副溶血性弧菌的致病性及其快速检测

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MPN-PCR法快速定量检测海产品中致病性副溶血弧菌

MPN-PCR法快速定量检测海产品中致病性副溶血弧菌
栾晓燕;陈吉祥;李筠;杨慧;魏鉴腾;杨官品;张晓华
【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》
【年(卷),期】2006(026)011
【摘要】副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是在海洋环境及江湖河口广泛分布的一种条件性致病菌，是可引起人食物中毒的病原菌。

患者以沿海地区居多，是食品检验的必检项目，常规检验多不能定量检测，常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR等检测技术只对反应体系中模板DNA进行定量，无法鉴别污染食品中死活菌体。

【总页数】2页(P1060-1061)
【作者】栾晓燕;陈吉祥;李筠;杨慧;魏鉴腾;杨官品;张晓华
【作者单位】266003,青岛,中国海洋大学生命学院;266003,青岛,中国海洋大学生命学院;266003,青岛,中国海洋大学生命学院;266003,青岛,中国海洋大学生命学院;266003,青岛,中国海洋大学生命学院;266003,青岛,中国海洋大学生命学
院;266003,青岛,中国海洋大学生命学院
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞
2.荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞
中的应用3.环介导恒温扩增法快速检测海产品中的副溶血弧菌4.用直接分离法检测贝(甲)壳类海产品中的致病性气单胞菌5.直接分离法检测贝(甲)壳类海产品中致病性气单胞菌的探讨
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副溶血弧菌及其检测方法

副溶血弧菌及其检测方法副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见的致病性细菌，引起海鲜中毒性胃肠炎。

