活化与保藏
实验室菌种扩大培养的流程
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在进行实验室菌种扩大培养之前，需要做好充分的准备工作。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
胶质芽孢杆菌
胶质芽孢杆菌的活化、分离纯化、优良菌株的保藏一、培养基的配方1.硅酸盐细菌培养基：酵母浸膏0.3克，蔗糖10.0克，硫酸铵0.5克，碳酸钙0.5克，七水硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾1克，蒸馏水1000毫升，pH值7.0-7.2。
2.无机磷培养基：蒸馏水1000毫升，葡萄糖10.0克，硫酸铵0.5克，七水硫酸镁0.3克，氯化钠0.3克，氯化钾0.3克，硫酸亚铁0.036克，一水硫酸锰0.03克，磷酸三钙2.0克，琼脂15克，pH7.0-7.2。
3.钾细菌筛选培养基：蔗糖（10g），酵母膏（0.5g），Na2HPH4（2g），（NH4）2SO4(1g)，MgSO4.7H2O(0.5g)，CaCO3(1g)，钾长石粉（1g），其中K2O质量分数为9.60%，琼脂（15g），去离子水（1L），调节初始pH值为7.0。
二、菌株活化、培育和挑选：将菌种提前从下层冰箱取出，然后接种到硅酸盐细菌培养基中进行28℃恒温培养2天，每隔12小时观察一次，并选取长势优良菌株，实施分离纯化，直到得到生长优良的纯菌落。
三、解磷、解钾能力的测定：将上述所挑选的优良菌种接种于无磷培养基恒温培养七天，采用溶磷圈法进行解磷能力测定。
用溶磷圈直径与菌落直径的比值（HD/CD）大小分析该菌种的解磷能力，比值越大，解磷性能就越好。
把解磷能力优良的胶质芽孢杆菌采用低温斜面保藏法保藏。
四、菌种扩大培养培养液用5个100ml三角瓶分装，高压灭菌或间歇灭菌后，挑选斜面菌种上的菌苔接种到培养液中，25到28℃下培养3天。
培养期间，每天要定时摇瓶3到5次，每次3分钟，以加速菌体繁殖。
然后接种到5个500ml的三角瓶扩大培养。
最后接种到2000ml的塑料壶中培养并保存。
钾细菌在这种以淀粉为能源的培养基中生长繁殖时，它们的夹馍消失，且能大量生成芽孢。
因此培养液没有粘性，菌体是均匀的悬浮在培养液中的，这样的菌悬液很适合作固体菌剂接种的菌种。
菌种的活化
-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。
直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。
开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养
总结一下菌种活化需要以下几个步骤：
第一配置菌种适宜生长的培养基
第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻
第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮
第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落
培养基：LB培养基，对于含有质粒的菌种可以在活化培养后，接种到含有抗生素的平板上，进行筛选，然后将长出的菌落接种到斜面或者平板上保存。
微生物培养及保藏标准操作规程
1. 目的规范微生物使用及保藏的相关操作，避免二次污染。
2. 范围适用于企业内所有微生物的使用及保藏3. 职责微生物保管人员负责保藏，质量监督员监督执行情况。
4. 内容4.1培养基需经验证合格后准许使用，使用前需灭菌。
4.2质检菌种的培养及菌种保藏4.2.1大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌的活化及培养固体平板法：选用适用细菌培养的培养基（如：LB培养基；营养琼脂培养基等）灭菌。
酒精灯旁打开融化的无菌培养基瓶口，在酒精灯火焰上通过2~3次后，打开无菌平皿上盖，在酒精灯火焰上在开口处灼烧2~3次，将培养基到入平皿中，盖上平皿上盖，水平放在超净台上冷却完全凝固后使用。
每次倒平板尽量将培养基到完，并及时放回冰箱4℃保存。
点燃酒精灯，酒精灯外焰灼烧接种针（环），烧至通红，冷却后，在酒精灯旁用接种针（环）轻轻挑取待活化的菌种，进行划线培养。
待长出单菌落，挑取单菌落进行液体振荡培养过夜。
平板制备示意图菌种划线培养示意图4.2.2黑曲霉的培养黑曲霉的培养选择马铃薯葡萄糖培养基，将土豆洗净去皮，切成小块，加入水煮沸20min 后，纱布过滤，清液中加入琼脂粉加热溶解后加入葡萄糖。
待葡萄糖溶解后，分装在试管中，塞上管塞，高压蒸汽灭菌后，将试管摆斜面等凝固后接种使用。
接种时用接种环挑沾取黑曲霉孢子，并在试管斜面上由内向外划波浪线。
接种完毕后塞回试管塞并在霉菌培养箱中进行培养，一般5-7天长出孢子。
孢子长出后，放置在4℃冰箱中保藏。
斜面固体培养基的制备接种环的灼烧示意图试管斜面的接种示意图4.2.3菌种的保藏菌种保藏可分为液体甘油保藏及试管斜面保藏。
大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌都采用甘油菌保藏法。
黑曲霉孢子悬液可做甘油保藏。
甘油保藏：接种环灼烧冷却后，挑取单菌落进行过夜增值培养16-18h。
移液器吸取1ml 新鲜培养物于1.5ml离心管中，4500r/min常温离心5min，弃上清。
严格厌氧菌菌种保藏方法
严格厌氧菌菌种保藏方法以下为本实验严格厌氧细菌的保藏方法，如果是兼性厌氧菌可参照好氧菌保藏方法保藏。
一、厌氧细菌的甘油保藏方法：1、厌氧甘油的制备：厌氧瓶或厌氧管中放置一定量的甘油，甘油的量根据需要加入，不要多加，因为厌氧甘油制备好以后不能反复灭菌，反复灭菌甘油会变性而呈黄色，且有一股芳香味道。
加入终浓度为0.04 %的L-cysteine和 1 %的5 %的N2S母液。
往厌氧瓶中通N2，通气时间和配制培养基时时间相同。
盖上塞子和盖子。
121 ℃，20 min 灭菌后备用。
2、取新鲜菌液（对数期），在通N2的情况下，用针筒和针头往有菌液的厌氧管中加入终浓度为15-20 %的厌氧甘油，再通一会N2，目的是赶走在转移甘油过程中带进去的O2。
