一株产纤维素酶益生芽孢杆菌的筛选与鉴定

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产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。

常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。

2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。

3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。

二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。

常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。

2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。

3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。

三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。

2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。

3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。

4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。

综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。

通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。

一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果

ｃｎｉｏｓｏ０ｒｒｎａ２ｅｒｅＣｈｅｐａａｅｏｄｇｃｎｓＥ／ｅ）ｅｏｌｃｎｅ（Ｂ／ｅ）ａｄＢｏｄｔｎｆ２ａ８ｄｇｓ．Ｔｅｋｌｓｆｎｏｌａａｅ（ＧＣｎ，ｘｇｕａａＣＨＣｘｎ．ｉ１／ｉｔｅｖｕｅｕｓ
基。１）全国优秀博士学位论文专项基金（０５４；２０４）黑龙江省杰出青
年基金（Ｃ０９９。Ｊ２００）第一作者简介：李保深，，９５年２月生，男１８东北林业大学林学院，硕士研究生。通信作者：高大文，东北林业大学林学院，授。Ｅｍｉｄｗｎ教 — ａ：ａｅ— ｌ
ｇｅｓａｅ（．ａｅｅ．５，．８ｎ．８／ｓｃｖｌｌｏｉｓＢＧｓ）ｗｒ３８６２６１ａｄ１４７ＩｍＬｒｐｔｅ．ｙｄｅＵｅｅｉｙ
ＫｅｗｏｄＳｒｅｅａａｉｎｙｒｓｃｎｓｐｔ：Ｐｅｉｉｉｍｅｕｅｓ；１Ｓｒｅｒｏｎｃｌｕｄｃｍｂｎｌ８ＤＮＡ；Ｃｌｌｅ；Ｓａｎｎｌｃｒｎｍｉｒｓｏｅｅｌａｕｓｃｎｉｇｅｅｔｏｃｏｃｐｓ
ｇｏｇｉ．ｏｏａ＠ｍａｌｅｍ
１材料与方法
收稿日：１期２０年ｌ２０２月９日。责任编辑：红。程
１２分析方法。将纯培养菌株接人发酵培养基中，２、０／ｉ摇床８℃ １ｍｎ２ｒ培养７ｄ用移液枪吸取１ｍ，Ｌ发酵液离心（０／ｉ，９００ｒｍｎ５ｍｉ）上清液即为粗酶液。ｎ，酶活力的测定：滤纸糖化力的测定。取粗酶液０５ ① ．ｍ，Ｌ加入醋酸一醋酸钠缓冲液（Ｈ值４８０１ｏＬ２ｍ，ｐ．，．ｍｌ）Ｌ／然后加入一张（ｘ）１ｍ６ｍ新华１ｃｃ号滤纸， ℃恒温水浴１５０ｈ

一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究

第５１卷第５期２１０２年９月
中山大学学报（自然科学版）
ＡＣＴＡＳＥＮＴＩＣＩＡＲＵＭＮＡＴＵＲＡＬＩＵＭＵＮＩＶＥＲＳＴＡＴＩＩＳＳＵＮＹＡＴＳＥＮＩ
Ｖｏ．Ｎｏ５１５１．
Ｓｐ．２０１ｅ２
一
株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究
ｔ０ｏ，ｗｈｌｈｒｗｔｏ５ＣｉｅｔｅｇｏｈｐＨａｇｓｆｏ５．ｏ１．ｒｎｅｍ０ｔ１０．ＴｈｕｔｒｏｉｏｓａＨ．ｒｅｃｌｕｅｃｎｄｔｎｔｐ６０～９．ｉ０，３～４４Ｃｎ．０ｏａｄ１５％～３．％Ｎａｒｈｓｕｔｂｅｆｒｅｚｍｅｐｏｕｔｎ．Ｔｅｏｔｍａｅ５Ｃ１ａｅｔｅｍｏｔｓｉａｌｏｎｙｒｄｃｉｏｈｐｉｌｔｍｐｅａｕｅｆｒｒｔｒｏ
行了产纤维素酶研究，认为Ｂｕｉｓ．ｐｍｌ是一种抗分ｕ
ＰＲ引物由上海生工合成。Ｔａｇｎ细菌基『组总Ｃｉｅｎ大］
ＤＡ提取试剂盒购白天根生化科技（京）有限Ｎ北
公司。１２方法．
１２１样品预处理取采集到的土壤样品５ｇ于．．
纤维素是地球上光合作用产量最高的多糖，它是由葡萄糖以Ｂ一１４糖苷键连接而成的线状大分，子物质。据报道，纤维素全球年产量为１５× 卜．１万ｔ０。高效纤维素酶的研究开发是可再生性资

