杜仲愈伤组织继代培养条件的优化
杜仲细胞悬浮培养及主要次生代谢物积累的研究的开题报告
杜仲细胞悬浮培养及主要次生代谢物积累的研究的开题报告第一部分：研究背景杜仲是一种重要的中药材，其干皮和根皮富含多种生物活性物质，包括三萜皂苷、多酚、黄酮等次生代谢物。
这些次生代谢物不仅具有极高的药用价值，在食品、化妆品等领域也有广泛的应用。
然而，由于杜仲树的生长速度非常缓慢，其资源受到了很大的限制。
为了解决杜仲资源短缺的问题，以及提高杜仲药用价值，研究人员采用细胞培养技术，通过培养杜仲细胞来获得大量杜仲次生代谢物。
目前，已有一些研究表明，通过细胞培养技术可以促进杜仲次生代谢物的积累。
然而，对于杜仲细胞的悬浮培养以及次生代谢物的积累机制还存在一定的不清楚之处。
第二部分：研究内容本研究的主要内容为，通过杜仲细胞的悬浮培养，探究不同培养条件对杜仲细胞的生长和次生代谢物积累的影响，进而分析杜仲细胞次生代谢物积累的机理。
本研究将从以下几个方面进行探究：1. 杜仲细胞悬浮培养条件的优化。
本研究将通过优化培养基成分、培养温度、培养pH值等因素，探究对杜仲细胞的生长状况和次生代谢物积累的影响，进而确定最佳培养条件。
2. 杜仲细胞次生代谢物的定量分析。
本研究将通过高效液相色谱技术（HPLC）及紫外光谱分析技术，对杜仲细胞培养产生的主要次生代谢物进行定量分析，从而确定最佳次生代谢物积累条件。
3. 杜仲细胞次生代谢物的积累机制探究。
本研究将通过细胞内酶活性测定、代谢组学分析等手段，探究不同培养条件下杜仲细胞次生代谢物积累的机制和途径。
第三部分：研究意义本研究旨在通过杜仲细胞的悬浮培养，探究不同培养条件对杜仲细胞次生代谢物的积累机制，从而为杜仲资源的有效利用和开发提供科学依据。
同时，本研究还有望推动植物细胞培养技术的发展，为其他中药材的研究提供参考。
第四部分：研究方法1. 培养杜仲细胞悬浮培养，并通过细胞计数仪定期监测其生长情况。
2. 通过高效液相色谱技术（HPLC）及紫外光谱分析技术，对杜仲细胞次生代谢物进行定量分析。
实验愈伤组织的继代与分化培养
实验四、愈伤组织的继代与分化培养一、实验目的学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。
二、实验原理愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。
通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。
将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。
三、实验用品器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。
四、实验内容及操作方法注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。
1）超净工作台等准备工作：同前。
2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。
如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。
3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。
4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。
五、观察记载内容与实验报告1、观察记载内容每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。
每隔3天观察一次。
2、实验报告1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析A. 描述培养物的变化及其形态特征；B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。
再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。
说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。
愈伤组织的继代培养
实验
实验七七愈伤组织的继代培养
【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法
2、学习接种操作技术规范。
【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。
打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
打开风机吹风15分钟，
备用。
2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），
将其分割成直径约为0.5cm的小块。
3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀
4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养
室内25±2℃条件下暗培养。
【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。
思考题：1．为什么要进行继代培养？
2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？。
实验愈伤组织的继代与分化培养
实验四、愈伤组织的继代与分化培养一、实验目的学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。
二、实验原理愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。
通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。
将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。
三、实验用品器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。
四、实验内容及操作方法注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。
1）超净工作台等准备工作：同前。
2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。
如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。
3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。
4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。
五、观察记载内容与实验报告1、观察记载内容每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。
每隔3天观察一次。
2、实验报告1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析A. 描述培养物的变化及其形态特征；B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。
再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。
说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。
一、请教关于水稻愈伤组织的问题
