抗体的亲和力与亲合力
第七章体外抗原抗体反应概述
第二节 抗原抗体反应的特点
1.特异性 2.比例性 3.可逆性 4.阶段性
第七章体外抗原抗体反应概述
一、 特异性（specificity）
1、概念：一种抗原分子通常只能与其刺激机体后
产生的抗体结合，这种抗原与抗体结合 反应的专一性称为特异性。
特 异 性 示 意 图
第七章体外抗原抗体反应概述
2、决定因素： 由抗原决定簇和抗体分子超变区之间
2、原因：抗原抗体的结合是分子表面的非共价键 结合，因此形成的复合物不牢固。 3、抗原抗体反应动态平衡式如下：
第七章体外抗原抗体反应概述
4、决定抗原抗体解离的因素
（1）抗体与相应抗原的亲合力。 亲合力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。
（2）环境因素对复合物的影响。 PH过高或过低、增加离子强度均可破坏
静电引力，使抗原抗体结合力下降，促使其 解离。
注意：解离后的抗原或抗体仍然保持其原有生物活性
第七章体外抗原抗体反应概述
四、阶段性
两个阶段
特异性结合
可见反应阶段
数秒～数分钟， 肉眼不可见
数分～数小时 肉眼可见
第七章体外抗原抗体反应概述
第三节 抗原抗体反应影响因素
一、反应物自身因素 1.抗原：理化特性、Ag决定簇数量和种类。
后代(postzone）抗原过量时称为。
第七章体外抗原抗体反应概述
抗原抗体反应
第四节 抗原抗体反应类型
1.沉淀反应 2.凝集反应 3.补体参与的反应 4.中和反应 5.标记免疫反应
反应类型
实验技术
凝集反应 直接凝集试验
间接凝集试验
抗球蛋白试验
沉淀反应 液相沉淀试验
免疫电泳技术 补体参与 补体溶血试验 的反应
补体结合试验
结果判断 观察凝集现象 同上 同上 观察沉淀，检测浊度 观察扫描沉淀峰、沉淀弧 观察测定溶血现象
后代(postzone）抗原过量时称为。
四、阶段性
第一阶段：抗原与抗体发生特异 性结合阶段
特点：反应快 第二阶段：反应可见阶段
特点：反应时间较长
第三节 抗原抗体反应影响因素
一、反应物自身因素 *抗原：理化特性、Ag决定簇数量和种类。 *抗体： 1、来源（如：R型抗体 > H型抗体） 2、特异性与亲和力（如：单克隆抗体） 3、浓度
Avidity
• The overall strength of binding between an Ag with many determinants and multivalent Abs
Keq =
104
Affinity
106 Avidity
1010 Avidity
二、抗原抗体的结合力
不形成牢固的共价键，通过非共价键结合 这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力
抗体亲和力与亲合力的区别AffinityandAvidityofAntibodies.pdf
Affinity and Avidity of Antibodies
Antibody Affinity
antigen Affinity measures the strength of interaction between an epitope and an antibody’s binding site. It is defined by the same basic thermodynamic principles that govern any reversible biomolecular interaction:
o K A = affinity constant
o[Ab] = molar concentration of unoccupied binding sites on the antibody
o[Ag] = molar concentration of unoccupied binding sites on the antigen
o[Ab-Ag] = molar concentration of the antibody-antigen complex
In other words, K A describes how much antibody-antigen complex exists at the point when equilibrium is reached. The time taken for this to occur depends on rate of diffusion and is similar
抗体亲和力与亲合力的区别Affinity and Avidity of Antibodies
Affinity and Avidity of Antibodies
Antibody Affinity
Affinity measures the strength of interaction between an epitope and an antibody’s antigen binding site. It is defined by the same basic thermodynamic principles that govern any reversible biomolecular interaction:
o K A= affinity constant
o[Ab]= molar concentration of unoccupied binding sites on the antibody
o[Ag]= molar concentration of unoccupied binding sites on the antigen
o[Ab-Ag]= molar concentration of the antibody-antigen complex
In other words, K A describes how much antibody-antigen complex exists at the point when equilibrium is reached. The time taken for this to occur depends on rate of diffusion and is similar for every antibody. However, high-affinity antibodies will bind a greater amount of antigen in a shorter period of time than low-affinity antibodies. K A can therefore vary widely for antibodies from below 105mol-1to above 1012mol-1, and can be influenced by factors including pH, temperature and buffer composition.