盖上塞子和盖子，混匀，冻于-80℃。
3、活化：用针头和针头吸取一定甘油保藏的菌液，加到培养基当中，加的量一般要多于1 %，因为厌氧菌的生物量比较小，一般2到5 %左右。
目测加完甘油菌液的培养基是否浑浊，并作记录。
如果加入的菌液太多，造成一开始培养基就比较浑浊，会干扰我们对菌是否生长的判断，而且甘油太多也会抑制菌的生长。
二、厌氧细菌的冷冻干燥保藏方法：1、厌氧牛奶的制备：先配置10 % Difco Skim Milk（BD）的母液。
和厌氧甘油配制方法一样，转移到厌氧瓶中，加入加入终浓度为0.04 %的L-cysteine和 1 %的5 %的N2S母液。
通N2，盖上塞子和盖子。
113℃，15 min 灭菌后放置过夜，于4℃放置备用。
放置过夜后牛奶不结块，溶液均匀，不沉淀才可以用，否则牛奶变性，需要重新配制。
同样，厌氧牛奶只能灭菌一次，反复灭菌牛奶会变性。
2、准备冷冻干燥用的安瓿管，管口要用棉花封住，棉花缠在牙签上，这样拔出比较方便，灭菌并烘干后备用。
3、新鲜菌液离心，尽量除去上清，根据菌量加入10 % 的厌氧牛奶，一般大拇指盖大小的菌体能做15-20支安瓿管左右。
将菌体打散后，迅速分装到安瓿管中，每支安瓿管0.2 ml，并用棉花封住管口，防止杂菌污染。
2018-2019-活化步骤-范文模板 (6页)
本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==活化步骤篇一：菌种活化步骤总结一下菌种活化需要以下几个步骤：第一配置菌种适宜生长的培养基第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的篇二：ACF活化步骤ACF活化步骤说明：F4：反洗出水阀F6：活化进水阀F7：活化出水阀F8：空气排空阀步骤：1. 反洗将要活化的ACF 15-20分钟，小流量排水3分钟2. 将其他未活化的ACFF7打开排水1分钟3. 打开将要活化的ACF的F6，F7，F8阀门4. 确认板式换热器循环侧各阀门均为开启状态5. 打开热水消毒水泵6. 将板换蒸汽侧的排冷凝水阀打开排冷凝水，之后关闭7. 缓慢打开板换蒸汽进口阀门，开始ACF升温8. 待ACF温度升至95℃以上时，打开其他未活化的ACF的F4和F6，冲洗10秒后关闭9. 进入保温阶段，时间不少于2小时10. 保温将要结束时，打开此ACF的两个取样阀，冲洗10分钟后关闭，保温结束，关闭F811. 关闭板换蒸汽进口阀，打开进UF水阀，进入循环降温阶段12. 当ACF温度降至40℃以下冷却降温结束，关闭热水消毒水泵，关闭所有阀门13. 进行ACF反洗，正冲，结束后立即投入使用篇三：斯列普活化炉使用流程官网地址：斯列普活化炉使用流程物料流程：物料进入加料槽后，借重力作用沿着产品道缓慢下行，依次经过预热带、补充炭化带、活化带、冷却带，完成全部活化过程，最后由下部卸料器卸出。
炭化预热段利用炉内热量预热除去水分。
在补充炭化段，炭化料被高温活化气体间接加热使炭的温度不断提高进行补充炭化。
菌种保存与活化
菌种保存与活化（一）培养基保存法利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。
1.普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。
经35℃培养18～24h后，移种于4℃冰箱中，一般可保存一个月，每月传代一次。
2.血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35℃培养生长后，置4℃冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2～4天移种一次，以后逐渐延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。
3.巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移种一次。
4.鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。
5.半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35℃培养18～24h，再以无菌方法加入灭菌的液体石蜡。
高度约lcm，置4℃冰箱保存。
保存时间可达3～6个月。
（二）干燥保存法原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。
菌种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。
（三）冷冻干燥保存法本法又称冷冻真空干燥法。
它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。
用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3～5年，有的可长达10年以上。
菌种保管要求2009-11-16 15:32【大中小】【我要纠错】1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。
一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。
液体培养基不适于保存菌种。
2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。
但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。
YNB培养基养酵母操作流程
YNB培养基养酵母操作流程酵母培养操作方法与步骤1培养基制备【试剂】：冷麦汁、蒸馏水、新鲜鸡蛋。
【器具】：试管(15×150)及(18×180)、小巴氏瓶(三角瓶)、大巴氏瓶(大三角瓶)、卡氏罐、中速滤纸、电炉、量筒、不锈钢锅、糖度计等。
【仪器】：杀菌锅、天平(精度0.1g)。
【方法】〖试管、三角瓶及巴氏瓶培养基的制备〗① 取样：取糖化冷却麦汁，视麦汁浊度情况判定是否进行过滤。
2℃，按每0.5~1L使用一个鸡蛋的比例，加入打成泡沫的蛋清，在不断地搅拌下保温30min;然后升温煮沸30min;将煮沸后的麦汁用水浴冷至80~90℃，用双层中速滤纸过滤。