本文将介绍副溶血性弧菌的特征、传播途径以及常用的检测方法。

副溶血性弧菌是一种弯曲的革兰氏阴性杆菌，可以根据其群体特征划分为不同的生物型和血清型。

副溶血性弧菌通常在海洋中广泛分布，主要寄生在贝类和海鱼体内。

此外，也可以在淡水和土壤中找到。

副溶血性弧菌的生长要求较为特殊，一般需要30℃-37℃的温度，适中的盐度和适宜的pH值。

由于其生长条件特殊，因此一般来说，只有生长在过度空气饱和的环境中才能产生溶血素。

副溶血性弧菌主要通过食物传播引起感染。

其主要污染源包括生鲜海产品（如海鲜、贝类等）、淡水鱼和蔬菜等。

生鲜海产品中的副溶血性弧菌主要通过海洋或淡水环境中存在的细菌感染鱼和贝类，然后通过食物链进入人体，引起感染。

另外，不正确的存储和处理方式也会导致食品中副溶血性弧菌的繁殖和生长。

副溶血性弧菌感染的主要症状包括腹泻、呕吐、腹痛、发热等。

发病一般在感染后6-24小时内开始，并持续数天至一周。

对于免疫力较弱的人群，副溶血性弧菌感染可能会导致更严重的并发症，如敗血症和败血症性休克等。

为了及时发现和控制副溶血性弧菌的感染风险，现在广泛应用不同的检测方法。

常用的检测方法包括传统的培养方法、分子生物学方法和免疫学方法等。

传统的培养方法依靠将样品进行预处理后，直接在培养基上进行选择性的富集和挑选，以获取纯种菌株。

然后通过产气鉴定、生化鉴定和血清鉴定等方式，确定副溶血性弧菌的存在。

尽管这种方法在一些情况下比较可靠，但是需要较长的培养时间，并且会存在一定的假阴性和假阳性结果。

分子生物学方法包括PCR、实时荧光PCR、基因芯片等。

这些方法能够快速、灵敏地检测副溶血性弧菌的存在，并且可以对不同的血清类型和生物型进行鉴定。

此外，基因芯片技术还可以同时检测多种病原菌。

然而，这些方法在操作上较为繁琐，并且有一定的设备和技术门槛。

副溶血弧菌简介

预防控制措施
加强食品卫生管理
对海产品等副溶血弧菌易污染的食品进行严格检验，确保食品新鲜、无污染。
改善环境卫生
加强海水养殖区、沿海旅游景区的环境卫生管理，减少副溶血弧菌的传播途径。
个人防护
避免生食海产品，煮熟的食物是预防副溶血弧菌感染的最佳选择。同时，注意个人卫生，勤洗手，避免与感染者密切接触。
生物学特性
形态与染色
生理生化特性
副溶血弧菌呈杆状或弧状，革兰氏染色阴性。
副溶血弧菌具有趋化性，能够产生多种酶和毒素。
培养特性
副溶血弧菌需在特定培养基上进行培养，如TTC培养基。
分布与栖息环境
分布
副溶血弧菌广泛分布于海洋环境中，尤其是沿海地区。
栖息环境
副溶血弧菌主要栖息在海洋动物体内，如贝类、鱼类等。同时，在海洋植物表面、海底沉积物以及海水中也能检测到副溶血弧菌的存在。
疫苗与药物研究
针对副溶血弧菌的致病机制，开展了疫苗和药物的研究，取得了一定的成果。
未来研究方向预测
跨种属感染研究
副溶血弧菌不仅感染人类，还可感染其他动物，未来需要深入研究其跨种属感染的机制。
耐药性研究
随着抗生素的广泛使用，副溶血弧菌的耐药性逐渐增强，需要加强耐药性的研究，为临床治疗提供指导。
现代分子生物学技术应用
基因组学研究
通过对副溶血弧菌基因组的研究，发现了一些可用于检测的基因片段。
实时荧光定量PCR
利用荧光定量PCR技术，针对副溶血弧菌的特异性基因片段进行检测，可实现快速、准确的检测。
生物传感器技术
通过将副溶血弧菌的特异性抗体或基因片段固定在传感器上，实现对副溶血弧菌的快速检测。
人群特点

副溶血性弧菌标准的检验方法

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。

在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。

为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。

第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。

2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。

3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。

4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。

5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。

（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。

副溶血性弧菌检测

副溶血性弧菌的分布与传播
分布
副溶血性弧菌主要分布在近海岸的海水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中，尤其在温带和亚热带地区的沿海水域更为常见。
传播
副溶血性弧菌主要通过食用被污染的海产品，尤其是生的或未煮熟透的鱼、贝类等传播给人类。此外，也可通过直接接触带菌的水或食物传播。
副溶血性弧菌的致病性
结果报告
根据检测结果，撰写并提交检测报告。
04 副溶血性弧菌检测的应用与意义
在食品安全领域的应用
食品生产过程监控
副溶血性弧菌检测是食品安全监控的重要环节，用于确保食品在生产、加工和储存过程中的卫生
安全。
食品质量评估
通过检测食品中副溶血性弧菌的数量和种类，评估食品的质量和安全性，确保消费者健康。
提供科学决策依据
副溶血性弧菌检测数据可为政府和相关部门提供科学决策依据，促进食品安全、环境保护和公共卫生领域的政策制定和实施。
05 副溶血性弧菌检测的挑战与展望
当前面临的挑战
检测方法的局限性
目前常用的副溶血性弧菌检测方法，如培养法、免疫学方法和分子生物学方法，存在灵敏度不高、特异性不强、操作繁琐等问题，难以满足快速、准确检测的需求。
分离培养法具有较高的特异性，但检测时间较长，且对操作人员的技术要求较高。
免疫学检测方法
免疫学检测方法利用抗体与抗原的特异性结合来检测副溶血性弧菌，包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验等。
免疫学检测方法具有快速、简便的优点，但可能出现假阳性或假阴性的结果。
分子生物学检测方法
分子生物学检测方法利用DNA或RNA的特异性序列来检测副溶血性弧菌，如聚合酶链式反应（PCR）、基因芯片等。
检测规范