组培常见英汉对照abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar （琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的) auxin（生长素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellular totipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosome doubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration （败育）dedifferentiation （脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid （二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate （除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植体）filter paper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）global embryo （球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone （激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）in vitro（体外）in vivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）male sterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristem culture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nod culture （茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture （花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplast fusion（原生质体融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不亲和）shoot tip（茎尖）sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（体细胞胚）somatic hybridization（体细胞杂交）somatic hybrid（体细胞杂种）stem（茎）stem tip culture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）sterile distilled water（蒸馏水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (继代) sucrose（蔗糖）terminal bud（顶芽）transfer （转移）virus eradication（脱毒）常用缩略语ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液）DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸）KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇）LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）一、请教关于水稻愈伤组织的问题:我的水稻愈伤组织经过转化后，基本上不分化，听说TDZ能帮助分化，请问是用TDZ完全代替KT，还是按一定比例加入？还有就是在分化过程中还需要再加入潮霉素和羧苄吗？我用的水稻品系是台北309，以前的分化培养基为MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/l KT+0.5mg/l 6BA+0.2mg/l NAA+300MG/L羧苄+50MG/L潮霉素。
愈伤组织的继代培养
实验
实验七七愈伤组织的继代培养
【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法
2、学习接种操作技术规范。
【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。
打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
打开风机吹风15分钟，
备用。
2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），
将其分割成直径约为0.5cm的小块。
3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀
4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养
室内25±2℃条件下暗培养。
【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。
思考题：1．为什么要进行继代培养？
2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？。
植物愈伤组织培养的关键技术
植物愈伤组织培养的关键技术在现代农业中，植物愈伤组织培养技术广泛应用于种植业和植物育种中。
该技术通过培养和再生植物愈伤组织，可以实现快速繁殖、基因转化和育种改良等目的。
以下是植物愈伤组织培养中的关键技术：1. 材料准备：选择适宜的植物组织（如茎尖、叶片等）作为外植体，确保其健康和无病虫害。
外植体的选择对成功培养愈伤组织至关重要。
2. 外植体的消毒：使用适当的消毒方法，如漂白剂或酒精处理，以杀灭外植体表面的微生物。
3. 媒体配制：选择适宜的基础培养基，并添加必要的植物生长调节剂（如激素）和营养物质，以提供愈伤组织生长和分化所需的条件。
4. 培养条件控制：为愈伤组织提供适宜的光照、温度和湿度条件，以促进其生长和分化。
光照和温度的合理控制对于植物愈伤组织的培养成功至关重要。
5. 组织诱导和增殖：通过添加适当的激素和营养物质，诱导外植体形成愈伤组织，并通过继代培养，实现愈伤组织的快速增殖。
6. 分化和再生：通过调整培养基的成分和激素的添加量，促进愈伤组织分化为根、茎和叶等不同的组织器官，并进一步培养和培育出整株植物。
7. 病害防治：在愈伤组织培养过程中，要注意病害的防治，如消毒外植体、灭菌培养器具等，以避免病原微生物的侵染。
8. 营养调控：根据不同植物的营养需求和生长阶段的需要，合理调节培养基中的营养物质的含量和比例，以促进愈伤组织的生长和发育。
植物愈伤组织培养技术的成功与否，往往取决于以上关键技术的合理应用和控制。
这些技术的正确操作和调控，能够为植物育种和种植业的发展提供有力支持。
以上是关于植物愈伤组织培养的关键技术的简要介绍。
希望对您有所帮助！。
水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立
水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立1：研究的目的和意义1.1：研究的目的1.1.1. 以水稻成熟胚为外植体，寻求一个科学的实验方法，探讨愈伤组织的产生规律。
1.1.2. 用相同的培养方式对不同类型的籼稻品种和粳稻品种成熟胚进行组织培养，比较不同类型的水稻品种成熟胚愈伤组织诱导率之间的差异。
1.1.3. 通过植株再生培养体系,寻求提高水稻成熟胚的再生频率的方法，建立水稻不同种间成熟胚高效的培养体系。
1.2：研究的意义1.2.1. 水稻种子是水稻组织培养研究中使用最早的外植体,与其它外植体相比,种子胚具有再生周期短,再生植株育性好,取材不受生长季节的限制,灭菌容易,外植体均匀,重复性好等优点,因而是一种理想的研究材料。
但种子胚也存在诱导率不高,品种差异明显等限制因素[1]。
为了不断优化该体系的各个环节,人们做了大量研究,有关的研究报道也较多。
杨跃生等[2]以籼稻栽培种成熟胚诱导形成的愈伤组织为材料,对影响植株再生的一些因素进行了研究。
发现与N6相比MS培养基中的无机大量成分严重抑制再生植株根系生长,但MS的无机微量成份对诱导植株再生的效果则较明显。
较高浓度的BA利于诱导更多的植株再生,而较低的BA 浓度则利于壮苗和植株根系的形成。
增加诱导培养基或分化培养基中的渗透压和琼脂浓度,维代培养时加入适量的激动素或6-节基氨基嚓吟以及在分化培养基中加入活性炭、玉米素和AgNO3等均可提高水稻愈伤组织的分化成苗率[3]。