±② 澄清：将麦汁加热至450.2°P。
±③ 调糖：将过滤后的麦汁用蒸馏水调整糖度为11④ 分装：试管(15×150)5mL，试管(18×180)10mL，分装小巴氏瓶(三角瓶)、大巴氏瓶(大三角瓶)。
⑤ 灭菌：分装后包扎好，115℃杀菌20min;杀菌后培养基放置2~3天，确定无菌后备用。
〖卡氏罐培养基的制备〗取糖化冷却麦汁(有条件的可取薄板前热麦汁)加入卡氏罐，然后封闭卡氏罐取样口，各呼吸阀等接口处均应以棉塞或呼吸阀进行封闭后包扎结实，115℃杀菌30~40min，于室温冷却至17~18℃;接种前以3L/min的速率充纯氧2~3min(卡氏罐有效容积20L)。
2接种操作【器具】：酒精灯、酒精棉、剪刀、接种针、镊子、定量移液器或吸管等。
【仪器】：超净工作台等。
【方法】无菌室使用前，使用紫外线灯照射20~30分钟进行杀菌;进入无菌室换无菌工作服;所有操作采用无菌操作。
〖活化〗① 操作前将冷冻管菌种置于室温下，使之内部培养基达到室温后，振荡均匀;无菌操作，将冷冻管内的培养液全部转入盛有5mL培养基的试管中，于25±1℃培养72±2小时。
② 将试管中的培养液轻轻振荡均匀，用接种环接取三环加入另一支盛有5mL培养基的试管中，于25±1℃培养24~36小时。
菌种保藏及活化使用的注意事项
菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。
首先要挑选优良纯种。
利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的形状，防止变异。
不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。
斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作简单，使用方便，但需定期接种。
因此工作量较大，而且传代次数多易发生变异，因此，仅适用于短期经常使用的菌种。
1.配制培养基，营养成分浓度稍低为宜，特别是糖类尽可能降低，产酸菌种，则应添加少量碳酸钙；2.斜面装液量，斜面以倾斜后不超过试管长度1/2为宜；3.斜面培养，温度较最适稍低，时间较最适略长；4.生长完成后，密封置于2~8℃的冰箱中保藏。
每传代一次，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存1~3个月，酵母菌2个月，细菌1个月。
活化使用：将斜面从冰箱中取出，细菌挑取菌落增菌，或霉菌切块传代培养，培养好即可使用。
冷冻保藏是目前使用较为广泛的长期保藏法之一，适用于所各类微生物，较之于斜面保藏，减少了工作量，延长了保藏时间。
1.准备斜面或平板新鲜培养物一个，10%的无菌甘油溶液；2.用甘油溶液将菌体或孢子洗脱下来，形成菌悬液；3.菌悬液分装，冻存管装液 1mL/支，后置于程序降温盒；4.将程序降温盒置于-80℃冰箱冻存；5.可保藏 1-2 年。
活化使用：1.将冻存菌株置于冻存盒中取出，准备水浴溶解，切勿常温融化；2.将菌株迅速置于水浴速溶，细菌40℃，真菌30℃，约2min 全部溶解后接种到适宜培养基；3.采用适宜条件培养完成即可。
微生物菌种保藏过程中常见的问题
微生物菌种保存过程中常见的问题一、菌种保藏的认识1.刚买回来的阳性菌株是第0代吗？菌株买回来时上面都会写明第几代，常规来说都是第0代。
像购买的ATCC或CICC的冻干粉都是标记为0代的。
2.菌种保藏时为什么要进行分离纯化？分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则。
3.怎样纯化菌株？纯化就是从TSA上或别的非选择性平板上转接一次，这就相当于纯化了。
二、菌种可以保存的种类1.所有的菌都能保存吗？如果不是的话，什么样的菌可以保存？什么样的菌不可以保存？菌种保存的原理是预防或减缓DNA复制时自发突变导致菌种退化，因此要创造代谢不活泼的状态，而菌种保存时使菌种进入休眠态（孢子、芽孢)，并创造干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌种的时间就越长，所以从原理上讲，所有菌种都可用这种方法保存，但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌）等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。
2.菌种保存管能保存霉菌及酵母菌吗？可以。
对于霉菌等真菌需培养7天进行保存，而酵母菌需培养三天将孢子洗脱下来进行保存，保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附孢子和菌丝，相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用。
三、菌种的保存时间和保存条件1.怎样延长菌株的保存时间呢？大量的实验证明菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是最好的，越接近这种保存条件，菌株的保存时间越长。
2.能用菌种保存管永久保存菌株吗？温度越低，保藏效果越好。
从目前的试验数据及实际保存效果来看，-20℃可保存1~5年，-80℃或液氮中可保存5~10年，不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同（例如：大肠、沙门等常规细菌-20℃目前可以保存到6年）。
但需要注意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定，确定菌株无变异。
3.为什么说，如果有条件的话，菌种保存管最好置于-80℃冰箱或液氮中？因为，贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，可极大降低冰晶形成对细菌的伤害，同时可为被保存的菌种创造更低的代谢环境，从而延长细菌保存的时间。
菌种保存与活化
菌种保存与活化（一）培养基保存法利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。