副溶血性弧菌的快速检测技术

3、多重PCR
结果显示，所有的V.p都扩增出tl基因，tl 基因是V.p特异的；54％的V.p扩增出tdh基因；只有38.73％的V.p扩增出trh基因;该法灵敏度 38.73 V.p trh ; 高，能把10g牡蛎培养肉汤里10～100个V.p 检测出来。与其他常规生化方法相比，多重 PCR更快速，仅8h就能完成检测，结果更为准确、可靠，而且还可改进成定量竞争PCR，对标本中靶序列进行定量。
3、多重PCR
由于不是全部副溶血性弧菌都含有tdh基因或trh基因，所以只针对tdh或trh的单一PCR，有时会漏检。多重PCR(multiplex-PCR)能全 PCR(multiplex-PCR) 方位高效率地检测V.p。 Bej白等针对tl、tdh、trh设计不同的引物对，在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、 trh。
总结
与传统方法相比较，PCR法更加快速、灵敏，基本满足了快速检测的要求，但是其技术含量较高，试剂费用都比较高，而且一般检测时间也还是要6-8小时左右，离即时检测的要求还有一定距离，随着分子生物学和科技水平的不断提高，更加准确、可靠、方便、快速、经济、安全的检测方法将是食品安全检测的发展方向。
参考文献
• [1] 张凡非. 副溶血性弧菌及其引起的食物中毒研究进展. 中国卫生监督杂志, 2003, 10 (1) : 8 -10. • [2] 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会. GB/T4789.7—2008. 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验. 北京: 中国标准出版社, 2008. • [3] 刘秀梅, 陈艳, 王晓英, 等. 1992-2001年食源性疾病爆发资料分析-国家食源性疾病监测网. 卫生研究, 2004, 33 ( 6) : 725 727. • [4] 朱雪兰,陈艳. 副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展. 国外医学卫生学分册, 2007, 34 (4) :233-237. • [5] 程苏云,张俊彦,王赞信, 等. 海水产品副溶血性弧菌污染定量检测分析. 中国卫生检验杂志, 2007, 17 (2) :336-338.

副溶血性弧菌致病性和检测方法研究

doi :10.3969/j.issn.1002-7386.2022.22.034·综述与讲座·副溶血性弧菌致病性和检测方法研究进展陈媛媛　王亚男　刘士朋项目来源:河北省医学研究重点课题(编号:20211149)作者单位:100029　北京市,中日友好医院(陈媛媛);河北省宁晋县医院(王亚男);河北医科大学公共卫生学院环境与人群健康重点实验室(刘士朋)通讯作者:刘士朋　E⁃mail:17100880@ 【摘要】　本文对副溶血性弧菌的生物学性状、致病性特点、污染食品规律、食物中毒事件、检测标准等进行综述,重点介绍了溶血毒素和检测方法,提出预防副溶血性弧菌食物中毒5要点和关键措施,以期更好地预防副溶血性弧菌食物中毒的发生。

【关键词】　副溶血性弧菌;食物中毒;耐热性溶血毒素;耐热性溶血毒素相关溶血毒素;检测标准【中图分类号】　R 378.3 【文献标识码】　A 【文章编号】　1002-7386(2022)22-3491-05Study on pathogenicity and detection method of Vibrio parahaemolyticus CHEN Yuanyuan ∗,WANG Yanan ,LIU Shipeng.∗China⁃Japan Friendship Hospital ,Beijing 100029,China【Abstract 】　This article systematically reviews related aspects in Vibrio parahaemolyticus (VP ),including biological characteristics ,pathogenic characteristics ,contaminated food conditions ,food Posisoning incidents detection standard ,etc.,focusing on hemolytic toxins and detection methods.Five key points for preventing VP⁃related food poisoning and treatment measures are proposed aiming to to better prevent the occurrence.【Key words 】　vibrio parahaemolyticus ;food poisoning ;thermostable direct hemolysin ;thermostable related hemolysin ;testing standards 副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)是一种常见的病原菌,主要栖息在海水中,存在于近海海水、海产品及盐渍食品中。

2023年检验类之临床医学检验技术(师)题库附答案(典型题)

2023年检验类之临床医学检验技术（师）题库附答案（典型题）单选题（共30题）1、患儿男，8岁，贫血3年，HB70g/L。

体检贫血貌，心尖区有收缩期杂音，脾肋下2cm。

祖籍广西，母有贫血史。

A.骨髓涂片检查B.血红蛋白电泳C.G6PD活性测定D.抗人球蛋白试验E.酸化血清溶血试验【答案】 C2、发霉花生产生的毒素与下列哪种肿瘤关系最为密切（）。

A.原发性肺癌B.食管癌C.原发性肝癌D.肉瘤E.胶质神经瘤【答案】 C3、区分副溶血性弧菌菌株的致病性用A.肥达试验B.O-T试验C.外斐试验D.神奈川试验E.抗O试验【答案】 D4、WHO将精子不动活力定为（）级。