一株产纤维素酶真菌的筛选和诱变

湖南农业科学
２１（１：４２００，１）２￣７
ห้องสมุดไป่ตู้
ＨｕａｇｉｕｔｒｌｃｅｃｓｎｎＡｒｌａＳｉｎｅｃｕ
一
株产纤维素酶真菌的筛选和诱变
蒋琼凤，张金金周斌谢达平黄光文，，，
（．１湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙４０２；１１８
Ｋｅｏｄ：ｃｌｌｓ；ｔａｎｉｒｖｍｅｔｃｌｌｓ— ｒｄｃｎｕｇｓｙｗｒｓｅｌａｅｓｒｉｍｐｏｅｎ；ｅｌａｅｐｏｕｉｇｆｎｕｕｕ
纤维素是植物材料的主要成分，也是地球上最丰富的可再生资源，曾被指望用于解决人类的食它
２湖南科技学院生命科学与化学工程系，．湖南Ｉ永州４５０）、２１０
摘要：自从然环境初筛出产纤维素酶活力较高的真菌１。６株经摇瓶发酵复崤，了产纤维素酶活较高且酶活力稳定胞真菌ｌ获得
株，固体发酵ＣＣ酶活力为２９２３ＵｇＦＡ酶活力为２３６Ｕｇ经紫外诱变处理．其Ｍ７．Ｉ、Ｐ５０．／８。获得一株酶话力比出发菌株更高的菌株ｚ，１其固体发酵ＣＣ酶活力为３５．／、ＰＭ４８ＵｇＦＡ酶活力为５６６ＵｇＦＡ酶活较出发菌株提高了２８。５８０．／，Ｐ７．倍多次传代培养表明４
ｏｅｓａｎｗｉｎｔｉｔＣＭＣｓｃｉｉｆ２９２５／ｎＰｓｃｉｉｆ２３８／ｙｓｌ－ｅｍｅｔｔｎｗｓａｑｉｄｒｈａｅａｔｔｏ７．３ＵｇａｄＦＡａｅａｔｔｏ０。６Ｕｇｂｏｉｆｒｎａｉａｃｕｒ．ｖｙｖｙｄｏｅＴｅｔｄｗｉｒａｅｔＵＶ，ｔｅｃｌｌｓｐｏｕｉｇａｉｔｆｍｕａｅｔｉｌｈｓＭＣｓｃｉｉｓ３５．８Ｕｇａｄｈｈｅｌａｅ－ｒｄｃｎｂｌｙｏｔｔｄｓｒｎｚ，ｗｏｅＣｕｉａａｅａｔｔｉ５４８／ｎｖｙＦＡａｅａｔｉｓ５６７ｇｎｈＰｓｃｉｉｓｉｃｅｓｄｂ．８ｔｓｃｍｐｒｄｗｉｈｔｏｈｒｇｎｌＰｓｃｉｔｉ０．６Ｕ／．ａｄｔｅＦＡａｅａｔｔｉｎｒａｅｙ２４ｉｏａｅｔｔａｆｔｅｏｉｉａｖｙｖｙｍｅｈｓｒｉ．ｈｃｉｉｅｆｔｉｓｂｌ－ｉｌｕｃｌｒｒｔｂｅｔｎＴｅａｔｔｓｏｒｎｙｍｕｔｔａｖｉｓａｉｍｅｙｓｂｕｔｅａｅｓａｌ．ｕ