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Affinity and Avidity of Antibodies
Antibody Affinity
antigen Affinity measures the strength of interaction between an epitope and an antibody’s binding site. It is defined by the same basic thermodynamic principles that govern any reversible biomolecular interaction:
o K A = affinity constant
o[Ab] = molar concentration of unoccupied binding sites on the antibody
o[Ag] = molar concentration of unoccupied binding sites on the antigen
o[Ab-Ag] = molar concentration of the antibody-antigen complex
In other words, K A describes how much antibody-antigen complex exists at the point when equilibrium is reached. The time taken for this to occur depends on rate of diffusion and is similar
抗原抗体反应及其应用
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电荷引力（静电引力） 范德华引力 氢键结合力 疏水作用力
6
1、抗原抗体结合力 --静电引力（electrostatic forces）
静电引力或库仑引力（Cou-lombic forces）是因抗原、抗体带有 相反电荷的氨基（—NH3+）与羧基基团（—COO-）间相互吸引的 能力，之间的引力，距离越近引力越大。
洗涤
Ab酶或 Ag酶
Ag－Ab酶 或
Ab－Ag酶
底物
显色 反应
26
（2）间接法（有两种抗体参与，一抗做反应桥梁）
1Ab
酶标板吸附抗原
Ag－1Ab
2Ab酶 洗涤
Ag－1Ab－2Ab酶
底物 显色反应
一抗 二抗
27
（3）夹心法（不同抗体将抗原夹在中间反应）
① 直接夹心法 Ag
酶标板吸附抗体 底物 显色反应
副流感病毒
23
2、放射免疫技术及其应用
用放射性同位素标记技术来检测抗原抗体反应的高灵敏度方法。 反应特点：灵敏，精确；不稳定 ；安全性差
标记Ag或Ab
标记物纯化
抗原抗体反应
现临床实验室 应用较少
测定其放射活性
抗原抗体复合物沉淀
广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、 小分子药物和肿瘤标志物的定量分析等
亲合力
神经生长因子低受体在肝细胞的 表达
神经生长因子受体( NGFR)由两个亚基组成即神经生长因子低亲合力受体-P75( low-affinity nerve growth factor receptor，P75)和神经生长因子高亲合力受体-酪氨酸激酶A( tyrosine kinase A，TrkA)。 Trim等认为，人与大鼠(hepatic stellate cells，HSCs膜特异性表达P75，P75能诱导HSCs调亡。国内尚无此 方面的报道。相关研究采用大鼠离体培养的活化HSCs和肝纤维化患者及大鼠的HSCs，观察P75的表达分布，旨在 探讨肝纤维化的发病机制，为神经生长因子(nerve hepatic stnellate cells，growth factor，NGF)用于肝 纤维化的临床治疗打下实验基础。
谢谢观看
1951年，Levi-Montalcini首次在小鼠肉瘤细胞中发现了对神经系统发育、分化及维持神经元特殊功能有重 要作用的NGF，以后的研究发现，NGF在机体组织器官中分布十分广泛，许多细胞株包括HSCs均有存在。研究表明， NGFR通过P75和TrkA发挥作用。TrkA是NGF的功能性受体，传递信号，促进神经细胞再生，而P75的功能尚不明晰。 1996年，国外学者报道，P75在完全没有TrkA的参与下，可独立诱导细胞凋亡。因此，研究P75在HSCs的表达分 布，有助于探究 P75的功能及作用机理。
抗体的亲和力与亲合力
Affinity and Avidity of Antibodies
Antibody Affinity
Affinity measures the strength of interaction between an epitope and an antibody’s antigen binding site. It is defined by the same basic thermodynamic principles that govern any reversible biomolecular interaction:
o K A= affinity constant
o[Ab]= molar concentration of unoccupied binding sites on the antibody
o[Ag]= molar concentration of unoccupied binding sites on the antigen
o[Ab-Ag]= molar concentration of the antibody-antigen complex
In other words, K A describes how much antibody-antigen complex exists at the point when equilibrium is reached. The time taken for this to occur depends on rate of diffusion and is similar for every antibody. However, high-affinity antibodies will bind a greater amount of antigen in a shorter period of time than low-affinity antibodies. K A can therefore vary widely for antibodies from below 105mol-1to above 1012mol-1, and can be influenced by factors including pH, temperature and buffer composition.