A.ⅣB.ⅡC.0D.ⅢE.Ⅰ【答案】 C5、载脂蛋白AⅠ能激活下列哪种酶（）A.脂蛋白脂肪酶B.卵磷脂胆固醇酰基转移酶C.肝脂肪酶D.脂肪组织脂酶E.胰脂酶【答案】 B6、对餐后2小时血糖表述错误的是A.可反映胰岛β细胞的储备能力B.餐后2小时血糖升高是心血管疾病的独立危险因素C.是一种简化的葡萄糖耐量试验D.测量计时开始时间为用餐完毕后即刻E.严格控制餐后2小时血糖更有利于糖化血红蛋白达标【答案】 D7、属于人源化抗体的是A.改形抗体B.小分子抗体C.抗体融合蛋白D.双特异性抗体E.以上均不是【答案】 A8、与诊断不稳定血红蛋白病不相符的实验结果是（）。

A.热变性试验（＋）B.血片中红细胞大小不均，可见异形或碎片C.异丙醇试验（＋）D.红细胞镰变试验（＋）E.变型珠蛋白小体（＋）【答案】 D9、正常尿液中pH值为A.4.5～8.0B.8.0～8.9C.9.0～10.0D.7.35～7.45E.1.5～3.0【答案】 A10、下面哪一项不属于BAS作用的特点A.生物素、亲和素间结合具高度专一性和亲和力B.适用于多种标记免疫分析技术C.BAS虽能提高方法的灵敏度，但相应也可增加非特异性D.生物素、亲和素的结合不易受酸碱条件的干扰E.亲合素的四个生物素部位可同时结合多价性的生物素化衍生物【答案】 C11、患者MCV、MCH均升高，MCHC正常，最可能是以下贫血中的A.缺铁性贫血B.急性失血性贫血C.慢性失血性贫血D.巨幼细胞性贫血E.急性溶血性贫血【答案】 D12、可用于观察妇女激素水平的是A.巴氏染色B.HE染色C.吉姆萨染色D.瑞氏染色E.瑞－吉复合染色【答案】 A13、目前临床上最常用于检测抗核抗体初筛实验的"金标准"是A.间接免疫荧光法，以Hep-2细胞为细胞基质片来提供抗原的来源B.Western BlotC.间接免疫荧光法，以小鼠肝印片为细胞基质来提供抗原的来源D.ELISAE.以上均不是【答案】 A14、有关ALL以下说法正确的是A.免疫学分型将T细胞ALL分为4个亚型B.免疫学分型将B细胞ALL分为3个亚型C.仅10％ALL患者可检出克隆性核型相关性D.除ALL-L3型外，ALL的免疫学亚型与FAB亚型之间无相关性E.免疫学分型将ALL分为T系ALL，B系ALL，T、B细胞混合型ALL 【答案】 D15、MCV70fl，MCH正常，RDW13%属于（）。

副溶血性弧菌检验课件

培养温度
在37℃下培养24-48小时，观察是否有细菌生长。
分离培养
分离培养基
在SS（Salmonella Shigella）培养基上进行分离培养，副溶血性弧菌在此培养基上呈现绿色菌落。
菌落形态
观察菌落的形状、大小、色泽等特征，以初步判断是否为副溶血性弧菌。
生化鉴定
氧化酶试验
副溶血性弧菌为阳性结果。
基因测序
对PCR扩增产物进行测序，与副溶血性弧菌的基因序列进行比对，以确定是否为副溶血性弧菌。
快速检测方法
Hale Waihona Puke 免疫胶体金试纸条利用抗原抗体反应的原理，将特异性抗体或抗原固定在试纸条上，当与样品中的副溶血性弧菌抗原或抗体结合后，会出现显色反应，判断是否为副溶血性弧菌。
生物传感器
利用生物传感器技术，将副溶血性弧菌的特异性抗体或抗原固定在传感器上，当与样品中的副溶血性弧菌结合后，会产生电信号或光信号，通过信号的强弱判断副溶血性弧菌的浓度。
消毒处理
对接触过患者的物品和环境进行消毒处理。
加强监测
加强食品和水质的监测，及时发现并控制副溶
血性弧菌的传播。
消毒与灭菌方法
高温消毒
将食品或物品加热至70度以上，持续一段时间进行消毒。
紫外线消毒
使用紫外线灯对空气和表面进行消毒。
化学消毒
使用漂白粉、酒精等化学药剂进行消毒。
煮沸消毒
将水加热至沸腾状态，持续一段时间进行消毒。
培养特性
副溶血性弧菌为需氧或兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，适宜温度为37°C，适宜盐浓度为2-4%。
流行病学特点
01
02
03
传染源
副溶血性弧菌主要来自海产品，如鱼类、贝类、甲壳类等。