1.普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。
经35℃培养18～24h 后，移种于4℃冰箱中，一般可保存一个月，每月传代一次。
2.血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35℃培养生长后，置4℃冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2～4天移种一次，以后逐渐延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。
3.巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移种一次。
4.鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。
5.半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35℃培养18～24h，再以无菌方法加入灭菌的液体石蜡。
高度约lcm，置4℃冰箱保存。
保存时间可达3～6个月。
（二）干燥保存法原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。
菌种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。
（三）冷冻干燥保存法本法又称冷冻真空干燥法。
它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。
用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3～5年，有的可长达10年以上。
菌种保管要求2009-11-16 15:32 【大中小】【我要纠错】1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。
一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。
液体培养基不适于保存菌种。
2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。
但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。
活化的概念
活化的概念活化的概念是很广范的，以下就活化的概念作一个简单的对菌种活化阐述：菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。
菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境要明白菌种活化的情况就需要了解菌种保藏的方式和方法。
目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃ 冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。
对于不同的保存方式活化的方式也不同：1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。
或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；5 -80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。
直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。
开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。
直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。
开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
总结一下菌种活化需要以下几个步骤：第一配置菌种适宜生长的培养基第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的。
菌种生产的主要程序
菌种生产的主要程序菌种生产是指通过特定的技术和方法，将选定的微生物菌株进行培养、繁殖，使其数量增加，形成具有一定活性和功能的微生物群体的过程。
菌种生产的主要程序包括以下几个步骤：1. 菌种筛选与鉴定：根据生产需求，从自然界或菌种保藏中心筛选出具有特定功能和应用价值的菌株。
通过对菌株的形态、生理生化特性、遗传特性等方面的研究，确定其分类地位和功能特性。
2. 菌种保藏：将筛选出的优良菌株进行长期保藏，以保持其活性和稳定性。
常用的菌种保藏方法有低温保藏、冷冻干燥保藏、液氮保藏等。
3. 菌种活化：将保藏的菌种在适宜的培养基上进行活化培养，使其恢复生长活性。
活化过程中需要注意温度、湿度、氧气等环境条件的控制。
4. 菌种扩繁：将活化后的菌种接种到适当的培养基中，进行大规模的繁殖培养。
扩繁过程中需要严格控制培养条件，如温度、pH 值、营养物质浓度等，以保证菌种的生长速度和活性。
5. 菌种制备：将扩繁后的菌种进行收集、浓缩、干燥等处理，制成适合不同应用场景的菌种产品。
如液体菌种、固体菌种、冻干菌种等。
6. 菌种检测：对生产出的菌种产品进行质量检测，包括菌种纯度、活性、功能性能等方面的评价。
确保产品质量符合相关标准和要求。
7. 菌种包装与储存：将合格的菌种产品进行包装，采用适当的包装材料和方法，以保证产品在运输、储存过程中的稳定性和安全性。
同时，根据产品的特性和使用要求，选择合适的储存条件，如温度、湿度等。
8. 菌种应用：将生产出的菌种产品应用于实际生产中，如农业、食品、医药、环保等领域。
在使用过程中，需要根据具体的应用场景和目标，合理选择菌种类型、剂量、使用方法等，以达到预期的效果。
总之，菌种生产的主要程序包括菌种筛选与鉴定、保藏、活化、扩繁、制备、检测、包装与储存、应用等环节。
在整个生产过程中，需要严格控制各个环节的条件和质量，以确保菌种产品的活性、稳定性和功能性能。
活化与保藏