11.免疫学技术概论
第十一章免疫学技术概论
免疫学技术是指利用免疫反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术，以及建立这些技术的各种制备主意。
免疫学技术包括：
①免疫血清学技术：用于检测抗原或抗体的体外免疫反应技术，或称免疫检测技术
②细胞免疫技术：用于分析研究机体细胞免疫功能与状态的免疫学技术
③免疫制备技术：用于建立免疫检测主意的技术
第 1 节免疫血清学技术
抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合反应，因抗体主要来自血清，因此在体外举行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。
一、免疫血清学反应的基本原理
抗原与抗体的特异性结合，主要是基于抗原与抗体分子结构及立体构型的互补，以及由多种因素造成的两者在分子间引力参加下发生的可逆性免疫化学反应。
1.抗原抗体的结合力
①库仑引力/静电引力：是抗原与抗体带有相反电荷的氨基与羧基之间互相吸引的力。其大小与两个电荷间距离的平方呈反比。
②范德华引力：是原子与原子、分子与分子互相临近时分子极化作用产生的一种吸引力，引力大小与分子空间构象的互补性有关。
③氢键作用：是供氢体上的氢原子和受氢体原子间的引力。
④疏水作用：在水溶液中两个疏水基团互相接触，因为对水分子的排斥而趋向聚拢的力。疏水作使劲在抗原抗体结合力中作用最强。
2.抗原抗体的亲和力与亲合力
①亲和力(affinity)：指抗体的抗原结合位点与相应的抗原决定簇之间的结合强度，它是抗原抗体间固有的结合力。
亲和力可用平衡常数K表示：K＝K1/K2 （K1为结合常数，K2为解离常数）
②亲合力(avidity)：指一个抗体分子与囫囵抗原表位之间结合的强度，与抗体结
临床免疫学：免疫相关内容及习题整理
第二章
1．何谓抗原抗体反应？其原理是什么？
指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
（1）空间互补关系：
抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性；抗原表位与抗体超变区密切
接触；高度互补使抗原抗体之间有足够的结合力；亲水胶体转化为疏水胶体。
（2）相互作用力：
1）抗原抗体结合力:
①静电引力:是抗原抗体分子中带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力,两
个电荷距离越近,静电引力越大。
②范德华引力：抗原和抗体相互接近时,由于分子的极化作用而出现的引力。（最小）
③氢键结合力：供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。
④疏水作用力：两个疏水基团在水溶液中相互接触时,由于对水分子排斥而趋向聚集
的力。（最大）
2）抗原抗体的亲和力与亲合力：
①亲和力(affinity):抗体分子上一个抗原结合部位与对应的抗原表位之间的结合
强度，取决于两者空间构型互补的程度，是抗原抗体间固有的结合力。
②亲合力（avidity）：是指一个抗体分子与抗原分子表面数个相应抗原表位之间的
结合强度。
（3）水胶体转化为疏水胶体：
血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体；当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄；而且由于抗原
抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体；在电解
质作用下，各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。
2．抗原抗体的结合力有哪些？
（1）静电引力(eletrostatic forces):是抗原抗体分子中带有相反电荷的氨基和羧基基团之
间相互的引力,两个电荷距离越近,静电引力越大.
抗体结构与功能知识讲解
四、免疫球蛋白的水解片段
1.木瓜蛋白酶水解片段 裂解部位：铰链区二硫键连接的两条重链的近N端。 所得片段：①两个抗原结合片段(fragment antigen binding, Fab)
②一个结晶片段（fragment crystallizable, Fc) 2.胃蛋白酶水解片段 裂解部位：铰链区二硫键连接的两条重链的近C端。 所得片段： ①一个F（ab)2
抗原抗体结合的亲和力抗原抗体的亲和力ab1ag1ab1ag2吸引力大于排斥力ab1ab1亲和力与亲合力affinityavidityag单克隆抗体大多数抗原分子具有多个抗原决定簇刺激机体产生针对多种表位的不同抗体多克隆抗体polyclonalantibodypab
抗体一般是由抗原刺激B细胞分化成浆细胞后产生的。能与对应的抗 原结合。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应，因而常给抗 体以不同的名称，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素 等。。
1963年，Porter对IgG的化学结构提出了一个模式图， 后证实各类免疫球蛋白均具有与IgG相似的基本结构。
（一）重链和轻链
1.重链（heavy chain, H链） 含450～550个氨基酸残基，分 子量约为55或75kD。根据H链抗原性的差异可将其分为5类： 链、链、链、链和 链，由它们组成的Ig分别称为IgM、 IgG、 IgA、 IgD和IgE。 IgG有四个亚类IgG1～ IgG4； IgA由两个亚类IgA1 和IgA2；其他的未发现有亚类。
抗原抗体及其结合反应专家知识
掌握：抗原抗体结合力、抗原抗体结合反 应特点
熟悉：影响抗原抗体结合反应的因素
行业精制
1
第一节 抗原
一、抗原的特性
免疫原性、免疫反应性 特异性
二、用于免疫测定的抗原分类
天然、合成多肽、基因重组
行业精制
2
第二节 抗体
一、抗体的特性
特异性、多样性、免疫原性
二、用于免疫测定的抗体分类
抗原抗体行亲业精制 合力示意图
11
三、液相中抗原抗体的结合反应
抗原 ﹢ 抗体
(亲水胶体)
抗原抗体复合物 (疏水胶体)
电解质
可见反应
行业精制
12
四、固相表面抗原抗体的结合反应 1. 抗原抗体结合反应时间 2. 反应体积 3. 解离速度 4. 固相化抗原或抗体的构象
行业精制
13
第四节 抗原抗体结合反应的特点
行业精制
29
（二）酸碱度
抗原抗体反应中一般以pH6-8为宜， 有补体参与的反应最适pH为7.2-7.4 酸凝集：当pH为3左右时，接近细菌 Ag的等电点，可出现非特异性凝集。
行业精制
30
（三）温度
最适温度为37℃或室温18-25℃ 为宜。若温度高于56℃，可导致已 结合了的抗原抗体复合物解离，甚至 分子变性。
行业精制
31
抗原抗体反应类型
图解抗原抗体反应类型和原理
反应类型 中和反应
标记免疫反应
实验技术 病毒中和试验 毒素中和试验
结果判断 检测病毒感染性 检测外毒素毒性
荧光免疫技术 检测荧光现象
放射免疫技术 检测放射性强度
酶免疫技术 检测酶底物显色 发光免疫技术 检测发光强度 金免疫技术 检测金颗粒沉淀
