小鼠染色体

二、实验目的
• 学习并掌握小鼠骨髓细胞染色 体的制备方法。 • 观察小鼠染色体的形态特征,统 计细胞的染色体数目。
三、实验材料
• 小白鼠（2n=40）
四、实验器具和药品
• 1. 器具：注射器（ 1ml ， 5ml 各一支）、 托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、 离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 • 2.药品： 0.15mg/ml 秋水仙素， 1% 柠檬酸三钠，固定液（3份甲醇，1份 冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液， 2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液 （PBS）pH6.8。
0.15mg/ml 秋水仙素：取秋水仙素15mg溶于100ml 0.85%生理盐水
中，混匀；
75%酒精：取375ml 95%乙醇，加入125ml馏蒸水；
六、实验步骤
• 1、处理：用1.5mg/kg秋水仙素腹腔 注射处理小鼠（注射量为0.1ml/10g 体重）。即用以上配制的秋水仙溶 液按每10g体重注射0.1ml。注射后324小时，可以取骨髓。
七、观察
低倍镜寻找中期分裂相，然后用高倍 镜和油镜观察染色体形态，统计染色 体数目。
可见小鼠的40条染色体呈紫红色。
小鼠骨髓细胞染色体图
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小鼠骨髓细胞的40条染色体
小鼠骨髓细胞染色体放大图 (10×100)
作业
•1.找到一个分裂相良好的区域，统计小鼠2n 染色体的数目，仔细观察其形态特征并绘骨 髓细胞中期染色体。 •2.低渗液起到什么作用，在使用过程中应注 意什么问题？ •3.你在实验中遇到哪些问题？如何分析和解 释？ •5.交一张制作好的染色体玻片标本。
一、实验原理
• 骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此 可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细 胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙 素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺 缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋 向两极而使之停留于中期，同时染色体缩 短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗， 固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细 胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体 散开，染色后即可观察到染色体。
六、实验步骤
5. 固定（第2次）：沿离心管壁慢慢加入新配制的固定 液6ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温下固定5min， 1000rpm/min 3min，弃去上清；如此反复固定两次 （共固定3次）。 6. 根据管底细胞量的多少，加入新配制 的固定液0.3~ 0.8ml，用吸管打均匀， 使其形成细胞悬液。
六、实验步骤
7. 滴片：将预冷的载玻片（0℃冰浴），水 平或倾斜45° 角放置，用吸管吸取细胞悬 液，从约0.5 -1m高处滴 1~2滴到片子上， 用口将其吹干，静置使其干燥。 8. 染色：将干燥的玻片放入2ml吉姆萨原液 加入40ml磷酸缓冲液（pH6.8）配成的染液 中染色20min，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲 洗，晾干后镜检。
2. 处死：断颈法处死小鼠。剪刀剪开 腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨， 剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股 骨取出，擦净股骨上的肌肉。去股骨 的髋面，将吸有2.2%柠檬酸三钠溶液 的小注射器 的针头插入，反复几 次吹出骨髓细胞，反 复吹打直至股骨呈白 色，制成细胞悬液。
六、实验步骤
3. 低渗：将细胞悬液在1000rpm/min离心5min，弃除上 清液，留0.5ml摇匀。向细胞液中再加入1%的柠檬酸三 钠溶液 5ml 用吸管轻吹打均匀，在室温低渗 30min。低 渗期间，配制固定液，即甲醇：冰醋酸为3:1（v/v)，置 4 ℃冰箱中备用。 4. 预固定：在低渗后的细胞悬液中直接加入0.5ml ( 10滴左 右)固定液进行预固定5min ；然后将细胞悬液1000rpm/ min 离心5分钟，留1ml原液，摇匀。加入新配制的固定液 至6ml， 吹打均匀，固定5分钟(第1次) ，再在 1000rpm/min离心3-5min，去掉上清液。
五、实验准备
购买小鼠（体重30克最佳；尽量雌雄各半） 溶液配制： 2.2%柠檬酸三钠：称11g柠檬酸三钠到500ml蒸馏水中，充分溶解； 1%柠檬酸三钠：取5g柠檬酸三钠溶解到500ml蒸馏水中，充分溶解； PBS（pH6.8): A液：取Na2HPO4 12g溶于500ml蒸水中，充分溶解； B液：取KH2PO4 4.55g溶于500ml蒸水中，充分溶解； 使用时A、B液等体积混合，即为pH6.8的PBS；