微生物接种和菌种保藏注意事项下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做。
(一) 液体石蜡保藏法1.液体石蜡灭菌在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，然后于40℃温箱中放置l4d(或置于105～110℃烘箱中lh)，以除去石蜡中的水分，备用。
2.接种培养同斜面传代保藏法。
3.加液体石蜡用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。
4.保藏棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。
利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。
5.恢复培养用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基中培养。
由于菌体表面粘有液体石蜡，生长较慢且有粘性，故一般须转接2次才能获得良好菌种。
(二) 冷冻干燥保藏法1.准备安瓿管选用内径5mm，长10.5cm的硬质玻璃试管，用10%HCl浸泡8～10h后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1～2次，烘干，将印有菌名和接种日期的标签放人安瓿管内，有字的一面朝向管壁。
管口加棉塞，121℃灭菌30min。
2.制备脱脂牛奶将脱脂奶粉配成20%乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并作无菌试验。
3.准备菌种选用无污染的纯菌种，培养时间，一般细菌为24～48h，酵母菌为3d，放线菌与丝状真菌7～10d。
4.制备菌液及分装吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动菌落，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。
用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。
5.预冻将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15mm处(图24—2A)，再通过乳胶管把安瓶管连接于总管的侧管上，总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接(图24—1)，并将所有安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中，(此时槽内温度可达-40～-50℃)，只需冷冻1h左右，即可使悬液冻结成固体。
菌种保藏及活化讲解
故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
5.悬液保藏法（略） 6.低温保藏法
四、菌种保藏的共同注意点
• 1、严格的无菌操作； • 2、用于保存的微生物在生长前必须处于
它生长良好的状态； • 3、保藏过程中要防止退化的发生（不同
一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期 稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备 的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一 综合性表解，以便读后有一全面了解。
1、斜面保藏法和穿刺保藏法
（1）斜面保藏法：是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面 接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃
的保藏方法，分别有不同的保存时间。）
五、与菌种保藏相关的几个概念
• 1、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上， 使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的 营养丰富些。
保藏斜面 → 活化斜面
2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良 的生产性能。 保藏斜面 → 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） →活化斜面
菌种保藏及活化
菌种保藏的原理和方法
一、菌种保藏的目的
保存、不退化
二、菌种保藏的原理
DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代 谢不活泼的状态 。
代谢不活泼的状态
休眠态（孢子、芽孢） 环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）
三、菌种保藏的方法
斜面保藏法和穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
(3)画板时动作要快且轻柔。动作太重会将 培养皿中的培养基划破，不利于菌生长。 动作太慢会有沉降菌进入培养皿中，引 起不必要的污染。
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微生物接种和菌种保藏注意事项
下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做。
(一) 液体石蜡保藏法
1.液体石蜡灭菌在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，然后于40℃温箱中放置l4d(或置于105～110℃烘箱中lh)，以除去石蜡中的水分，备用。
2.接种培养同斜面传代保藏法。
3.加液体石蜡用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。
4.保藏棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。
