面，采用做过无菌处理并去除水分的石蜡，将培养斜面进行封存[2]。
微生物培养及保藏标准操作规程
1. 目的规范微生物使用及保藏的相关操作，避免二次污染。
2. 范围适用于企业内所有微生物的使用及保藏3. 职责微生物保管人员负责保藏，质量监督员监督执行情况。
4. 内容4.1培养基需经验证合格后准许使用，使用前需灭菌。
4.2质检菌种的培养及菌种保藏4.2.1大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌的活化及培养固体平板法：选用适用细菌培养的培养基（如：LB培养基；营养琼脂培养基等）灭菌。
酒精灯旁打开融化的无菌培养基瓶口，在酒精灯火焰上通过2~3次后，打开无菌平皿上盖，在酒精灯火焰上在开口处灼烧2~3次，将培养基到入平皿中，盖上平皿上盖，水平放在超净台上冷却完全凝固后使用。
每次倒平板尽量将培养基到完，并及时放回冰箱4℃保存。
点燃酒精灯，酒精灯外焰灼烧接种针（环），烧至通红，冷却后，在酒精灯旁用接种针（环）轻轻挑取待活化的菌种，进行划线培养。
待长出单菌落，挑取单菌落进行液体振荡培养过夜。
平板制备示意图菌种划线培养示意图4.2.2黑曲霉的培养黑曲霉的培养选择马铃薯葡萄糖培养基，将土豆洗净去皮，切成小块，加入水煮沸20min 后，纱布过滤，清液中加入琼脂粉加热溶解后加入葡萄糖。
待葡萄糖溶解后，分装在试管中，塞上管塞，高压蒸汽灭菌后，将试管摆斜面等凝固后接种使用。
接种时用接种环挑沾取黑曲霉孢子，并在试管斜面上由内向外划波浪线。
接种完毕后塞回试管塞并在霉菌培养箱中进行培养，一般5-7天长出孢子。
孢子长出后，放置在4℃冰箱中保藏。
斜面固体培养基的制备接种环的灼烧示意图试管斜面的接种示意图4.2.3菌种的保藏菌种保藏可分为液体甘油保藏及试管斜面保藏。
大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌都采用甘油菌保藏法。
黑曲霉孢子悬液可做甘油保藏。
甘油保藏：接种环灼烧冷却后，挑取单菌落进行过夜增值培养16-18h。
移液器吸取1ml 新鲜培养物于1.5ml离心管中，4500r/min常温离心5min，弃上清。
微生物保藏及基本操作技术
人员操作水平要求高； 保藏(bǎocáng)成本高。
第二十五页，共35页。
不同保藏方法(fāngfǎ)的比较
第二十六页，共35页。
菌种保藏(bǎocáng)技术进展
程序(chéngxù)降温控制技术
Quanti Cult (REMEL)
EZ-CFU one step (MicroBioLogics)
Culti Loops (REMEL)
KWIK-STIK (MicroBioLogics)
Complicated
Standard Strains (ATCC/NBRC etc.)
Low
Accuracy
液体石蜡法
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培 养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再 直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存(bǎocún) 的一种菌种保藏方法。
第九页，共35页。
❖ 操作步骤：
液体石蜡预处理
斜面培养(péiyǎng) 物制备
灌注石蜡
保藏
第十页，共35页。
细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进
行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至
线虫和藻类。
Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. © M.Ryan / Mycologist 15: 66-69
第二十九页，共35页。
普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物 研究所
农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵(fā jiào)
《微生物菌种常规保藏技术规程》
《微生物菌种常规保藏技术规程》微生物菌种是生命科学中研究和应用广泛的重要资源。
为了确保微生物菌种的品质和数量，常规保藏技术规程是非常重要的。
本文将介绍微生物菌种常规保藏技术规程的相关内容，以期为微生物菌种的研究和应用提供参考。
一、微生物菌种常规保藏技术规程的意义微生物菌种常规保藏技术规程是为了在微生物菌种的研究和应用中提供常规保藏技术而制定的。
微生物菌种的保藏技术对微生物菌种的研究和应用具有重要意义。
通过常规保藏技术，可以有效地保藏微生物菌种，并确保其品质和数量的稳定性。
此外，常规保藏技术还可以提供可靠的微生物菌种资源，为微生物菌种的研究和应用提供支持。
二、微生物菌种常规保藏技术规程的基本要求微生物菌种常规保藏技术规程的基本要求包括以下几个方面：1.微生物菌种的收集微生物菌种的收集是常规保藏技术的第一步。
微生物菌种的收集需要尽可能地获取新鲜的微生物菌种。
此外，还需要注意微生物菌种的纯度和质量。
2.微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏是常规保藏技术的核心。
微生物菌种的保藏需要采用适当的保藏方法和条件，如适当的温度、湿度、pH值和保藏条件等。
此外，还需要注意微生物菌种的包装和运输，以保证其品质和数量。
3.微生物菌种的鉴定和评价微生物菌种的鉴定和评价是常规保藏技术的重要环节。
通过鉴定和评价，可以确定微生物菌种的品质和数量，并对其进行比较和分析。
此外，还可以通过鉴定和评价，发现微生物菌种的缺陷和不足，为微生物菌种的研究和应用提供参考。
三、微生物菌种常规保藏技术规程的应用微生物菌种常规保藏技术规程在微生物菌种的研究和应用中具有重要作用。
通过常规保藏技术，可以有效地保藏微生物菌种，并确保其品质和数量的稳定性。
此外，常规保藏技术还可以提供可靠的微生物菌种资源，为微生物菌种的研究和应用提供支持。
四、结论微生物菌种常规保藏技术规程是保证微生物菌种品质和数量的重要手段。
通过常规保藏技术，可以有效地保藏微生物菌种，并确保其品质和数量的稳定性。
常见微生物的菌种保藏及原理
（ห้องสมุดไป่ตู้）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
（二）、菌种保藏的原理
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,臵于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,臵于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上,是目前被公 认的最有效的菌种长期保藏技术之一.除了少数对低温损伤敏感 的微生物外,该法适用于各种微生物菌种的保藏,甚至连藻类、 原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏.此法的另一大 优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏,无论是孢子或菌 体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法.其缺点是需购 臵超低温液氮设备,且液氮消耗较多,操作费用较高. 要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35～40℃温 水中,使之冰冻熔化,以无菌操作打开安瓿瓶,移接到保藏前使用 的同一种培养基斜面上进行培养.从液氮罐中取出安瓿瓶时速度 要快,一般不超过1min,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量.并 且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤
工业用微生物菌种保藏的目的、原理及方法详解
工业用微生物菌种保藏的目的、原理及方法详解1、菌种保藏的目的微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。
菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。