产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定_吴敏峰

Ｃ（ｃｍ）０．４３２±０．０１４０．６０６±０．０４７０．６４５±０．０１８０．６３４±０．０５５０．７０２±０．０５３０．６６８±０．０５１０．４１２±０．０１３０．６６８±０．０５１０．３３０±０．０２３０．５２８±０．０５８７０．６０７±０．０５６４０．５８１±０．０３２９０．２３２±０．００８０．３９９±０．０８４４０．５９９±０．０３１６０．５５５±０．００６２０．３６７±０．０３０２
各种生长、生理生化试验均以培养２０￣２４ｈ的斜面为种子。
除特别说明外，一般形态学观察和生理生化性状
２１
生物技术
吴敏峰等：产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定
试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第９版［９］和《微生物学实验》［１０，１１］进行属和种的鉴别。
纤维素的微生物，有真菌、细菌、放线菌等。由细菌所产生的纤维素酶一般最适ｐＨ值为中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。目前的研究多集中在真菌
表５梭菌属细菌的鉴定及结果
菌株
碳水化合物发酵
生化反应
Ａ１葡萄糖麦芽糖甘露糖甘露醇淀粉蔗糖乳糖纤维二糖阿拉伯糖Ｈ２Ｓ尿酶水解酪蛋白水解硝酸盐还原乙酰甲基甲醇
Ｈ／Ｃ３．３２６±０．０４２４１．９７９±０．０９４４２．６４７±０．０３６３２．２２９±０．１０６０２．０１４±０．０８６１２．９０３±０．２７２７３．１４６±０．１４１３２．００４±０．０７６３４．８６４±０．０１９３３．０４０±０．１２６６３．２１４±０．２１４０３．９６０±０．２７４１５．３０６±０．２８７０５．７０７±０．２８６７２．５６６±０．１７１５２．８１３±０．１０８５４．５８０±０．２７０２

(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.

目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。

二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。

这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。

在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。

这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。

随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。

就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。

产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及酶学性质研究

引用格式：崔海洋，程仕伟，黄田红，等．产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及酶学性质研究．食品科学技术学报，２０１４，３２
ＣＵＩＨａｉｙａｎｇ，ＣＨＥＮＧＳｈｉｗｅｉ，ＨＵＡＮＧＴｉａｎｈｏｎｇ，ｅｔａ１．ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｏｆＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓｆｏｒｃｅｌｌｕｌａｓｅ
产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及酶学性质研究
崔海洋，程仕伟，黄田红，李秀娟，杨立红，陈国忠
（鲁东大学生命科学学院，山东烟台２６４０２５）
摘要：对一株产纤维素酶菌株进行分离鉴定，并对其酶学特性进行了初步研究．刚果红染色法
糖水解酶或微晶纤维素酶）和将纤维二糖水解成葡
１材料与方法
１．１材料
萄糖的．葡萄糖苷酶
．水杨素和３，５一二硝基水杨酸，上海生物工程公司；微晶纤维素，Ｓｉｇｍａ公司；细菌基因组抽提试剂
（１６．３９Ｕ／ｍＬ）稍弱外，滤纸酶（７０．３７Ｕ／ｍＬ）、一葡萄糖苷酶（１３１．５５Ｕ／ｍＬ）、羧甲基纤维素酶

纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化

纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi[J]. Advances in microbial physiology, 1995,37(1):1-81.[2] 李燕红,赵辅昆. 纤维素酶的研究进展[J]. 生命科学,2005, 17(4):392-397.[3] 张大羽,诸永,程家安. 黄胸散白蚁和台湾白蚁不同品级虫体内纤维素酶的活性[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版),2001,27(1):1-4.[4] 邱雁临. 纤维素酶的研究和应用前景[J]. 粮食与饲料工业,2001(8): 30-31.[5] 乞永立,耿月霞,任章启. 纤维素酶的生产及应用[J]. 适用技术市场,2000(6):20-21.[6] 刘英昊,崔文华. 纤维素酶及其生产工艺简介[J]. 饲料博览,1997(6):26.[7] 张加春,王权飞,余尊祥. 里氏木霉的纤维素酶产生条件研究[J]. 食品与发酵工业,2000,26(3):1-23.[8] 邬敏辰,李江华, 邻显章. 黑曲霉固态培养生产纤维素酶的研究[J]. 酿酒,1997(6):5-9.[9] 施安辉,刘尔敬. 纤维素酶固体生产和应用中的有关问题[J]. 中国调味品, 1997(10): 6-10.[10] DILLON R J, DILLON V M. The gut bacteria of insects: Nonpathogenic interactions[J]. Annual Review of Entomology, 2004,49: 71-92.[11] CANTWELL B A, McCONNELL D J. Molecular cloning and expression of a Bacillus subtilis 13-glucanase gene in Escherichia coli[J]. Gene,1983,23(2):211-219.[12] GAO J, WENG H, ZHU D, et al. Production and characterization of cellulolytic enzymes from the thermoacidophilic fungal Aspergillus terreus M11 under solid-state cultivation of corn stover[J]. Bioresource Technology, 2008,99(16):7623-7629.[13] 刘韫滔,榻淑霞,龙传南,等. 纤维素降解菌L-06的筛选､鉴定及其产酶条件的分析[J]. 生物工程学报, 2008,24(6):1112-1116.[14] 周刚.白蚁内生菌的分离及其纤维素酶､木质素酶高产菌株的鉴定[D].哈尔滨: 黑龙江大学,2006.[15] 李方. 一株白蚁内生放线菌次级代谢产物及纤维素酶的研究[D]. 南京: 南京大学,2008.[16] 张树政. 酶工业制剂(下册)[M]. 北京:科学出版社,1998. 606-608.[17] 林祥木,童金秀,陈汉清,等. 产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的选择[J]. 福建农林大学学报(自然科学版),2003,32(4):510-513.[18] 雷朝亮,荣秀兰. 普通昆虫学[M]. 北京:中国农业出版社,2003.[19] 彩万志,庞雄飞,花保祯,等. 普通昆虫学[M]. 北京:中国农业出版社,2001.[20] 张应烙. 昆虫肠道真菌的新活性物质研究[D]. 南京:南京大学,2008.[21] HAWKSWORTH D L. Fungal diversity and its implications for genetic resource collections[J]. Studies in Mycology,2004,50:9-18.[22] WHITE M M,LICHTWADT R W. Fungal symbionts (Harpellales) in Norwegian aquatic insect larvae[J]. Mycologia,2004,96(4):891-910.。

产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究

ＰＡ０Ｓ６。
１．复筛——ｃｃｅ１１ ①葡萄糖标准曲线。．２４Ｍｃａ法［￣。ｓ，１３】按参考文献ｌ定并绘制标准曲线。②酶活力测定。样品准备：ｌ２坝０
将芽孢杆菌菌种活化后接种于种子培养基中． ℃ 培养３７
１３２羧甲基纤维素钠（．．ＣＭＣ— ）Ｎａ的配制。２取ｇ羧甲基纤维素钠溶于２００ｍＬ蒸馏水中．浴加热至完全溶解．一层水用纱布过滤。滤液１０取０ｍＬ，入０２ＬＬ的醋酸缓冲液（Ｈ加．ｍｏ／ｐ值为４６２ｍＬ，馏水４ｍＬ混匀，．）０蒸０贮存于冰箱备用（１周后
所有菌种均由四川农业大学生物医学工程实验室保存。
１２培养基．
ＣＭＣ— 培养基（：Ｎａ％）ＣＭＣ— 、白胨０５酵母膏Ｎａ１蛋．、
５ ℃ 水浴锅中预热２ｎ对照管置于沸水浴中１ｍｉ然后０ｍｉ，０ｎ．在４支试管中加入４ｍＬ已预热至５ ℃ 的底物溶液．品管０样置于５ ℃ 水浴准确计时５ｎ取出。每管立即加入ｌ０ｍｉｍＬ２ｌＬ氢氧化钠溶液和２ＬＤＮＳ显色液．ｍｏ／ｍ摇匀后样品管与对照管都置于沸水浴准确计时３ｎ取出．流水迅速冷却，ｍｉ
维普资讯
动物科学
现代农业科技￣０６１月２０件的初步研究
祝小王振华潘康成吴敏峰

芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程

芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。

据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。

我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。

纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。

但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。

目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。

采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。

因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。

一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定

一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定2董鹤娟1’2，丁轲蚍～，恒子钤2，彭春平2，罗伟光hf1．河南省动物疫病与公共安全院士工作站，河南，洛阳471003；2．河南科技大学宏翔发酵饲料实验室，河南，洛阳471003)摘要：为了获得产纤维素酶的芽孢杆菌，从河南省不同地方采集玉米地、秸杆垛的土壤样品58份，利用刚果红平板法分离产纤维素酶的芽孢杆菌，采用3，5．二硝基水杨酸法测定纤维素酶活，结合菌落特征、显微形态、生理生化试验和16S rDNA序列进行鉴定。