另有研究则发现脱水处理能有效促进水稻愈伤组织的植株再生[4-6]。
目前用于作物转基因的外植体,主要有胚性悬浮细胞系,成熟胚愈伤组织,幼胚及其愈伤组织,花药愈伤组织,分生组织盘,萌发的胚!叶或根,茎尖分生组织等,其中成熟胚具有取材方便,不受季节的限制,在转基因研究中有着较为广阔的应用前景，但是到现在为止,适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立,特别是釉稻品种成熟胚的组织培养效果很差,因此,严重影响了籼稻基因工程的开展，为此,进行籼稻愈伤组织的高频率诱导,胚性愈伤组织的保持及高频率绿苗分化的研究,是一项极其重要的水稻细胞工程和基因工程研究的基础工作，因此,研究籼稻成熟胚的组织培养特性,建立杂交水稻亲本成熟胚再生体系具有极其重要的理论和现实意义。
杜仲愈伤组织继代培养及抑制褐化的研究
杜仲愈伤组织继代培养及抑制褐化的研究邱晓芳;朱笃;张志斌;涂艺声;游海;王曼莹【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2007(028)008【摘要】对杜仲愈伤组织的继代培养及其褐化现象的抑制进行了研究,结果表明:B5培养基+0.5mg/LNAA+1.0mg/L 6-BA是杜仲愈伤组织继代培养和褐化控制的适合培养基;培养基中添加0.5%活性炭(AC)能有效的抑制杜仲愈伤组织的褐化;与中强光和红光相比,蓝光和黑暗能减轻组织的褐化.【总页数】3页(P307-309)【作者】邱晓芳;朱笃;张志斌;涂艺声;游海;王曼莹【作者单位】江西师范大学生命科学学院,江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室,江西,南昌,330022;江西师范大学生命科学学院,江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室,江西,南昌,330022;江西师范大学生命科学学院,江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室,江西,南昌,330022;江西师范大学生命科学学院,江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室,江西,南昌,330022;江西师范大学生命科学学院,江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室,江西,南昌,330022;江西师范大学生命科学学院,江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室,江西,南昌,330022【正文语种】中文【中图分类】R932【相关文献】1.杜仲愈伤组织诱导与继代培养研究 [J], 罗丽;赵德刚2.珙桐愈伤组织诱导和继代培养中的褐化研究 [J], 余阿梅;苏智先;胡进耀;邹利娟;王箫3.曼地亚红豆杉愈伤组织诱导和继代培养中抑制褐化的研究 [J], 胡凯;祝顺琴;谈锋;唐克轩4.苦豆子愈伤组织的诱导与继代培养的去褐化研究 [J], 王立强;杨军;王光碧;邓锷5.3种豆科牧草愈伤组织继代培养抗褐化的研究 [J], 陈爱萍;冯维卫;刘允康因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
杜仲组织培养的研究
杜仲组织培养的研究摘要:为了筛选出杜仲(Eucommia ulmoides)组织培养的最优培养条件,主要从外植体的选择､基本培养基､植物激素､光照条件､其他理化条件等方面对杜仲愈伤组织的诱导､增殖及分化培养的影响进行了综述,分析了杜仲组织培养过程中常见的问题并提出了解决方案,以期为杜仲快繁体系的建立提供理论依据｡关键词:杜仲(Eucommia ulmoides);组织培养;诱导;增殖;再分化Research on Tissue Culture of Eucommia ulmoidesAbstract: In order to select the optimal culture condition of Eucommia ulmoides tissue culture, induction, proliferation and differentiation conditions for E. ulmoides callus were screened from the the aspects of choice of explants, basic medium, plant hormones, light conditions and other physical and chemical conditions. The solutions of the common problems during the procedure of E. ulmoides Olive tissue culture were analyzed. This article provided a theoretical basis on E. ulmoides rapid propagation system.Key words: Eucommia ulmoides; tissue culture; induction; multiplication; regeneration杜仲(Eucommia ulmoides)系杜仲科杜仲属(Eucommia)植物,为我国特有的经济树种,是一种名贵的药用植物,特别是对血压有双向调节作用,被认为是世界上高效天然降压药物[1]｡杜仲还是一种胶源植物,杜仲胶具有良好的绝缘性､抗酸碱性､热塑性和形状记忆等特点,受到世人的普遍重视[2]｡因此,杜仲作为用材､水土保持､绿化的经济树种,集“一林､一胶､两材､三效益”于一体,应用前景广阔[3]｡由于杜仲是雌雄异株植物,授粉较为困难,种子产量有限,加之自然环境的破坏和长期无计划的采挖,以及扦插繁殖的技术问题还未得到完全解决,使得杜仲的供应十分困难,生产中种苗的数量缺口很大｡组织培养是解决种苗快繁的有效方法之一[4]｡杜仲是组织培养较为困难的一种木本植物｡目前对杜仲愈伤组织的诱导､增殖方面的研究已有一些报道[5]｡本研究在前人工作的基础上,综述了在不同时间采集,以杜仲幼叶､嫩茎及种子无菌苗的下胚轴､子叶､真叶､根为外植体愈伤组织的诱导､增殖､分化及生根的培养基､激素､光照等理化条件,目的在于找出杜仲的愈伤组织诱导､增殖继代､分化及生根的最优培养条件[6],以期为大规模培养生产杜仲及次生代谢产物奠定基础｡1 外植体的选择高等植物几乎所有的器官和组织都可以作为外植体,在合适的时间,选择适宜的苗龄､合适部位的外植体是有效诱导愈伤组织的关键[6]｡同类型的外植体对于诱导产生愈伤组织的难易程度不同,主要是不同的外植体其内源激素是有差别的[7]｡杜仲组织培养多采用植株的幼叶､嫩茎及种子无菌苗的下胚轴､子叶､真叶､根为外植体｡其中,使用频率最高的为茎尖[8]｡1.1 外植体的种类据罗丽等[7]的报道,杜仲各种外植体的诱导出愈能力比为下胚轴>子叶>幼叶,只要培养基中激素配比适宜,杜仲各类外植体均能诱导产生愈伤组织｡另据李琰等[9]报道,以杜仲无菌苗作为外植体不仅出愈率高,愈伤组织生长旺盛,且不受季节影响,其中以下胚轴作外植体时,诱导率和生长状况最佳;以幼叶作为外植体时,污染小,便于消毒,出愈率也高;而对于茎,虽然诱导率高,但诱导出的愈伤组织不利于继代,且污染率高,诱导率有下降趋势｡此外,邱晓芳等[10]用杜仲无菌苗不同组织作为外植体,得出与上胚轴相比子叶更不易产生褐化,较容易进行稳定的继代;子叶和上胚轴均有利于诱导出疏松的愈伤组织,而上胚轴所诱导的愈伤组织质地非常疏松似乎更有利于作细胞悬浮培养｡可见,以胚轴作为外植体不仅诱导率高且不易褐化,愈伤组织生长茂盛稳定,是最优选择｡1.2 外植体大小､接种方式及采样时期在杜仲组织培养过程中,不同接种方式的出愈率明显不同｡李琰等[9]的研究表明,对不同外植体:将真叶､子叶切成0.5 cm×0.5 cm方块,下胚轴和根切成0.7 cm长的段进行接种;将幼茎切成0.7 cm长段,幼叶切成0.5 cm×0.5 cm的方块接种方式为佳｡其中以幼茎为外植体,茎段的大小和接种方式以0.7 cm长度横放方式诱导效果最好｡外植体的采用时期:田间材料幼叶取样时间以3月中旬为好,幼茎的取材时间以4月中旬前为最佳｡