副溶血弧菌的致病性及检测方法

ＴｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
ＺＨＡＮＧＪｉｎｊｉｎ，ＨＵＱｉｎｇｈｕａ２，ＬＩＬｉａｎｑｉｎｇ。（１．ＦｕｔｉａｎＤｉｓｔｒｉｃｔＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＰｒｅｖｅｎｉｔｏｎａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ，Ｇｕｎｇａｄｏｎｇ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０４０，Ｃｈｉｎａ；
ＣｅｎｔｅｒｏｒｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ，Ｓｈｎｘａｉ，Ｔａｉｙｕｎａ０３００１２，Ｃｉｎｈａ）
［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｉｓａｋｉｎｄｏｆｈａｌｏｐｉｌｈｉｃｂａｃｔｅｉｒａｉｎｔｈｅｃｏｓｔａｌｗａｔｅｒｓ．Ｉｔｈａｓｆａｓｔ
ｔｅｓｉｔｎｇ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｖｅｓｉｇｔａｉｔｏｎｎｄａｈｏｓｐｉｔａｌｉｎｆｅｃｉｔｏｎｃｏｎｒｔｏｌｌｉｎｇｉｎｓｔｅａｄｏｆｈｅｔｒｔａｄｉｉｔｏｎｌａｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌａ

副溶血性弧菌

精品课件
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六、检验实验
目前副溶血性弧菌的检验采用国标法（GB/T 4789.7—2013 ）
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a) 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b) 冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃；
c) 恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃；
d) 均质器或无菌乳钵；
4.纯培养
挑取三个或以上可疑菌落，划线3 ％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃ 土l ℃ 培养 18h--24h.
精品课件
33
5.初步鉴定
氧化酶试验
挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。
涂片镜检
将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色．镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛.
VP试验方法：取一种细菌的24h纯培养
物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置
37'C培养48～72h取出后在培养液中先加
VP试剂甲液0.6mL，再加乙液0.2mL，充
分混匀。静置在试管架上，15min后培养
液呈红色者为阳性，以“ ”表示；不变色
为阴性，以“—”表示。1h后可出现假阳
性。或者可以用等量的硫酸铜试剂于培养
1966年国际弧菌命名委员会正式命名为副溶血性弧菌。
精品课件
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中毒食品主要是海产品鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋
类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染．
精品课件
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副溶血性弧菌致病性
致病因子： 1、耐热直接溶血素TDH，肠毒素

食品微生物学检验副溶血性弧菌检验(三)

食品微生物学检验副溶血性弧菌检验（三）6.1 制备接种两管3%试管斜面，36℃±1℃培养18h～24h。

用含3%的5%溶液冲洗3%斜面培养物，获得深厚的菌悬液。

6.2 K抗原的鉴定取一管6.1制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清举行检测，浮现凝集反应时再用单个的抗血清举行检测。

用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对比间隔。

在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴K抗血清。

在对比间隔内加一滴3%氯化钠溶液。

轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1min。

阳性凝集反应可以立刻观看到。

6.3 O抗原的鉴定将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121℃灭菌1h。

灭菌后4000r/mιn离心15min,弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4000min离心15min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。

用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。

在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分离加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自疑对比。

轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1mm。

阳性凝集反应可以立刻观看到。

假如未见到与O群血清的凝集反应，将菌悬液121℃再次高压1h后，重新检测。

假如仍为阴性，则培养物的O抗原属于未知。

按照表1报告血清学分型结果。

表1副溶血性弧菌的抗原 7 神奈川实验(选做项目) 神奈川实验是在我妻氏琼脂上测试是否存在特定溶血素。

神奈川实验阳性结果与副溶血性弧菌分别株的致病性显著相关。

用接种环将测试菌株的3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂18h培养物点种于表面干燥的我妻氏血琼脂平板。