2、菌种保藏的原理无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。
其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。
3、菌种保藏的方法（1）斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。
此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。
放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。
如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。
这一改进可使菌种的保藏期延长。
该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。
其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
（2）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。
使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
保藏实验报告
1. 了解并掌握保藏实验的基本原理和方法；2. 掌握微生物菌种保藏的方法和操作技巧；3. 培养实验操作能力，提高实验技能。
二、实验原理保藏实验是指将微生物菌种在适宜的条件下进行长期保存，使其在保存过程中不发生变异、死亡或污染。
微生物菌种保藏的原理主要有以下几点：1. 低温保藏：将微生物菌种置于低温环境中，减缓其代谢活动，降低细胞内酶的活性，从而减缓菌种的生长和变异；2. 干燥保藏：将微生物菌种进行干燥处理，使其失去水分，降低细胞内酶的活性，减缓菌种的生长和变异；3. 化学保藏：将微生物菌种进行化学处理，使其在保存过程中处于休眠状态，降低菌种的生长和变异。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）微生物菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等；（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤等；（3）试剂：无菌水、无菌甘油、无菌盐水等；（4）仪器：恒温培养箱、无菌操作台、移液枪、酒精灯、接种环等。
2. 实验仪器：（1）恒温培养箱；（2）无菌操作台；（3）移液枪；（4）酒精灯；（5）接种环。
1. 低温保藏法（1）将微生物菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃恒温培养24小时；（2）取适量菌液，加入无菌甘油，比例为1:1；（3）将菌液置于-20℃冰箱中保藏。
2. 干燥保藏法（1）将微生物菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃恒温培养24小时；（2）将菌种划线于平板上，置于37℃恒温培养箱中培养至菌落形成；（3）将菌落刮下，加入无菌盐水，使菌液浓度为1×10^8 CFU/mL；（4）将菌液滴于无菌滤纸上，室温干燥；（5）将干燥后的菌种置于密封容器中，置于-20℃冰箱中保藏。
3. 化学保藏法（1）将微生物菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃恒温培养24小时；（2）取适量菌液，加入无菌甘油，比例为1:1；（3）将菌液加入0.5 mol/L的氯化钠溶液中，使菌液浓度为1×10^8 CFU/mL；（4）将菌液分装于无菌试管中，封口；（5）将试管置于-20℃冰箱中保藏。
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熔封
将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈； 将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封； 拉管时注意火焰不要离菌体太近。
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真空度检测
用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝 光，说明真空度符合要求。
液体石蜡法
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件 下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个 斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行 保存的一种菌种保藏方法。
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操作步骤：
液体石蜡预处理
斜面培养物制备
灌注石蜡
保 藏
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微生物菌种保藏
微生物菌种保藏方法
基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休
眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的 环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优 良特性。
基本措施是低温、真空、干燥。
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菌种保藏技术进展
包埋固定化技术
是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液 加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取 传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中， 并延伸至线虫和藻类。
Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. © M.Ryan / Mycologist 15: 66-69
液体石蜡法
操作简单，使用比较方便；
对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；·
菌种易退化、污染。
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真空冷冻干燥法
指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经 预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存 后保存的一种长期菌种保存方法。
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液氮超低温冻结法
保藏时间长；
保藏效果好，菌种不易退化； 对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平 要求高； 保藏成本高。
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不同保藏方法的比较
保藏方法 定期移植法 液体石蜡法 保藏原理 低温(4℃) 低温(4℃)、阻断氧气 干燥、低温、无氧、保护 真空冷冻干燥法 剂 －80℃冰箱冻结法 低温(－80℃)、保护剂 超低温(－150℃或－196 液氮超低温冻结法 ℃)、保护剂 10 年以上 液氮运输罐及液氮罐 2～5 年 8～10 年 机、封管设备 －80℃冰箱 程控降温仪、 不易退化 高 复杂 退化 较低 复杂 保藏时间 3～6 月 1～2 年 保藏设备 冰箱 冰箱 －80℃冰箱、真空冷冻干燥 退化 低 复杂 菌种活性 易退化 退化 保藏成本 高 较高 操作性 简单 比较简单