2 培养基的选择培养基是植物组织培养的物质基础,也是愈伤组织能否成功的重要因素之一,愈伤组织能否形成,一方面取决于培养基材料本身的性质,另一方面也取决于培养基的种类和成分,因此要根据不同的外植体以及不同的培养目的选择合适的培养基[6]｡杜仲组织培养常用的培养基有MS､B5､LS､White､1/2MS､N6等,其中以MS使用最多,初代培养中占83.3%,继代培养也有66.7%,而66.7%的生根培养基采用的是1/2MS[8]｡2.1 诱导培养基研究表明,B5培养基更有利于松散愈伤组织的形成,更适合作继代或悬浮培养;而MS培养基对子叶及上胚轴愈伤组织的诱导率均为最强,且不易于褐化;相比之下1/2MS培养基诱导的愈伤组织结构致密､生长缓慢､褐化严重,不利于诱导出疏松的愈伤组织[10]｡2.2 增殖培养基关于继代培养的研究,何泼等[11]在MS､B5､LS､White､1/2MS､N6培养基上进行继代培养,结果表明,MS培养基虽然在诱导时效果很好,但它不适于愈伤组织的继代培养,愈伤在接种到该培养基上后生长缓慢,增长率较低,有的接种后不久会褐化死亡;而B5培养基最适合于愈伤组织的继代培养,继代后愈伤组织生长旺盛,增长率最高;此外N6培养基的效果也较好｡但据黄勇等[12]报道,MS培养基更适合于杜仲愈伤组织的继代培养,这可能是由于培养基上所加生长调节物质有所不同,或者与外植体种类也有一定的关系｡另有李琰等[1]以MS､LS､B5､N6､H､Nitsch､White､WPM为基本培养基,进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织诱导的研究;以MS､LS､B5､N6､H､Nitsch､White､1/2MS为基本培养基,进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织继代培养的研究｡结果表明,MS培养基有利于杜仲幼茎愈伤组织的诱导,而B5培养基不仅对叶的愈伤组织诱导有利,对茎和叶愈伤组织的继代培养也是最理想的｡3 激素的选择3.1 愈伤组织的诱导和增殖试验表明,没有添加植物激素的培养基上,杜仲愈伤组织继代生长很差,单独使用NAA的生长速度不如NAA与BA配合使用｡BA的最优使用量范围为1.0~3.0 mg/L,NAA的最优使用量范围为0.5~4.0 mg/L｡比较可见,在以MS培养基(0.8%琼脂+3%蔗糖)上附加2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于杜仲愈伤组织的诱导;以B5培养基(0.8%琼脂+3%蔗糖)上附加1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA,有利于愈伤组织的增殖[11]｡据黄勇等[12]的报道,以杜仲幼茎为外植体,接种于附加NAA､2,4-D､KT､6-BA及其组合的MS培养基上,均能产生愈伤组织,但附加2,4-D的培养基上愈伤组织容易褐化,其他均可正常生长,附加0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L KT的培养基适合愈伤组织的增殖培养｡3.2 芽的诱导和增殖芽的诱导形成使用的激素有BA､NAA､IBA､BAP､IAA､KT等,BA和NAA 2种激素在从愈伤上诱导芽时通常需要混合使用,BA的最优使用量范围为0.50~2.25 mg/L,NAA的最优使用量范围为0.05~0.50 mg/L[8]｡根据李岩等[5]的报道,在含有0.1 mg/L NAA+ 0.8 mg/L 6-BA的MS培养基中,杜仲胚轴可直接诱导产生不定芽,诱导率达到47%,为较优培养方案｡李琰等[2]以MS为基本培养基,在添加0.05 mg/L NAA+0.5 mg/L BA或者0.1 mg/L IBA+0.5 mg/L BA的培养基中,腋芽的诱导和生长较好;继代增殖培养以0.5 mg/L BA+0.01 mg/L NAA的MS培养基丛芽数量最多,增殖系数最高｡可见,不同浓度的BA和NAA混合使用对芽的诱导与增殖有显著促进作用｡3.3 根的诱导杜仲生根培养所需激素有NAA､IBA､GA等3种激素,以IBA的效果最好,其适合浓度为1.5~2.0 mg/L[8]｡据报道,只用White培养基,不添加激素也可以生根[8]｡李岩等[5]研究表明,在生根培养中,附加1.5 mg/L IBA+20 g/L蔗糖的1/2MS培养基效果最好,生根率达到91.7%｡另有王东良等[4]报道,以1/3MS附加0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA也有生根现象,生根率18%｡比较可知,采用1/2MS培养基材料的生根率明显高于采用1/3MS培养基材料的生根率,且较低浓度的盐离子有利于根的分化｡4 光照条件光对愈伤组织的生长既有促进作用也有抑制作用,杜仲的愈伤组织培养中,光照条件以12 h光照12 h暗培养最好｡黑暗中和12 h光照条件下愈伤组织的增长量相似,但颜色差异较大｡在生理生化特征和分化能力上这些形态不同的愈伤组织也有很大的差异,其在次生代谢产物的含量方面是否有差异尚需进一步研究[13]｡何泼等[11]分别采取黑暗24 h/d､光照12 h/d､自然光3种不同光照方法进行光照对愈伤组织增长影响的试验,结果表明,3种不同光照方式下愈伤组织的增长率并无太大差异,但光照12 h/d条件下培养的愈伤组织更易做进一步的继代培养,而连续黑暗培养24 h/d时的增长率略低｡另外光照对杜仲愈伤中次生代谢物的积累有明显影响,杨振堂等[14]报道,光照有利于愈伤中杜仲胶的积累,与自然光下相比,杜仲胶的总生产率较高｡另据李琰等[15]的报道,黑暗不影响愈伤组织的生长,但却抑制绿原酸和总黄酮的形成,光照12 h/d对愈伤组织的生长及绿原酸和总黄酮的合成有明显的促进作用｡5 其他理化条件5.1 培养基pH对愈伤组织继代培养的影响培养基的pH可通过影响培养物对营养元素的吸收､呼吸代谢､DNA合成､植物激素进出细胞等直接或间接地影响愈伤组织形成｡培养基的pH因培养材料的来源不同,大多数植物都要求在pH 5.6~5.8的条件下进行培养,但不同的植物其最适pH也不一样｡在杜仲愈伤组织诱导中发现,pH 4.8~6.8的诱导率差异不大,均在90%以上,但对愈伤组织的长势影响差异较大,只有pH 6.3时愈伤组织长势最好,20 d的增长率可达100%,过高或过低都起抑制作用[9]｡5.2 碳源对杜仲愈伤组织继代培养的影响培养基中糖不仅起到碳源的作用,而且还有调节渗透的作用,因而对愈伤组织的生长和次生代谢产物的含量有明显影响｡据李琰等[13]报道,以市售食用白糖､分析纯的蔗糖､葡萄糖作为碳源,3种糖中以分析纯的蔗糖最好,葡萄糖最差｡白糖和蔗糖虽然主要成分都是蔗糖,但纯度不同,白糖效果不如蔗糖,可能是因为白糖中微量杂质如重金属､氯化物等对细胞生长和次生代谢产物的形成都有一定的抑制作用｡高浓度的蔗糖能提高培养基中次生代谢产物的含量,其原因之一是提高了培养基的渗透压｡在10~40 g/L蔗糖浓度范围内,愈伤组织的增长量和次生物质的积累随蔗糖浓度的升高而增加,在40 g/L时愈伤组织增长量和黄酮含量达到最大值;蔗糖浓度50 g/L时,愈伤组织的生长受到抑制,黄酮含量和产量也下降,但绿原酸的含量和产量仍在提高[15]｡6 杜仲组织培养及植株再生存在的问题6.1 初代的污染杜仲组织培养在使用茎尖和带芽茎段进行初代培养时污染率很高｡据罗丽等[16]报道,以4､5月份取材萌发率高,污染小｡外植体最佳表面消毒方法为:3%H2O2浸泡20 min后,0.1% HgCl2 +数滴Tween80浸泡10 min｡培养基附加链霉素8万单位/L+山梨酸钾50 mg/L抑制微生物生长｡在培养10~15 d受到污染时可浸泡于8万单位/L链霉素10min或0.1% HgCl2 5 min除菌｡前10 d没有出现污染,10~15 d 时微生物污染发生率在20%以下｡6.2 诱导芽困难目前获得成功的杜仲组织培养,大多以器官直接发生途径获得无菌芽,这虽然在一定程度上提高了组织培养效率,但增殖率仍然很低,一般为3~5个,无法达到产业化生产的标准｡在杜仲组织培养中相比较根的诱导,芽的诱导相对较低,如何克服这一关键问题,是目前杜仲组织培养应用于生产上亟待解决的问题之一[8]｡6.3 继代培养中的褐化现象在植物细胞培养特别是木本植物细胞培养中,愈伤组织在继代培养中容易产生褐化,导致难以获得生长旺盛､目的次生代谢产物含量高的细胞株于杜仲本身的生物学特性,导致杜仲组织培养过程中极易发生褐变现象,轻者影响细胞生长和繁殖,重者导致细胞死亡｡