每个平板上可以环状点种几个菌。

36℃±1℃培养不超过24h,并立刻观看。

阳性结果为菌落周围呈半透亮环的β溶血。

8 结果与报告按照检出的可疑菌落生化性状，报告25g(mL)样品中检出副溶血性弧菌。

假如举行定量检测，按照证明为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数(MPN)检索表，报告每g(mL)副溶血性弧菌的MPN值。

副溶血性弧菌检验

2）培养特性
嗜盐：在含氯化钠(20-30g／L最适) 的培养基
上生长，无盐和110g ／L以上不生长。
生长温度：最适为37℃，4 ℃不生长。
pH: 最适pH为7.4-8.0。
需氧Байду номын сангаас:需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢。
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3）抵抗力
敏感：淡水等无盐环境不耐热对酸敏感，在2％冰醋酸或食醋中立即死亡，对氯、碳酸、来苏水等一般化学消毒剂敏感：对磺胺噻唑、氯霉素、合霉素敏感。耐受：耐高浓度NaCl－海水，盐渍酱菜中存活时间较长；耐低温的抵抗力较强耐青霉素、磺胺嘧啶。
历史：食物中毒于1950年在日本首发，副溶血性弧菌（V. parahemolyticus）于我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。
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2、分类:弧菌科、弧菌属。
3、副溶血性弧菌生物学特性
1）菌体形态学特征 3）抵抗力 5）致病性 2）培养特性 4）生化特性
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1）菌体形态学特征
本菌为G-，多形态，无芽孢，单端单鞭毛，有嗜盐特性，在30-37℃最适温度时增长较快，一般冬季不易检出。
10
中毒原因:烹调时未烧熟、煮、透,或熟制品污染后未再彻底加热。中毒食品:副溶血性弧菌食物中毒多发生在海产品大量上市时。中毒食品主要是海产品,其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类,约有半数为腌制品。主要症状:中毒后潜伏期一般在10小时左右。发病急,主要症状为恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发热,尚有头痛、多汗、口渴等症状。失水过多者可引起血压下降，电解质紊乱，出现虚脱。少数严重病人由于休克、昏迷而死亡。食用提醒: *加工海产品一定要烧熟煮透。 **烹调或调制海产品、拼盘时可加适量食醋。
谢谢大家

副溶血弧菌SHJLA株的分离鉴定及致病性分析

ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＴｈｅＳＨＪＬＡｓｔｒａｉｎｆｏｒｍｅｄｂｌｕｅ — ｇｒｅｅｎｃｏｌｏｎｉｅｓｏｎＴＣＢＳａｎｄａｕｂｅｒｇｉｎｅｃｏｌｏｎｉｅｓｏｎｖｉｂｒｉｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍ．Ｉｔｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｌｓｏｍｅｔｔｙｐｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ．ＴｈｅＳＨＪＬＡｓｔｒａｉｎｐｏｓｓｅｅｓｓｅｄ
Ｃｈｉｎａ，＂２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａｎｄＩｍｍｏｕｎｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＣｏｌｌｅｇｅｆＶｏｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ
ＳＨＪＬＡ菌株的基因组为模板，检测副溶血弧菌种特异性基因（ｔｌｈ、ｔｏｘＲ、ｇｒｏＥＬ）均为阳性，ｇｙｒＢ基因序列分析表明ＳＨＪＬＡ与副溶血弧茵的亲缘关系最近，同源性达９８％～１００％；检测副溶血弧菌主要毒力相关基因ｔｄｈ和Ｔ３ＳＳ２（ＶｏｐＣ２和ｖｃｒＤ２）均为阳性。该菌的神奈川溶血实验为阳性，对小鼠的半数致死量（ＬＤ）为４．８ ×１０ｃｆｕ／ｍＬ。结合ＳＨＪＬＡ菌株的形态、生理生化、

