杜仲愈伤组织继代培养条件的优化

收稿日期：２０１３－１０－

２９基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１２ＢＡＤ２１Ｂ０５０２

）作者简介：金晓玲（１９６３－）

，女，浙江东阳人，教授，博士生导师，主要从事园林植物繁育技术方面的研究和教学工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊ

ｘｌ０７１６＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ杜仲愈伤组织继代培养条件的优化

金晓玲１，王　征１，伍江波１，刘雪梅１，杜红岩２

（１．中南林业科技大学风景园林学院，湖南长沙４１０００４；２．国家林业局泡桐研究开发中心，河南郑州４５０００２

）摘要：为了建立杜仲愈伤组织再生体系，为转基因研究提供平台，以成熟胚诱导的浅黄色愈伤组织和幼胚诱导的乳白色愈伤组织为材料，

研究不同培养基、继代时间、继代次数对杜仲愈伤组织生长和不定芽诱导的影响。结果表明：浅黄色愈伤组织继代培养后具有不定芽的分化能力，乳白色愈伤组织继代培养后褐化死亡；愈伤组织继代培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ　１．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ，继代周期为１８ｄ；愈伤组织继代次数对愈伤组织增殖有显著影响，以继代４次的增殖倍数最高，达２．５；愈伤组织继代次数对不定芽的诱导有显著影响，以继代２次的愈伤组织不定芽诱导率最高，达到６６．７％，继代４次的愈伤组织不定芽的增殖系数最高，为３．２。关键词：杜仲；愈伤组织；继代周期；增殖

中图分类号：Ｓ５６７．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４－３２６８（２０１４）０５－０１３８－

０４Ｏｐ

ｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｅｕｃｏｍｍｉａ　ｕｌｍｏｉｄｅｓ　ＣａｌｌｕｓＪＩＮ　Ｘｉａｏ－ｌｉｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇ１，ＷＵ　Ｊｉａｎｇ－ｂｏ１，ＬＩＵ　Ｘｕｅ－ｍｅｉ　１，ＤＵ　Ｈｏｎｇ

－ｙａｎ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｐａｕｌｏｗｎｉａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｔａｔｅ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　

Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　４５０００２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｙ

ｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｅｕｃｏｍｍｉａ　ｕｌｍｏｉｄｅｓ　ｃａｌｌｕｓ，ｔｈｅ　ｂｕｆｆ　ｃａｌｌｕｓ　ｆｒｏｍ　ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓ　ａｎｄ　ｃｒｅａｍ　ｗｈｉｔｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｆｒｏｍ　ｙｏｕｎｇ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ，ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇ

ｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｃａｌｌｕｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ　ｂｕｆｆ　ｃａｌｌｕｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ　ｃｒｅａｍ　ｗｈｉｔｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｆｒｏｍ　ｙｏｕｎｇ　ｅｍｂｒｙｏｓｄｉｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｃａｌｌｕｓ　ｗａｓ　ＭＳ＋６－ＢＡ　１．５ｍｇ

／Ｌ＋ＮＡＡ０．０５ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｅｒｉｏｄ　ｗａｓ　１８ｄａｙｓ．Ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｌｕｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｆｆｅｃｔｅｄｂｙ　

ｔｈｅ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅｓ，ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｗｉｔｈ　２．５ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｆｏｕｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　

ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅｓ，ｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｂｕｄ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｗｉｔｈ　６６．７％ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｗｏ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｗｉｔｈ　３．２ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｆｏｕｒ　ｇ

ｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｏｍｍｉａ　ｕｌｍｏｉｄｅｓ；ｃａｌｌｕｓ；ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｅｒｉｏｄ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ 杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ　ｕｌｍｏｉｄｅｓ　