据邱晓芳等[17]的研究报道,以B5培养基0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA是杜仲愈伤组织继代培养和褐化控制的适合培养基;另外,培养基中添加0.5%活性炭(AC)能有效地抑制杜仲愈伤组织的褐化;在光照条件方面,与中强光和红光相比,蓝光和黑暗能减轻组织的褐化｡参考文献:[1] 李琰,姜在民,唐锐. 杜仲叶片愈伤组织诱导的激素优化研究[J]. 植物研究,2006,26(2):182-186.[2] 李琰,张靖,辛转霞,等. 杜仲组培快繁的研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版),2004,32(6):79-82.[3] 李俊红,张焕玲,李周岐. 杜仲组织培养再生体系的优化[J]. 西北林学院学报,2008,23(4):97-100.[4] 王东良,丁兰,魏昊进. 杜仲组织离体培养研究[J]. 西北师范大学学报(自然科学版),2004,40(1):64-66.[5] 李岩,罗丽,赵德刚. 杜仲胚轴､子叶直接诱导不定芽及再生体系的建立[J]. 中草药,2007,38(1):101-105.[6] 王慧英. 影响植物愈伤组织形成的因素研究[J]. 聊城大学学报(自然科学版),2010,23(2):51-53.[7] 罗丽,赵德刚. 杜仲愈伤组织诱导与继代培养研究[J]. 安徽农业科学,2009,37(7):2861-2863,3019.[8] 唐亮,金晓玲. 杜仲组织培养的研究进展[J]. 贵州农业科学,2010,38(3):15-18.[9] 李琰,张朝红,崔宏安,等. 杜仲愈伤组织诱导的研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版),2003,31(5):153-156.[10] 邱晓芳,朱笃,张志斌,等. 杜仲疏松愈伤组织诱导条件的优化筛选[J]. 食品科学,2006,27(11):375-377.[11] 何泼,申延,秦俊哲, 等. 杜仲愈伤组织诱导与增殖的研究[J]. 陕西科技大学学报(自然科学版),2006,24(2):21-25.[12] 黄勇,周吉源. 杜仲愈伤组织的诱导及增殖效应[J]. 华中师范大学学报(自然科学版),2003,37(1):102-105.[13] 李琰,王冬梅,崔宏安,等. 不同因子对杜仲愈伤组织继代培养的研究[J]. 西北林学院学报,2004,19(1):61-63.[14] 杨振堂,臧埔,马淑琴,等. 杜仲组织培养中培养条件与含胶量关系的研究[J]. 特产研究,1999,2(2):6-9.[15] 李琰,王冬梅,姜在民,等. 培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响[J]. 西北植物学报,2004,24(10):1912-1916.[16] 罗丽,赵德刚. 杜仲带芽茎段快速繁殖中的污染及控制[J]. 连云港师范高等专科学校学报,2007,2(2):78-80.[17] 邱晓芳,朱笃,张志斌,等. 杜仲愈伤组织继代培养及抑制褐化的研究[J].食品科学,2007,28(8):307-309.。
转基因杜仲再生体系的优化
转基因杜仲再生体系的优化王玲;董旋;谭艾娟;赵德刚;赵懿琛【摘要】为了提高杜仲不定芽的获得率及生根率,选用B5、MS和WPM 3种培养基,以杜仲下胚轴为外植体,利用农杆菌介导pGM 626-Act1-EuDIR3和pSH 737-35S-EuDIR1遗传转化杜仲,并将浸染后的各外植体分别接种于3种不同培养基上,观察记录各培养基上外植体的生长情况,通过GUS染色检测和PCR验证统计得到阳性芽数.结果表明:转化质粒在B5、MS和WPM培养基上的平均出芽率分别为(14.79±6.20)％、(7.68±2.37)％和(4.05±0.64)％,相较于MS和WPM培养基,B5培养基上的愈伤组织生长旺盛,色泽鲜艳呈绿色,质地紧密脆嫩,平均出芽率显著高于另外2种培养基,但是WPM培养基的生根率显著高于另外2种培养基,WPM和B5培养基的生根率分别为53.85％和3.57％,在MS培养基上的阳性芽并未生根.因此,在杜仲遗传转化过程中,B5培养基更适合诱导不定芽,WPM培养基利于不定芽生根.本研究优化了转基因杜仲再生体系,为杜仲基因功能研究提供技术支持.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2019(038)005【总页数】6页(P18-22,27)【关键词】转基因;杜仲;再生体系;培养基【作者】王玲;董旋;谭艾娟;赵德刚;赵懿琛【作者单位】贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院 ,贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室 , 贵阳550025;贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院 ,贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室 , 贵阳 550025;贵州省山地生态与农业生物工程 2011 协同创新中心 , 贵阳 550025;贵州大学生命科学学院 , 贵阳 550025;贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院 ,贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室 , 贵阳 550025;贵州省农业科学院 , 贵阳 550006;贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院 ,贵州省农业生物工程重点实验室/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室 , 贵阳 550025;贵州省山地生态与农业生物工程 2011 协同创新中心 , 贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】S567.19图1 pGM 626-Act1-EuDIR3(A)和pSH 737-35S-EuDIR1(B)载体的T-DNA区域示意图杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)，杜仲科杜仲属，为第三纪孑遗物种，其干燥的叶和树皮皆可入药，是我国特有的传统中药材[1-2]。
玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究
玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究玉米是一种重要的粮食作物，其幼胚是植物再生研究中常用的实验材料之一。
玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究是植物学和生物技术领域的热门课题，对于深入了解植物细胞再生机制以及植物遗传转化具有重要意义。
本文将就玉米幼胚胚性愈伤组织诱导和继代研究进行综述。
一、玉米幼胚胚性愈伤组织的特点玉米幼胚是种子在发育早期的胚胎期的植物胚胎，其细胞分裂活跃、生长迅速，具有较高的再生能力。
在玉米幼胚中，随着细胞分裂和分化的进行，愈伤组织逐渐形成。
愈伤组织是一种具有再生潜能的组织，其细胞具有较强的分裂和分化能力，在适当的条件下能够通过植物再生组织培养技术进行诱导和培养，形成成熟的植物器官。
玉米幼胚胚性愈伤组织的形成和培养为玉米的遗传改良、育种和种质资源保存提供了重要的工具和途径。
二、玉米幼胚胚性愈伤组织的诱导方法1. 外源激素诱导法外源激素诱导是一种常用的玉米幼胚胚性愈伤组织诱导方法。
通过外源生长调节物质的添加，可诱导玉米幼胚中的细胞分裂和再生过程。
常用的外源激素包括激素类（如激动素、生长素、赤霉素等）和抗生素类（如半胱氨酸、链霉素等）。
外源激素的种类和浓度对于玉米幼胚胚性愈伤组织的诱导效果具有重要影响，需要经过一定的试验和优化。
2. 生物诱导法生物诱导法是利用微生物的代谢产物或菌株对玉米幼胚进行诱导，促进愈伤组织的形成。
常用的生物诱导剂包括农杆菌、枯草芽孢杆菌等。
这些微生物通过其代谢产物或共培养，可以有效地刺激玉米幼胚中愈伤组织的形成和生长，提高愈伤组织的再生效率和质量。