副溶血性弧菌标准的检验方法

副溶血性弧菌标准的检验方法副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。

在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。

为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。

5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。

（二）检验程序图6-1副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。

副溶血性弧菌讲解

2、增菌
（1）定性检测
将制备好的 1:10 样品匀液于 36 ℃±1℃培养 8 h～18 h。
（2）定量检测
•用无菌吸管吸取 1:10 样品匀液 1 mL，注入含有 9 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备 1:100 的样品匀液。
•另取 1 mL 无菌吸管，按之前操作程序，依次制备 10 倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支 1 mL 无菌吸管。
MR:阳性（红色）
左侧为阴性对照
VP：阴性
五、抗原的特征
O抗原是耐热的菌体抗原，目前有O1~O13共 13种，可用于血清学鉴定。 K抗原是一种荚膜抗原，现有K1~K71，也用于血清学鉴定。中国大陆副溶血弧菌大部分是O3：K6。
六、检验实验
目前副溶血性弧菌的检验采用国标法（GB/T 4789.7—2013 ）
-
生化
乳糖硫化氢赖氨酸脱羧酶
性
VP
+ -
状
ONPG
-
阳性：+ 阴性：-
3 ％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深。
嗜盐性试验
挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种 0%、 6%、8%和 10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培养 24 h，观察液体混浊情况。
b.典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径 2 mm～3 mm。从培养箱取出 TCBS 平板后，应尽快（不超过 1 h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。
4.纯培养
在SS平板上，菌落中等大小，长出1～2mm扁平、无色、半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘稠状。

副溶血性弧菌

研究对象：样品中是否检出副溶血性弧菌。
02 定性检测检验原理
特点：首先将样品接种到氯化钠琼脂平板和ss琼脂平板各一个，培养18-24h观察研究对象：根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告每克（毫升）副溶血性弧菌的MPN值。
检验流程
样品25g(ml)+3%氯化钠碱性蛋白胨水
36±1℃18h
副溶血性弧菌
furongxuexinghujun
制作人：刘明路
01
生物学特性
shengwuxuetexing
02
04 06
检验原理
jianyanyuanli
目录
CONTENTS
03 05
实验材料
shiyancailiao
操作步骤
caozuobuzhou
检验结果
jianyanjieguo
注意事项
zhuyishixiang
嗜盐性试验
将上述培养物接种无盐胨水
、7%、11%氯化钠胨水。
检验结果
检验结果
初步鉴定结果
副溶血性弧菌：氧化酶试验：阳性。涂片镜检：G-，棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 3％氯化钠三糖铁斜面：底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。嗜盐性试验：分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水中培养，在无氯化钠和10％氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在7％氯化钠的胰胨水中生长旺盛。
首先将样品接种到氯化钠琼脂平板和ss琼脂平板各一个，培养18-24h观察。也可增菌液直接分离。
生化试验
V-P、靛基质、甲基红试验等
第三步第二步
第四步
第五步
第六步
可以菌落培养

副溶血弧菌及其检测方法

副溶⾎弧菌及其检测⽅法副溶⾎弧菌及其检测⽅法副溶⾎弧菌副溶⾎性弧菌(⼜称嗜盐菌VibrioParahaemolyticus)是⾰兰⽒阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。

本菌嗜盐畏酸，在⽆盐培养基上，不能⽣长，3%～6%⾷盐⽔繁殖迅速，每8～9分钟为1周期，低于0.5%或⾼于8%盐⽔中停⽌⽣长。

在⾷醋中1～3分钟即死亡，加热565～10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。

副溶⾎性弧菌⾷物中毒也称嗜盐菌⾷物中毒，是进⾷含有该菌的⾷物所致，主要来⾃海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、⾁类或蔬菜。

临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及⽔样便为主要症状。

主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤⾎等。

已知副溶⾎弧菌有1种O抗原及种K抗原，据其发酵糖类的情况可分为5个类型。

各种弧菌对⼈和动物均有较强的毒⼒，其致病物质主要有分⼦量42000的致热性溶⾎素(TDH)和分⼦量48000的TDH类似溶⾎毒(TRH)，具有溶⾎活性、肠毒素和致死作⽤。

溶⾎性试验我妻⽒⽤⾼盐⾎琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶⾎性弧菌时出现的溶⾎反应，称此溶⾎性能为“神奈川现象”。

此试验要求是⽤⼈或兔的新鲜红⾎球制备⾼盐⾎平板，经37、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶⾎环或在菌落下⾯有明显溶⾎者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶⾎环或⽆明显溶⾎者，为“神奈川现象”阴性。