3、应用： 由于抗原抗体反应具有高度特异性，
故可用已知的抗原（抗体）来检测相应未 知的抗体（或抗原）。
4、交叉反应（cross reactions）
概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结 构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。
B
抗原抗体交叉反应示意图
二、可逆性（reversibility)
1、静电引力 2、范德华引力
3、氢键
4、疏水作用力
一、静电引力 概念：抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和 羧基基团之间相互的引力。又称库伦引力。
静电引力的大小与两个相互作用基团间的距 离的平方成反比。
二、范德华引力
概念：抗原和抗体相互接近时，各自所携带的原子与 原子、分子与分子由于分子极化作用而出现的引力。
转化
NaCl
亲水胶体
疏水胶体
血清学反应条件下， 当抗原与抗体结合使表面 抗原抗体均带负电荷， 使极化的水分子在其 电荷减少，水化层变薄， 周围形成水化层，成 失去亲水性能，抗原抗体
图解抗原抗体反应类型和原理
静电引力，使抗原抗体结合力下降，促使其 解离。
注意：解离后的抗原或抗体仍然保持其原有生物活性
三、比例性（proportionality）
1、比例性是指抗原与抗体发生可见反应 遵循一定的量比关系。 2、以絮状沉淀实验为例，受抗原抗体比 例性的影响非常明显。
3、应用： 由于抗原抗体反应具有高度特异性，
故可用已知的抗原（抗体）来检测相应未 知的抗体（或抗原）。
4、交叉反应（cross reactions）
概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结 构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。
B
抗原抗体交叉反应示意图
二、可逆性（reversibility)
Avidity
• The overall strength of binding between an Ag with many determinants and multivalent Abs
Keq =
104
Affinity
106 Avidity
1010 Avidity
二、抗原抗体的结合力
不形成牢固的共价键，通过非共价键结合 这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力
转化
NaCl
亲水胶体
疏水胶体
血清学反应条件下， 当抗原与抗体结合使表面 抗原抗体均带负电荷， 使极化的水分子在其 电荷减少，水化层变薄， 周围形成水化层，成 失去亲水性能，抗原抗体
(完整版)图解抗原抗体反应类型和原理ppt.ppt
静电引力的大小与两个相互作用基团间的距
离的平方成反比。
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二、范德华引力
概念：抗原和抗体相互接近时，各自所携带的原子与 原子、分子与分子由于分子极化作用而出现的引力。
• 结合力的大小与两个相 互作用基团的极化程度的 乘积成正比、与它们之间 距离的7次方成反比。
• 作用大小取决于二者分 子空间构型的互补性
3
教学内容：
第一节 抗原抗体反应的原理 第二节 抗原抗体反应的特点 第三节 影响抗原抗体反应的因素 第四节 免疫学检测技术的类型
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4
第一节 抗原抗体反应的原理
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5
一、抗原抗体的亲和力和亲合力
* 亲和力（affinity）：是抗体分 子上一个抗原结合点与相应的抗原决 定簇之间的相适应而结合的强度，是 抗原与抗体间固有的结合力。
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7
抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其
亲和常数（K）：
K值越大⇨抗体的亲和力越高⇨与抗原结合越牢固
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8
亲合力（avidity）：是指一个抗体分子 与整个抗原表位之间结合的强度，与抗 体结合价直接相关。另外也与亲和力强 弱有关。
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Avidity
• The overall strength of binding between an Ag with many determinants and multivalent Abs
抗体的亲和力与亲合力
Affinity and Avidity of Antibodies
Antibody Affinity
Affinity measures the strength of interaction between an epitope and an antibody’s antigen binding site. It is defined by the same basic thermodynamic principles that govern any reversible biomolecular interaction:
o K A = affinity constant
o[Ab] = molar concentration of unoccupied binding sites on the antibody
o[Ag] = molar concentration of unoccupied binding sites on the antigen
o[Ab-Ag] = molar concentration of the antibody-antigen complex
In other words, K A describes how much antibody-antigen complex exists at the point when equilibrium is reached. The time taken for this to occur depends on rate of diffusion and is similar for every antibody. However, high-affinity antibodies will bind a greater amount of antigen in a shorter period of time than low-affinity antibodies. K A can therefore vary widely for antibodies from below 105 mol-1 to above 1012 mol-1, and can be influenced by factors including pH, temperature and buffer composition.