三、玉米幼胚胚性愈伤组织的继代研究玉米幼胚胚性愈伤组织的继代研究是对愈伤组织再生能力和稳定性的研究。
通过对愈伤组织的连续培养和传代，可以评估其在不同发育阶段的再生能力和质量变化，为愈伤组织培养条件和再生机制的深入了解提供重要数据支持。
1. 继代培养条件的优化继代培养条件的优化是保证愈伤组织再生能力和稳定性的关键。
培养基成分、激素浓度、光照条件等因素对愈伤组织的继代效果有重要影响，需要通过实验设计和数据分析，进行优化和调整。
杜仲组织培养的研究进展
杜仲组织培养的研究进展唐亮;金晓玲【摘要】为了解杜仲组织培养的研究现状,对杜仲组织培养的研究进行了综述.杜仲是通过器官发生途径获得再生植株的,所用的外植体有叶片、叶柄、腋芽、胚轴、带芽茎段、茎尖和子叶等7种,除子叶外都成功组培获得了小植株.基本培养基、激素和附加营养成分等是影响组织培养的重要因素,其中,基本培养基以MS使用最多,初代培养中占83.3%,继代培养也有66.7%,而66.7%的生根培养基采用的是1/2 MS;芽的诱导中使用的激素有BA、NAA、IBA、BAP、IAA、KT、TDZ等7种,其中MS+0.1 mg/L 6-BA效果最好,诱导率达到96.7%;BA、NAA、IAA、BAP、GA3等5种激素对芽的增殖起作用,其中以MS+2.0 mg/L BA+0.05 mg/L NAA 效果最好,增殖系数达3.69;而生根所需激素主要有NAA、IBA、GA,其中以IBA 1.5 mg/L或2.0 mg/L效果最好,生根率达到92.5%;杜仲组织培养中常用的附加营养成分有酵母浸提物和谷氨酰胺等.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2010(038)003【总页数】4页(P15-18)【关键词】杜仲;组织培养;器官发生;植株再生【作者】唐亮;金晓玲【作者单位】中南林业科技大学,环境艺术设计学院,湖南,长沙,410004;中南林业科技大学,环境艺术设计学院,湖南,长沙,410004【正文语种】中文【中图分类】S567.23+9杜仲是我国名贵的中药资源，为国家二级保护植物。
杜仲为杜仲科(Eucom-miaceae)杜仲属(Eucommia ulmoides Oliv.)，为上新世遗留下来的单科单属单种的活化石植物[1]。
杜仲为落叶乔木[2]，雌雄异株，其皮是我国传统的名贵中药，杜仲的花、果实和叶片等都具有很高的药用价值[3]。
杜仲的野生资源相当匮乏，被列为国家二级保护植物[4]。
目前杜仲生产上以种子繁殖为主[5]。
培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响X
西北植物学报2004,24(10):1912—1916A ctaB ot.B orea l.-O cciden t.S in.文章编号:100024025(2004)1021912205培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响Ξ李 琰3,王冬梅,姜在民,唐 锐(西北农林科技大学,陕西杨陵 712100)摘 要:以M S、L S、B5、N6、H、N itsch、W h ite、1 2M S为基本培养基,分别添加0.5m g L NAA和0.5m g L BA,分析不同类型培养基对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响,并以B5培养基进行光照条件、碳源、蔗糖浓度试验。
结果表明:B5培养基不仅有利于愈伤组织生长,也有利于总黄酮的形成,而1 2M S培养基有利于绿原酸的积累;12h d光照对愈伤组织的生长及绿原酸和总黄酮的合成有明显的促进作用,黑暗不影响愈伤组织的生长,但却抑制绿原酸和总黄酮的形成;3种碳源中,愈伤组织的增长量、绿原酸和总黄酮的含量均以蔗糖为碳源时最高,葡萄糖最低;蔗糖浓度在10～50g L范围内绿原酸的含量随着糖浓度的升高而升高,40g L时愈伤组织的增长量和总黄酮的含量最高。
关键词:杜仲;组织培养;次生代谢产物中图分类号:Q946.8;S722.37 文献标识码:AEffects of ba sic m ed i a and culture cond ition s on growth of ca lluses and production of secondary m etabol ites of E uco mm ia u l m oidesL I Yan,W AN G Dong2m ei,J I AN G Zai2m in,TAN G R u i(N o rthw est Sci2T ech U niversity of A griculture and Fo restry.Yangling,Shaanxi712100,Ch ina)Abstract:T he M S,L S,B5,N6,H,N itsch,W h ite,1 2M S as basic m edia,supp lem en ted w ith0.5m g L NAA and0.5m g L BA w ere u sed to study their effects on callu s grow th and secondary m etabo lites p ro2 ducti on of E uco m m ia u l m oid es.L igh t,carbon sou rces and sucro se concen trati on w ere studied w ith B5as basic m edia.T he resu lts show ed that B5m edium w as best no t on ly fo r callu s grow th,bu t also fo r the accu2 m u lati on of flavono ids.1 2M S w as su itab le fo r the accum u lati on of ch lo rogen ic acid.12h d illum inati on increased the callu s grow th,ch lo rogen ic acid and flavono ids accum u lati on.D ark did no t influence callu s grow th,bu t no t beneficial fo r the ch lo rogen ic acid and flavono ids accum u lati on.Sucro se as carbon sou rce w as best fo r callu s grow th,ch lo rogen ic acid and flavono ids accum u lati on and gluco se w as least in the th ree carbon sou rces.In the range of10～50g L sucro se concen trati on,the ch lo rogen ic acid con ten ts increased along w ith concen trati on of sucro se.T he callu s increm en t and flavono ids con ten ts w as h ighest w hen the sucro se concen trati on w as40g L.Key words:E uco m m ia u l m oid es O liv.;tissue cu ltu re;secondary m etabo lites收稿日期:2003211221;修改稿收到日期:2004203217基金项目:国家“十五”攻关项目(2001BA502B0403);西北农林科技大学青年科研专项部分内容作者简介:李 琰(1971-),女(汉族),河南洛阳人,讲师,硕士,从事植物学及药用植物学的教学和研究。
杜仲愈伤组织培养过程中胶含量的动态变化
— — － 三
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杜 仲 愈 伤 组 织 培 养 过 程 中 胶 含 量 的 动 态 变 化
何 泼 任红媛 申 延
（ 陕西科技大学生命科学 与工程学院 ）
