细菌截留验证之工艺风险评估

细菌截留验证之工艺风险评估

不同等级的风险与过滤工艺参数是相联系的，有些与过滤前产品中的微生物繁殖有关，而另外一些与较高的细菌穿透过滤器的风险相关。见表2。

表14-7 工艺风险评估因素

C. 挑战微生物选择标准

缺陷假单胞菌（B.diminuta）ATCC ®19146TM（历史上为P. diminuta），被选择作为细菌挑战实验的微生物。如果使用了其它细菌，这些细菌必须小至可以挑战除菌级过滤器的截留能力，并可以模拟在产品中发现的最小微生物。相应地，替代挑战微生物可被用于验证研究，只要原有的过滤前微生物污染水平被发现是更相关的。如果可能，自有微生物污染水平应该被描述、计数和鉴别，因为这些微生物有穿透除菌级过滤器的潜在可能性。被分离的微生物形态也要考虑。

挑战微生物的尺寸需要通过穿透0.45微米孔径的膜来确认，这是每个挑战实验的阳性对照。在标准培养基条件下生长的缺陷假单胞菌（见下“培养基维护和挑战微生物制备”）在高挑战水平下（通常≥107）会少量透过0.45微米滤膜。有些情况下，缺陷假单胞菌不一定是代表最差条件的模型。如果选用了不同的挑战微生物，需要提供文件解释。

D. 培养基维护和挑战微生物制备

缺陷假单胞菌ATCC®19146TM可以冻干的形式从美国典型培养物中心（ATCC）或者本国的同等机构获得。在按照ATCC的规程复壮微生物后，可

以按照微生物操作规范在适宜的培养基中冷藏或冷冻保存。需要建立用于挑战研究的工艺分离物的储存条件。

两种标准技术被公认适宜用于细菌挑战实验用缺陷假单胞菌的制备和维护。它们是SLB法和FCP法（冷冻细胞浆法）。两种方法都被发现可有效生产适宜的缺陷假单胞菌悬液，缺陷假单胞菌的尺寸大约为直径0.3-0.4微米，长度0.6-1.0微米。

替代的培养基和培养方法也可能同样有效制备缺陷假单胞菌，只要这些方法可以生产出单一的，分散的细胞，尺寸适宜穿过0.45微米孔径的膜过滤器。替代培养法需要被验证。库存的细菌挑战培养物的聚集情况可用光学显微镜检查。如果观察到聚集现象，将保存培养物置于超生波清洗槽的冷水中10分钟是可将团聚物分散的一个方法。水浴的气穴作用可将细菌细胞分散，不影响细胞活性。应使用光学显微镜、活性计数和0.45微米孔径对照过滤器的下游回收来确认分散效果。

细菌挑战实验浓度应保证在目标工艺时间里提供始终如一的挑战，挑战的水平达到基于过滤器表面积至少107 CFU/cm²。当计算细菌挑战浓度时，应综合考虑诸如流速、时间和压差等操作参数。

大于等于107/cm²的细菌挑战水平就是对除菌级过滤器的要求（历史上用0.2微米孔径来标称的过滤器）。这一水平来源于Bowman的观察和她的建议，即缺陷假单胞菌在大于104－106 CFU/ cm²细菌挑战水平时可穿透0.45微米标称的膜，应当用107 CFU/cm2缺陷假单胞菌来证明0.2微米标称的膜为“除菌级”，以确保有足够的灵敏度发现超尺寸孔。细菌挑战浓度（CFU/ml）不应与细菌挑战水平（CFU/cm2）相混淆。

缺陷假单胞菌悬液的生存力和滴度应使用合适的回收培养基来确认，例如大豆酪蛋白消化肉汤或者米勒辛顿琼脂。当进行过滤器挑战时，细菌挑战菌悬液的活力滴度应当在挑战前和挑战后立刻被确定。上游细菌滴度应使用被认可的微生物学测试方法确认。应使用同样的培养基确认任何在下游回收的缺陷假单胞菌。