结果表明：从分离出的42株产纤维素酶菌株中筛选出一株产纤维素酶较高的菌株B．LY02，纤维素酶活力可达0．5351 U／mL。

该菌株呈短杆状，革兰氏染色阳性，能形成芽孢。

基于16S rDNA序列同源性比较分析表明该菌株与Bacillus lic henifo rmis s tr ain CICCl0095的亲缘关系最近，基因序列的同源性为96．5％，因此鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌。

关键词：纤维素酶；芽孢杆菌；分离；鉴定我国是粮食大国，纤维素资源极为丰富，每年仅农作物秸秆产量就高达7．0亿吨，约占世界的20 ％[1—2】。

但是秸杆的成分主要是较难降解的纤维素，所以目前秸杆仅有极少部分用于反刍动物饲料，绝大多数都被燃烧，不仅造成了资源的浪费，而且还会带来环境污染[3—4】。

另一方面，由于我国大规模发展畜牧业，人畜争粮的现象已很严重。

所以研究将秸杆中的纤维素降解成畜禽可利用的多糖、蛋白质或其他营养成分已成为当务之急。

目前最可能利用的手段就是筛选高效纤维素酶分解菌，我们认为秸杆纤维素的降解不是单一菌种能够解决的，因为秸杆的降解需要p．葡聚糖酶、内切p一葡聚糖酶和 p一葡萄糖苷酶等多种纤维素酶共同参与才能完成【4]。

已有的研究主要集中在真菌方面，如里氏木霉、绿色木霉、白腐菌、米曲霉等is一71，对细菌方面研究的较少。

而且真菌存在活性不稳定和生物安全隐患等问题，但是芽孢杆菌具有产酶能力强，耐高温、强酸，环境适应能力强等特点，所以很适宜作为秸杆发酵用菌种。

纤维素酶产生菌的鉴定与筛选

纤维素是高等植物细胞壁的主要成分, 也是地球上最丰富的资源。纤维素酶是一组分解植物纤维素的酶 , 主要有 1, 4 葡聚糖水解酶( Cx ) 酶和 1, 4 葡聚糖纤维二糖水解酶 ( C 1) 酶。它们能将植物纤维分解为葡萄糖, 能破坏植物细胞壁, 使其释放蛋白体、淀粉等营养成分, 能消除饲料中非淀粉多糖的抗营养作用, 提高饲料利用率和畜禽生产性能。饲用纤维素酶主要由霉菌产生, 因此, 筛选出高活性纤维素酶的菌株是开发利用纤维素资源和提高饲料营养价值的前提和关键。故进行了本试验, 以期为生产高活性饲用纤维素酶奠定基础 , 现报告如下。 1 材料与方法 1 1 待检样品的采集和处理从自然界中采集朽木、土壤、粪堆土、草底土、发霉秸秆和霉变玉米等样品, 分别放入三角瓶中, 加入适量的生理盐水 , 室温浸泡 6h( 每 2h 振荡一次 ) , 作为待检样品。 1 2 1 3 培养基 PDA 和 CCM , 按常规方法配制。霉菌的分离培养与鉴定用接种环将待检样品分别划线接种于 PDA 和 CCM 平坂上, 另外将数个 PDA 和 CCM 平板敞口于试验室内 2h, 进行空气接种 ; 将接种的平板置 28 恒温箱中培养 3~ 7 天。然后 , 采用挑取典型单个菌落法或稀释后涂抹平板法进行纯培养。分纯后的菌株接种于试管斜面保存菌种, 接种于平板观察培养性状及孢子和菌丝形态特征。 1 4 纤维素粗酶液的制备称取稻草粉 3g, 麦麸 2g , 于 250m L 三角瓶中, 加入 1% 硫酸铵溶液 ( 以自来水为溶剂配制) 10mL , 混匀后 121 3 灭菌 30min, 接种斜面霉菌孢子一环 , 充分摇匀后于 28 培养 72h 成曲 ( 脂 ( P DA) 板和察氏培养基 ( CCM ) , 从自然界和饲料中分离出 6 种 8 株霉菌 , 分别是产黄青霉 1 株 ( 9908) , 米根霉 1 株 ( 9917) , 米曲霉 1 株 ( 9935) , 高大毛霉 1 株 ( 9939) , 黑曲霉 2 株 ( 9930、 9934) , 绿色木霉 2 株( 9916、 9942) 。经滤纸崩溃法、 CMC 糖化力、棉花糖化力测定, 证明 8 株菌能产生纤维素酶。其中产 Cx 酶高的菌株是 9930、 9934, 产 C1 高的菌株是 9930、 9934、 9942。关键词霉菌 ; 纤维素酶 ; 鉴定; 筛选一次 ) , 加蒸馏水 100m L , 40 恒温水浴培养 1h( 每 15m in 摇动一次 ) , 用脱脂棉过滤, 滤液为粗酶液, 另设一瓶不接种的培养基滤液, 为对照溶液。 1 5 纤维素酶活力的测定 1 5 1 滤纸崩溃法( C 1 酶 ) 在 200mL 三角瓶中加 8m L 粗酶液, 2mL 0 2m ol/ L 、pH 4 6 醋酸缓冲液, 2 张 1 1cm 大小的新化滤纸 , 45 保温 , 反复振荡 ( 100 次 / 分) , 观察滤纸刘崩溃程度 , 记录滤纸完全消失所需要的时间。用对照溶液代替粗酶液作为对照颖组, 其余同试验。 1 5 2 羧甲基纤维素钠盐 ( CM C) 糖化力 ( Cx 酶) 取 0 5mL 适当稀释的粗酶液 , 加入 2mL 1% CM C 溶液 , 50 水浴中反邵红