摘 要 ： 培养杜仲愈 伤组 织并测定其含胶量 ， 果发现 ， 结 杜仲 胶 的合成 与愈伤 组织 的生长 周期 有一 定的相 关性。 在 继代培 养 中， 着继代 次数 的增加 ， 随 含胶量呈增加趋势。外植体上愈伤组织一旦形 成就有杜仲 胶的积 累， 杜仲胶 含 量在 ｓ ～ 代 出现一个 高峰值 ，８ ５ ｓ 代愈伤组织 的含胶量 已经达到原植株的 ９ ，８ ｓ ４３ ％，９代后 又迅速 下降。
０５ｃ ０５ｃ ． ｍ× ． ｍ的方 片 接 种 于 Ｍ Ｓ培 养基 上 ， 且 附 并 加 Ｎ Ａ２０ｍ ／ ＋６ Ｂ ． ｍ ／ ， 行 愈 伤 组织 的 Ａ ． ｇＬ 一 Ａ０５ ｇＬ进 诱 导 。控 制培养 温 度 ２ ￣ 右 ， 照 时 间 １ ／ ， ５Ｃ左 光 ２ ｄ光 ｈ 照强 度 １ ０ ０～２ ０ 。诱 导 的愈伤组 织 选 择生 长 旺 ５ ０ｌ ０ ｘ 盛和颜 色 、 地及 形 态 都 相似 者 ， 成 均 匀 一 致 的小 质 切 块， 接种于 Ｂ 培养基 上并 附加 Ｎ Ａ１０ｎＪＬ ＋６ Ｒ ５ Ａ 。 ｅ 一Ａ １５ｍ ／ 进 行 继 代培 养 ， ２ 代 １ ， 计算 增 ． ｇＬ 每 ５ ｄ继 次 并
．
ｒ ｓ ｌ ｈ ｗ ｄ ｔ ａ ｔｅ Ｓ ａｒ ｌｔ ｅ ｃｏ ｅ ｒｌｔ ｎ ｈｐ ｅ ｉ ｉｇ ｂ ｔ ｅ ｎ ｔｅ ｓｎｈ ｓ ｆｇ ｔ — ｅ ｃ ａ ａ ｄ ｔｅ ｇｏ ｔ ｅ ｏ ｆ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｅ ｈ ｔ ｈ ｒ ＷＢ ｅａｉ ｌｓ ｅａｉ ｓ ｉ ｘｓ ｎ ｅｗ ｅ ｈ ｙ ｔｅ ｉ ｏ ｕｔ ｐ ｒｈ ｈ ｒｗ ｈ ｐ ｎ ｄ ｏ ｓ ｅ ｖ ｏ ｔ ｓ ａ ｎ ｃ ｌｌ ｓ Ｉ ａｌ ｓｓ ｂ ｕｔ ｅ ｈ ｕｔ ｏ ｔｎ ｎ ｒ ａ ｅ ｉ ｈ ｉ ｓｏ ａｌｓ ｓｂ ｕ ｔ ｅ Ｏ ｃ ａｌ ｓｗ ｓｆｒ ｄ ｈ ｎ ａ ａｈｓ ．ｎ ｃ ｕ ｕ ｌ ｕ ，ｔｅ ｇ ｔ ｃ ｎｅ ｔｉｃｅ ｓ ｄ ｗ ｔ ｔｅ ｔ ｅ ｌ ｃ ｒ ａ ｈ ｍｅ ｆｃ ｕ ｕ ｃ ｌ ｌ ｒ ｕ ｎ ｅ ｃ ｕ ａ ｏｍｅ ．ｔｅ ｇ ｕ — ｌ
农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系
Liu Minhao Xu Junlei Ye Jing Li Zhouqi Fan Ruishen Li Long
% College of Forestry, Northwest
University YangUng 712100)
Abstract: 【Objective) To optimize the ccllus regenextion system for Eucommia ulmoiVst leef explants, to assess the
养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长；愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS +0. 27 pnol-L-1
NAA + 4. 4 pmol-L-1 6-BA,诱导率为=3%±10.0%；不定芽复壮的最适培养基为 3/4MS + 0. 054 pmol-L-1 NAA + 4.4 pmo.LT 6-BA,平均伸长长度为%2.47±1.33) cm$抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基 中，抑菌剂头抱霉素的最适浓度为200 ms，1，筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg-,1 $转化因子的正交
第56卷第2期 2 02 0 年 2 月
doi：10. 11707/j.l001-74==. 20200209
林业科学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 56, No. 2 Feb.,20 20
农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系!
刘闵豪 徐郡儡 叶 靖李周岐 范睿深李 龙
%西北农林科技大学林学院杨凌712100)
摘 要：【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系，研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆
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收稿日期：２０１３－１０－２９基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１２ＢＡＤ２１Ｂ０５０２）作者简介：金晓玲（１９６３－），女，浙江东阳人，教授，博士生导师，主要从事园林植物繁育技术方面的研究和教学工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｘｌ０７１６＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ杜仲愈伤组织继代培养条件的优化金晓玲１，王 征１，伍江波１，刘雪梅１，杜红岩２（１．中南林业科技大学风景园林学院，湖南长沙４１０００４；２．国家林业局泡桐研究开发中心，河南郑州４５０００２）摘要：为了建立杜仲愈伤组织再生体系，为转基因研究提供平台，以成熟胚诱导的浅黄色愈伤组织和幼胚诱导的乳白色愈伤组织为材料，研究不同培养基、继代时间、继代次数对杜仲愈伤组织生长和不定芽诱导的影响。
结果表明：浅黄色愈伤组织继代培养后具有不定芽的分化能力，乳白色愈伤组织继代培养后褐化死亡；愈伤组织继代培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ，继代周期为１８ｄ；愈伤组织继代次数对愈伤组织增殖有显著影响，以继代４次的增殖倍数最高，达２．５；愈伤组织继代次数对不定芽的诱导有显著影响，以继代２次的愈伤组织不定芽诱导率最高，达到６６．７％，继代４次的愈伤组织不定芽的增殖系数最高，为３．２。
关键词：杜仲；愈伤组织；继代周期；增殖中图分类号：Ｓ５６７．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４－３２６８（２０１４）０５－０１３８－０４Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ ＣａｌｌｕｓＪＩＮ Ｘｉａｏ－ｌｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ１，ＷＵ Ｊｉａｎｇ－ｂｏ１，ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｍｅｉ １，ＤＵ Ｈｏｎｇ－ｙａｎ２（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｐａｕｌｏｗｎｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｔａｔｅ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ ｃａｌｌｕｓ，ｔｈｅ ｂｕｆｆ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｃｒｅａｍ ｗｈｉｔｅ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ，ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ，ａｎｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ ｂｕｆｆ ｃａｌｌｕｓ ｈａｄ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｃｒｅａｍ ｗｈｉｔｅ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｅｍｂｒｙｏｓｄｉｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０５ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｉｏｄ ｗａｓ １８ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄｂｙ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｓ，ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ２．５ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ｆｏｕｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｗａｓ ａｌｓｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｓ，ｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ６６．７％ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｗｏ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ３．２ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ；ｃａｌｌｕｓ；ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｉｏｄ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ 杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ Ｏｌｉｖｅｒ）为杜仲科杜仲属的第三纪孑遗植物［１］，为国家二级保护植物［２］。
近年来，随着杜仲药用价值和杜仲胶功能等研究的深入，在全国范围内掀起了杜仲研究的热潮［３－６］。
利用组织培养技术进行杜仲新品种的繁殖研究正在展开［７－９］。
另外，杜仲有效成分绿原酸的合成途径以及关键合成酶的发现，使利用转基因技术获得有效成分含量高的杜仲新品种成为可能［１０］。
然而，稳定的杜仲愈伤组织再生体系是成功进行杜仲转基因技术研究的基础和前提。
本研究对杜仲愈伤组织继代培养条件进行筛选，旨在为杜仲转基因分子研究提供技术平台。
河南农业科学，２０１４，４３（５）：１３８－１４１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１ 材料和方法１．１ 材料供试材料为以成熟胚为外植体诱导产生的浅黄色愈伤组织和以幼胚为外植体诱导的乳白色愈伤组织。
１．２ 方法１．２．１ 愈伤组织继代培养基的筛选 将２种愈伤组织切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的均匀小块，接种在分别含有不同质量浓度ＮＡＡ、６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＴＤＺ的ＭＳ培养基上。
培养３０ｄ后，统计愈伤组织增殖倍数、色泽和生长情况以及褐化情况。
褐化率（％）指供试外植体培养后出现褐化的个体与外植体总数的百分比，增殖倍数以体积比计算。
１．２．２ 愈伤组织继代时间的确定 取浅黄色愈伤组织，切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ均匀小块，接种于培养基（ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ）上继代培养。
每隔３ｄ测定愈伤组织的质量，持续２７ｄ，计算增长量（ｇ／ｄ）并做出相应的愈伤组织增长曲线。
增长量＝（Ｗｎ－Ｗｎ－１）／Ｔ，其中，Ｗｎ是第ｎ次取样时愈伤组织质量，Ｗｎ－１是第ｎ－１次取样时愈伤组织质量，Ｔ＝３。
根据愈伤组织增长曲线，确定愈伤组织的适宜继代周期。
１．２．３ 继代次数对愈伤组织增殖和不定芽诱导的影响 将浅黄色愈伤组织，以１８ｄ为１个继代周期，进行愈伤组织的继代培养。
培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ。
分别选取继代２、４、６、８次的愈伤组织进行增殖培养，继代３０ｄ后观察生长情况并计算愈伤组织增殖倍数和褐化率。
分别选取继代培养２、４、６、８次的愈伤组织接种在ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ培养基上，进行不定芽的诱导。
３０ｄ后观察生长情况并统计不定芽的诱导率和增殖系数。
不定芽增殖系数＝不定芽的总数／产生不定芽的愈伤组织个数。
以上试验的培养条件为：光照强度２ ５００ｌｘ，光照时间１５ｈ／ｄ，培养温度（２５±２）℃。
每瓶３个愈伤组织，共６瓶，重复３次。
２ 结果与分析２．１ 不同培养基对愈伤组织增殖和生长的影响浅黄色愈伤组织接种在１－１２号和１９－２４号培养基上，乳白色的愈伤组织接种在１３－１８号培养基上。
愈伤组织培养３０ｄ后的增殖和生长情况见表１。
表１ 不同培养基对２种杜仲愈伤组织增殖和生长的影响编号６－ＢＡ／（ｍｇ／Ｌ）ＮＡＡ／（ｍｇ／Ｌ）２，４－Ｄ／（ｍｇ／Ｌ）ＴＤＺ／（ｍｇ／Ｌ）生长情况增殖倍数褐化率／％１ ０．５ ０．０５嫩绿，长势一般２．０ ３３．３２ ０．５ ０．１０嫩绿，长势一般１．７ ２２．２３ ０．５ ０．５０嫩绿，长势一般１．５ ３３．３４ １．５ ０．０５嫩绿，长势较好２．５ ３３．３５ １．５ ０．１０嫩绿，长势较好２．２ ７７．８６ １．５ ０．５０嫩绿，长势一般２．０ ５５．６７ ３．０ ０．０５黄绿，长势一般２．０ ６６．７８ ３．０ ０．１０黄绿，长势较差１．６ ８８．９９ ３．０ ０．５０嫩绿，长势一般１．３ ５５．６１０ ０．５嫩绿，长势一般１．７ ３３．３１１ １．５黄绿，长势较差１．５ ５５．６１２ ３．０黄绿，长势较差１．３ ６６．７１３ ０．５ １．０ ０ １００１４ ０．５ ２．５ ０ １００１５ １．０ １．０ ０ １００１６ １．０ ２．５ ０ １００１７ ２．０ １．０ ０ １００１８ ２．０ ２．５ ０ １００１９ １．０ ０．５嫩绿，长势较好２．０ ３３．３２０ ２．５ ０．５黄绿，长势一般１．４ ３３．３２１ １．０ １．０黄绿，长势较好１．８ ６６．７２２ ２．５ １．０黄绿，长势一般１．５ ５５．６２３ １．０ ２．０深绿，长势较好２．２ ６６．７２４ ２．５ ２．０长势差，褐化死亡０ ８８．９９３１ 第５期金晓玲等：杜仲愈伤组织继代培养条件的优化 由表１可以看出，浅黄色愈伤组织在单独使用６－ＢＡ时，愈伤组织可增殖，但增殖倍数较低，长势较差；随着６－ＢＡ质量浓度升高，增殖倍数逐渐降低，褐化现象逐渐加重。
在６－ＢＡ和ＮＡＡ搭配使用时，愈伤组织增殖倍数明显提高；６－ＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ培养基中的愈伤组织增殖倍数最高，达到２．５，且生长较好，颜色嫩绿，质地较致密，有利于其进一步增殖和分化。
浅黄色愈伤组织在含ＴＤＺ和ＮＡＡ的培养基中生长状况不如含６－ＢＡ和ＮＡＡ的培养基。
乳白色愈伤组织在６－ＢＡ与２，４－Ｄ组合培养基中的生长状况不好，逐渐褐化死亡。
２．２ 继代周期对愈伤组织生长的影响由图１可以看出，杜仲愈伤组织的生长可分为３个时期：生长迟缓期（０～９ｄ）、对数生长期（９～２１ｄ）、生长稳定期（２１～２７ｄ）。
愈伤组织在生长１８ｄ左右出现１个拐点，表明这个拐点的时间为愈伤组织的最适继代周期。
图１ 培养时间对杜仲愈伤组织生长的影响２．３ 继代次数对愈伤组织增殖和不定芽诱导的影响２．３．１ 继代次数对愈伤组织增殖的影响 由表２可见，愈伤组织增殖倍数和褐化率与初始培养的愈伤组织继代次数有显著关系。
在愈伤组织继代次数较少时，愈伤组织增殖倍数随继代次数增加而增加，褐化率也逐渐降低，其中，以继代４次的愈伤组织为材料培养生长状况最好，增殖倍数达到２．５，褐化率表２ 继代次数对杜仲愈伤组织增殖的影响继代次数增殖倍数生长情况褐化率／％２ ２．２嫩绿，长势一般１１．１４ ２．５嫩绿，长势一般０６ ２．１黄绿，长势一般２２．２８ １．７黄绿，长势一般４４．４为０；随着继代次数继续增加，愈伤组织增殖倍数逐渐下降，褐化率逐渐提高，继代８次的愈伤组织增殖倍数仅为１．７，褐化率也上升到４４．４％。