免疫组织化学染色 实验
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实验二 免疫组织化学SP实验
一 目的
• 掌握免疫组织化学（SP法）的ຫໍສະໝຸດ Baidu理、方法 和注意事项。
二 SP原理
• 利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用 试剂盒所提供的生物素化二抗与一抗特异 结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的链 霉卵白素，底物被辣根过氧化物酶分解显 色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、 定性及定量的研究。
三 器材与试剂
• 1 器材: 显微镜,染色缸, 镊子,吸水纸，湿盒. • 2 材料: 小鼠小肠冰冻切片 • 3 试剂: PBS，SP试剂盒，一抗，DAB试剂 盒， 乙醇，二甲苯，中性树胶
四 步骤
• • • 1 冰冻切片——冷丙酮4℃固定15分钟——干燥 2 PBS洗3次，3分钟/次 3 加1滴3%H2O2，室温10分钟（灭活内源性过氧化物酶）
•
• • •
4 PBS洗3次，3分钟/次
5 加1滴血清，室温10分钟（封闭组织中的电荷基团） 6 倾去血清，勿洗，加50ul一抗，37℃孵育40分钟-1小时（在湿盒中进行，避免组 织面干燥）
• 7 PBS洗3次，3分钟/次，加一滴二抗，37℃孵育10分钟 • 8 PBS洗3次，3分钟/次， 加1滴SP工作液，室温10分钟 • 9 PBS洗3次，3分钟/次，加DAB工作液，孵育1-2分钟（肉眼变色即可） • DAB工作液现配，为1ml蒸馏水加一滴A（缓冲液）, B（浓缩型DAB， 即二氨基联苯胺，是辣根过氧化物酶的显色底物）,C （浓缩的H2O2） 混匀，因DAB有潜在致癌作用，注意防护。
五 结果
• β-actin，广泛分布于各种组织中，是肌肉细丝及 细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能。定位 于细胞质内，为粗细一致的棕黄色颗粒，显色强 时为棕褐色。
• DAB显色原理：过氧化物酶催化底物中的过氧化氢水解，释放出氧，使
DAB氧化为吩嗪多聚体，在光镜下为不溶于水的棕色颗粒。
• 10 蒸馏水终止反应，洗净DAB，晾干 • 11 脱水，透明，封片： • 80%，95%乙醇各1次，1分钟/次——100%乙醇2次，1分钟/次—— 二甲苯透明，2次，1分钟/次——中性树胶封片 • 注意设置阴性对照和阳性对照
一 目的
• 掌握免疫组织化学（SP法）的ຫໍສະໝຸດ Baidu理、方法 和注意事项。
二 SP原理
• 利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用 试剂盒所提供的生物素化二抗与一抗特异 结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的链 霉卵白素，底物被辣根过氧化物酶分解显 色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、 定性及定量的研究。
三 器材与试剂
• 1 器材: 显微镜,染色缸, 镊子,吸水纸，湿盒. • 2 材料: 小鼠小肠冰冻切片 • 3 试剂: PBS，SP试剂盒，一抗，DAB试剂 盒， 乙醇，二甲苯，中性树胶
四 步骤
• • • 1 冰冻切片——冷丙酮4℃固定15分钟——干燥 2 PBS洗3次，3分钟/次 3 加1滴3%H2O2，室温10分钟（灭活内源性过氧化物酶）
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• • •
4 PBS洗3次，3分钟/次
5 加1滴血清，室温10分钟（封闭组织中的电荷基团） 6 倾去血清，勿洗，加50ul一抗，37℃孵育40分钟-1小时（在湿盒中进行，避免组 织面干燥）
• 7 PBS洗3次，3分钟/次，加一滴二抗，37℃孵育10分钟 • 8 PBS洗3次，3分钟/次， 加1滴SP工作液，室温10分钟 • 9 PBS洗3次，3分钟/次，加DAB工作液，孵育1-2分钟（肉眼变色即可） • DAB工作液现配，为1ml蒸馏水加一滴A（缓冲液）, B（浓缩型DAB， 即二氨基联苯胺，是辣根过氧化物酶的显色底物）,C （浓缩的H2O2） 混匀，因DAB有潜在致癌作用，注意防护。
五 结果
• β-actin，广泛分布于各种组织中，是肌肉细丝及 细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能。定位 于细胞质内，为粗细一致的棕黄色颗粒，显色强 时为棕褐色。
• DAB显色原理：过氧化物酶催化底物中的过氧化氢水解，释放出氧，使
DAB氧化为吩嗪多聚体，在光镜下为不溶于水的棕色颗粒。
• 10 蒸馏水终止反应，洗净DAB，晾干 • 11 脱水，透明，封片： • 80%，95%乙醇各1次，1分钟/次——100%乙醇2次，1分钟/次—— 二甲苯透明，2次，1分钟/次——中性树胶封片 • 注意设置阴性对照和阳性对照