一株高产纤维素酶菌的筛选与鉴定

收稿日期:2007-10-25;修回日期:2007-11-05通讯作者:王义强,E 2mail:W angyiqiang12@yahoo 。

基金项目:国家948项目(2006-4-123)一株高产纤维素酶菌的筛选与鉴定刘海波,王义强1,陈介南,张伟涛,韩　笑(中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙　410004)摘　要:利用刚果红脱色从森林腐木中筛选到一株高产纤维素酶菌,结合18S r RNA 基因序列分析和菌株形态特性分析,确定该菌株为爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum )。

通过研究粗酶提取时不同离心时间和离心转速对酶活的影响,确定采用3000r/m in,15m in 离心条件下获得的粗酶测定C MC 酶活,采用4000r/m in ,10m in 的离心条件下获得的粗酶测定FP A 酶活和β2葡萄糖苷酶活。

酶学性质初步研究显示,纤维素酶反应的最适pH 值以510为宜;C MC 酶最适酶解温度和酶解时间为60℃,15m in;FP A 和β2葡萄糖苷酶最适酶解温度和酶解时间均为50℃,20m in 。

关键词:刚果红;纤维素酶;爪哇正青霉;18s r RNA 中图分类号:Q93・33文献标识码:A文章编号:1008-9632(2008)03-0016-05 迄今为止,已有很多关于纤维素酶生产菌株的研究报道,其中主要以木霉属,曲霉属和青霉属为主[1],李忠兴等[2]用筛选的康宁木霉T215液体深层发酵生产纤维素酶的扩大实验获得了令人满意的结果,黄秀梨等[3]分离出1株产纤维素酶较高的黑曲霉突变菌株22812C,并对其产生的纤维素酶进行了研究。

我国每年有10亿吨纤维素物质,其中大部分纤维素资源没有得到充分利用,如果其中一半加以利用,可生产酒精1000万t 。

就目前国内外研究而言,纤维素酶活力不高而导致酶用量过大是限制纤维素资源应用的主要因素之一[4],因此进一步寻找和开发高产纤维素酶菌种,是纤维素资源能否高效利用的关键。