有致病性的副溶⾎性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。

试验副溶⾎性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原），Ｋ抗原（荚膜抗原）及Ｈ抗原（鞭⽑抗原），，进⾏副溶⾎性弧菌⾎清学鉴定时，可⽤O抗原分群，将18-24h的培养物，⽤3％⾷盐⽔作成较浓的菌悬液，121⾼压1h或100煮沸后，⽤此菌悬液进⾏O抗⾎清玻⽚凝集试验，同时⽤⽆菌⽣理盐⽔作对照，如O凝集反应阳性时，可⽤不经加热的菌悬液进⾏Ｋ抗⾎清玻⽚凝集反应分型判定。

副溶血性弧菌检验

•
O1- O13 共13种
• K抗原型（荚膜抗原）
•
K1- K71 共65种
• H抗原（鞭毛抗原），无特异性
三、检测程序
食品安全国家标准副溶血性弧菌检验 4789.7 -2013
4789.7-2013
1、样品制备
• 食品样品
•
鱼类：表面组织、肠、鳃
•
贝类：全部内容物（贝肉和体液）
•
甲壳类：动物的中心部分，包括肠、
状、弧状、球状、卵圆形等）排列不规则
• 液体培养基生长单鞭毛，固体培养基常有周生鞭毛（侧毛）
二、生物学特性培养特性
• 需氧兼性厌氧 • 在含 3-4%的培养基中生长良好 • 无盐和 10%的培养基中均不生长 • 最适培养温度为：3037℃ • 最适范围：7.48.2
• 在固体培养基上，菌落通常隆起，圆形半透明，表面光滑、湿润、一般不产生色素。
科玛嘉弧菌显色平板紫色菌落
4、纯培养挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯
化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1 ℃培养18 h～24h。 5、初步鉴定氧化酶试验
涂片镜检
3%氯化钠三糖铁嗜盐性试验
• 底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变，有动力
6、确定鉴定
• 甘露醇发酵试验含3%氯化钠的培养基
• 分类：属弧菌科()，弧菌属。
• 分布：主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海
产品中。
•
人多因食用被本菌污染而又未煮
熟的海产品和其他食品而引起中毒。
•
流行病学
• 季节分布：8-9月为高峰期 • 中毒食品：主要为海产品、其次为水产制
品、淹制品、咸菜及污染食品 • 地区分布：沿海地区居多 • 临床症状：主要有腹痛、腹泻、恶心、呕

食品中副溶血性弧菌的检验

食品中副溶血性弧菌的检验
食品中副溶血性弧菌的检验
一、概况媒介食品副溶广泛存在于海岸和海水中，海生动
植物常会受到污染而带菌。海鱼、虾、蟹、蛤等海产品带菌率极高；被海水污染的食物、某些地区的淡水产品如鲫鱼、鲤鱼等及被污染其他含盐量较高的食物如咸菜、咸肉、咸蛋亦可带菌，也可因受到污染而引起中毒。带用少量该菌的食物，在适宜的温度下，经3～4小时细菌可急剧增加至中毒数量。进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。
无粘性，(绿)兰色，直径2—4mm 嗜盐选择性平板：直径2.5mm，圆整或不
齐，隆起混浊，无粘性，无色，湿润。 4、选择性培养
取上述可疑菌落接种于3.5% Nacl-TSI 培养37℃ 24小时 5、镜检：取上述可疑菌落镜检，应为革兰氏阴性，无芽胞多形态，两端浓染。
食品中副溶血性弧菌的检验
副溶血性弧菌在海博弧菌显色培养基上典型特征。典型副溶
7、生化试验
• 分别接种各类生化培养基，置37 ℃恒温培养。除V-P、靛基质、甲基红试验培养48小时后加试剂观察外，其他均可在24小时观察。试验结果判定参照下表。
食品中副溶血性弧菌的检验
生化特性
葡萄糖产酸葡萄糖产气蔗糖乳糖甘露醇硫化氢甲基红
7、生化试验
副溶血性弧菌的生化性状表
血性弧菌显蓝色至蓝绿色，霍乱弧菌和其它弧菌显无色。
副溶血弧菌在蔗糖琼脂（tcbs）平板上的菌落
食品中副溶血性弧菌的检验
6、嗜盐性试验
将可疑培养物接种于不同盐浓度的盐胨水中，37℃ 24小时，观查生长情况。盐含量 0、3、7、9、11% ，在3-7 %生长良好。
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食品中副溶血性弧菌的检验