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Affinity and Avidity of Antibodies
Antibody Affinity
Affinity measures the strength of interaction between an epitope and an antibody’s antigen binding site. It is defined by the same basic thermodynamic principles that govern any reversible biomolecular interaction:
o K A= affinity constant
o[Ab]= molar concentration of unoccupied binding sites on the antibody
o[Ag]= molar concentration of unoccupied binding sites on the antigen
o[Ab-Ag]= molar concentration of the antibody-antigen complex
In other words, K A describes how much antibody-antigen complex exists at the point when equilibrium is reached. The time taken for this to occur depends on rate of diffusion and is similar for every antibody. However, high-affinity antibodies will bind a greater amount of antigen in a shorter period of time than low-affinity antibodies. K A can therefore vary widely for antibodies from below 105mol-1to above 1012mol-1, and can be influenced by factors including pH, temperature and buffer composition.
The affinity of monoclonal antibodies can be measured accurately because they are homogeneous and selective for a single epitope. Polyclonal antibodies are heterogeneous and will contain a mixture of antibodies of different affinities recognizing several epitopes – therefore only an average affinity can be determined.
Antibody Avidity
Avidity gives a measure of the overall strength of an antibody-antigen complex. It is dependent on three major parameters:
o Affinity of the antibody for the epitope (see above)
o Valency of both the antibody and antigen
o Structural arrangement of the parts that interact
All antibodies are multivalent e.g.IgGs are bivalent and and IgMs are decavalent. The greater an immunoglobulin’s valency (number of antigen binding sites), the greater the amount of antigen it can bind. Similarly, antigens can demonstrate multivalency because they can bind to more than one antibody. Multimeric interactions between an antibody and an antigen help their stabilization.
A favorable structural arrangement of antibody and antigen can also lead to a more stable antibody-antigen complex as illustrated in Figures 1 and 2.
Figure 1.An immobilized antigen (a high local concentration of available epitopes) provides more opportunity for the antibody-antigen complex to form than free antigen in solution over the same time period. Once the first antigen binding arm of an antibody attaches to an antigen on a solid support, the chances of a bivalent interaction are greatly improved. Many immunoassays like Western blotting and ELISA exploit this principle.
Figure 2.When an antigen is mixed with a polyclonal antibody, multivalent interactions may lead to large, stable (high avidity) structures being formed. This is because the antigen may be bound by several antibodies, each recognizing a different epitope. Polyclonal antibodies are therefore ideal for immunoprecipitation experiments.
Further Useful Reading
How we improve the affinity of our recombinant monoclonal antibodies generated using HuCAL technology through affinity maturation