一株纤维素酶产生菌的筛选鉴定

2 结果与讨论
2.1 菌种筛选分离 2.1.1 初筛从纤维素选择培养基 A 上挑选出生长较快的单菌落 20 个，将上述 20 个单菌落接种于纤维素选择培养基 B 上，培养基 B 的唯一碳源设计能够保证生长出来的菌落的可分解微晶纤维素粉的菌种，筛选出透明圈直径 (D)与菌落直径(d)之比最大的菌株 8 株，结果见表 1。
第 21 卷第 5 期
四川理工学院学报（自然科学版）
Vol．21 No．5 Oct．2008
2008 年 10 月
JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY OF SCIENCE ＆ ENGINEERING （NATURAL SCIENCE EDITION ）
文章编号：1673－1549 （2008 ）05－0067－04
中发现的，除了已知的许多微生物能分泌纤维素酶外，一些高等动植物也能分泌。微生物产纤维素酶研究较多，已发现许多真菌和细菌都能分解利用纤维素，目前用于研究生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的是木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属和漆斑霉属。细菌、放线菌由于分泌的纤维素酶活性较低且胞外分泌型较少相对研究不多。纤维素酶已广泛地应用于食品、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域中，在生物能源方面，以植物纤维
[7] 参见《常见细菌系统鉴定手册》等文献中的方法以
取 1mL 稀释 10 倍的酶液，加入 lmg 滤纸条、 1mL pH5.0 的柠檬酸缓冲溶液于 55℃ 保温 60min，再加入 3mL DNS 试剂，于沸水中煮 15min，采用 DNS 法测定 OD540nm，对查还原糖标准曲线，以每分钟酶液产生 1mol 还原糖所需的酶量为一个酶活单位（1U/mL ）。 1.2.3.4 纤维素分解活性的测定失重法：将 0.5g 的滤纸 (或其它纤维素物质 )作为唯一碳源制作 100mL PCS ( 蛋白胨纤维素培养液 )，接种 5mL 菌液， 50℃静止培养 72h 后， 5000r/min 离心，倒上清液，用盐酸和硝酸的混合液冲洗而消除菌体，离心，清水洗，离心， 105℃烘干后称重，计算失重量和失重率。PCS 的成分为蛋白占 5g/L，纤维素 (滤纸或稻草粉 )5g/L， NaCl 5g/L， CaCO3 2g/L，酵母粉 lg/L。在 50℃静止培养，使其处于 DO(溶氧)为 0.02~0.4 的微好氧状态。

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。

这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。

在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。

这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。

随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。

就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。

一株产淀粉酶_蛋白酶益生芽孢杆菌的分离与鉴定

表 2 PCR 反应程序
过程 95 ℃预变性
94 ℃变性 58 ℃退火 72 ℃延伸 72 ℃最终延伸
时间 5 min 30 s 30 s 2.0 min 5.0 min
×30 个循环
比对分析（丁延芹，2004）。 1.7 系统发育树的构建所测细菌 16S rDNA 全序列与 GeneBank 中已知芽孢杆菌模式菌的 16S rDNA 全序列一起，利用 MEGA 3.0 软件，绘制系统发育树，并计算遗传距离。发育树中芽孢杆菌属（Bacillus）菌株分别为：附琼脂芽孢杆菌（B.agaradhaerens）、嗜碱芽孢杆菌（B.alcalophilus）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、产氮芽孢杆菌（B.azotoformans）、栗褐芽孢杆菌（B.badius）、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、环状芽孢杆菌（B.circulans）、克氏芽孢杆菌（B.clarkii）、克劳氏芽孢杆菌（B.clausii）、凝结芽孢杆菌（B.coagulans）、苛求芽孢杆菌（B.fastidiosus）、坚强芽孢杆菌（B.firmus）、霍氏芽孢杆菌（B.horikoshii）、缓病芽孢杆菌（B. lentimorbus）、迟缓芽孢杆菌（B.lentus）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、海洋芽孢杆菌（B.marinus）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、蕈状芽孢杆菌（B. mycoides）、巴氏芽孢杆菌（B.pasteurii）、短小芽孢杆菌（B.pumilus）、球形芽孢杆菌（B.sphaericus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）。 1.8 蛋白酶活性测定将获得的芽孢杆菌，先经过 37 ℃培养 24 h 活化，以牙签点接种于蛋白酶测定平板上。 37 ℃培养 24 h，测定水解透明圈直径（H）与菌落直径（C），计算 H/C 值。

一株产纤维素酶益生芽孢杆菌的筛选与鉴定

产纤维素酶菌种的筛选与优化

一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果

一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究

一株产纤维素酶真菌的筛选和诱变

产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定_吴敏峰

(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.

产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及酶学性质研究

纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化

产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究

芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定

纤维素酶产生菌的鉴定与筛选

一株高产纤维素酶菌的筛选与鉴定

一株纤维素酶产生菌的筛选鉴定

实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定

一株产淀粉酶_蛋白酶益生芽孢杆菌的分离与鉴定

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定