普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物研究所 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所 抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所 兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所 林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院
安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。 打棉塞，160℃定型2h；
棉塞
标签
激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。
灭菌
121 ℃，30min.
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保护剂的准备
保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管； 灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌 20min； 打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅 速放入凉水中冷却；
30℃培养2天，无菌检查合格后备用。
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菌种保藏技术进展
玻璃化技术
就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰 晶，一下子以“非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的
破坏作用。
对于1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107℃/秒时才 能实现“玻璃化”。
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真空冷冻干燥法
保藏、运输方便；
保藏时间长(5 ～10年)； 对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操 作水平要求高； 冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。
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-80℃冰箱冻结法
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菌种保藏技术进展
程序降温控制技术
冷冻速度慢：细 胞内水分外渗多， 细胞脱水，体积 收缩。 冷度速度快：细 胞内水分没有足 够时间外渗，细 胞内结冰。
冷冻速度非常快： 细胞内冰晶非常 小或称玻璃化状 态。
冻结速度对菌种细胞的影响
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《中国微生物菌种保藏管理条例》
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微生物菌种保藏
制订专门菌种保藏管理制度； 同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；
对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保
藏设备中；
对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理； 设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。
使用方便；
保藏时间较长；
对设备要求高(-80℃冰箱)；
运输不方便。
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液氮超低温冻结法
指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃ 的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种 保藏方法。
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操作步骤
冷冻管准备 保护剂制备 保藏培养物准备 预冻
同“－80℃冰箱冻结法”
— 将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温 速率降至-35℃； — 使用程序降温盒。
保藏
将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。
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医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京Leabharlann 2012冻干样品制备
制备斜面培养物； 将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜 面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。 用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管， 操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底 部，勿使菌液沾在管壁上。
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接 种
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定期移植法
操作简单，使用方便； 对设备和人员要求不高； 可随时使用，便于观察菌种； 工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高； 菌种传代频繁，易退化、污染。
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菌株代数
美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次 即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。 United States Pharmacopoeia (USP) provides that: "to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation," and provides that "strains of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) must not exceed 5 generation. “
菌种保藏技术进展
原位低温保藏技术
有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一 些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌 根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经
被应用在一些锈菌种的保藏过程中。
Teliospores : Puccinia spp。
Source: /~pi/enpp/p athology/images/dayl.
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真空干燥
在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随 后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻 结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。