Ｏｌｉｖｅｒ）为杜仲科杜仲属的第三纪孑遗植物［１］，为国家二级保护植物［

２］

。近年来，随着杜仲药用价值和杜仲胶功能等研究的

深入，在全国范围内掀起了杜仲研究的热潮［

３－

６］。利用组织培养技术进行杜仲新品种的繁殖研究正在展

开［７－

９］。另外，杜仲有效成分绿原酸的合成途径以及

关键合成酶的发现，使利用转基因技术获得有效成

分含量高的杜仲新品种成为可能［１０］

。然而，稳定的

杜仲愈伤组织再生体系是成功进行杜仲转基因技术研究的基础和前提。本研究对杜仲愈伤组织继代培养条件进行筛选，旨在为杜仲转基因分子研究提供技术平台。

　河南农业科学，２０１４，４３（５）：１３８－

１４１　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ａｇ

ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ

１　材料和方法

１．１　材料

供试材料为以成熟胚为外植体诱导产生的浅黄色愈伤组织和以幼胚为外植体诱导的乳白色愈伤组织。１．２　方法

１．２．１　愈伤组织继代培养基的筛选　将２种愈伤组织切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的均匀小块，接种在分别含有不同质量浓度ＮＡＡ、６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＴＤＺ的ＭＳ培养基上。培养３０ｄ后，统计愈伤组织增殖倍数、色泽和生长情况以及褐化情况。褐化率（％）指供试外植体培养后出现褐化的个体与外植体总数的百分比，增殖倍数以体积比计算。

１．２．２　愈伤组织继代时间的确定　取浅黄色愈伤组织，切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ均匀小块，接种于培养基（ＭＳ＋６－ＢＡ　１．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ）上继代培养。每隔３ｄ测定愈伤组织的质量，持续２７ｄ，计算增长量（ｇ／ｄ）并做出相应的愈伤组织增长曲线。增长量＝（Ｗｎ－Ｗｎ－１）／Ｔ，其中，Ｗｎ是第ｎ次取样时愈伤组织质量，Ｗｎ－１是第ｎ－１次取样时愈伤组织质量，Ｔ＝３。根据愈伤组织增长曲线，

确定愈伤组织的适宜继代周期。

１．２．３　继代次数对愈伤组织增殖和不定芽诱导的影响　将浅黄色愈伤组织，以１８ｄ为１个继代周期，进行愈伤组织的继代培养。培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ　１．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ。分别选取继代２、４、６、８次的愈伤组织进行增殖培养，继代３０ｄ后观察生长情况并计算愈伤组织增殖倍数和褐化率。

分别选取继代培养２、４、６、８次的愈伤组织接种在ＭＳ＋６－ＢＡ　１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ培养基上，进行不定芽的诱导。３０ｄ后观察生长情况并统计不定芽的诱导率和增殖系数。不定芽增殖系数＝不定芽的总数

／产生不定芽的愈伤组织个数。以上试验的培养条件为：光照强度２　５００ｌｘ，光照时间１５ｈ／ｄ，培养温度（２５±２）℃。每瓶３个愈伤组织，共６瓶，重复３次。

２　结果与分析

２．１　不同培养基对愈伤组织增殖和生长的影响

浅黄色愈伤组织接种在１－１２号和１９－２４号培养基上，乳白色的愈伤组织接种在１３－１８号培养基上。愈伤组织培养３０ｄ后的增殖和生长情况见表１。

表１　不同培养基对２种杜仲愈伤组织增殖和生长的影响

编号６－ＢＡ／（ｍｇ

／Ｌ）ＮＡＡ／（ｍｇ

／Ｌ）２，４－Ｄ／（ｍｇ／Ｌ）ＴＤＺ／（ｍｇ

／Ｌ）生长情况增殖倍数褐化率／％１　０．５　０．０５嫩绿，长势一般２．０　３３．３２　０．５　０．１０嫩绿，长势一般１．７　２２．２３　０．５　０．５０嫩绿，长势一般１．５　３３．３４　１．５　０．０５嫩绿，长势较好２．５　３３．３５　１．５　０．１０嫩绿，长势较好２．２　７７．８６　１．５　０．５０嫩绿，长势一般２．０　５５．６７　３．０　０．０５黄绿，长势一般２．０　６６．７８　３．０　０．１０黄绿，长势较差１．６　８８．９９　３．０　０．５０

嫩绿，长势一般１．３　５５．６１０　０．５嫩绿，长势一般１．７　３３．３１１　１．５黄绿，长势较差１．５　５５．６１２　３．０黄绿，长势较差

１．３　６６．７１３　０．５　１．０　０　１００１４　０．５　２．５　０　１００１５　１．０　１．０　０　１００１６　１．０　２．５　０　１００１７　２．０　１．０　０　１００１８　２．０　

２．５　

０　１００１９　１．０　０．５嫩绿，长势较好２．０　３３．３２０　２．５　０．５黄绿，长势一般１．４　３３．３２１　１．０　１．０黄绿，长势较好１．８　６６．７２２　２．５　１．０黄绿，长势一般１．５　５５．６２３　１．０　２．０深绿，长势较好２．２　６６．７２４　

２．５　

２．０

长势差，褐化死亡

０　

８８．９

９

３１　第５期

金晓玲等：杜仲愈伤组织继代培养条件的优化