利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。
5.恢复培养用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基中培养。
由于菌体表面粘有液体石蜡，生长较慢且有粘性，故一般须转接2次才能获得良好菌种。
(二) 冷冻干燥保藏法
1.准备安瓿管选用内径5mm，长10.5cm的硬质玻璃试管，用10%HCl浸泡8～10h后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1～2次，烘干，将印有菌名和接种日期的标签放人安瓿管内，有字的一面朝向管壁。
管口加棉塞，121℃灭菌30min。
2.制备脱脂牛奶将脱脂奶粉配成20%乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并作无菌试验。
3.准备菌种选用无污染的纯菌种，培养时间，一般细菌为24～48h，酵母菌为3d，放线菌与丝状真菌7～10d。
4.制备菌液及分装吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动菌落，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。
用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。
5.预冻将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15mm处(图24—2A)，再通过乳胶管把安瓶管连接于总管的侧管上，总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接(图24—1)，并将所有安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中，(此时槽内温度可达-40～-50℃)，只需冷冻1h左右，即可使悬液冻结成固体。
6.真空干燥完成预冻后，升高总管使安瓿管仅底部与冰面接触，(此处温度约-10℃)，以保持安韶管内的悬液仍呈固体状态。
开启真空泵后，应在5～15min 内使真空度达66.7Pa以下，使被冻结的悬液开始升华，当真空度达到26.7～13.3Pa时，冻结样品逐渐被干燥成白色片状，此时使安瓿管脱离冰浴，在室温下(25~30℃)继续干燥(管内温度不超过30C)，升温可加速样品中残余水分的蒸发。
总干燥时间应根据安瓿管的数量，悬浮液装量及保持剂性质来定，一般3~4h 即可。
7.封口样品干燥后继续抽真空达1.33Pa时，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧，拉成细颈并熔封(图24-2B、C)，然后置4℃冰箱内保藏。
8.恢复培养用75%乙醇消毒安瓿管外壁后，在火焰上烧热安瓿管上部，然后将无菌水滴在烧热处，使管壁出现裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中缓慢进入管
内后，将裂口端敲断，这样可防止再用无菌的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中，放置在最适温度下培养。
冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素(低温、干燥和缺氧等)，是目前最有效的菌种保藏方法之一。
保存时间可长达10年以上。
(三) 沙土管保藏法
1.沙土处理
(1)沙处理：取河沙经40目过筛，去除大颗粒，加10%HCl浸泡(用量以浸没沙面为宜)2～4h(或煮沸30min)，以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。
(2)土处理：取非耕作层瘦黄土(不含有机质)，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目过筛，去除粗颗粒后备用。
2.装沙土管将沙与土按2：1，3：1或4：1(W/W)比例混合均匀装入试管中(10mm×100mm，装置约7cm高，加棉塞，并外包牛皮纸，12l℃湿热灭菌30min，然后烘干。
3.无菌试验每10支沙土管任抽一支，取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适的温度下培养2～4d，确定无菌生长时才可使用。
若发现有杂菌，经重新灭菌后，再作无菌试验，直到合格。
4.制备菌液用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。
5.加样用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1～0.5mL加入沙土管中，用接种环拌匀。
加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。
6.干燥将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5作为干燥剂，可再用真空泵连续抽气3～4h，加速干燥。
将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。
7.保藏沙土管可选择下列方法之一来保藏：
(1)保存于干燥器中；
(2)用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；
(3)将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；
(4)将沙土管装入有CaCl2等干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封口，放入冰箱中或室温下保存。
8.恢复培养使用时挑取少量混有孢子的沙土，接种于斜面培养基上，或液体培养基内培养即可，原沙土管仍可继续保藏。
此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，可保存2年左右。
但不能用于保藏营养细胞。
(四) 斜面传代保藏法
1.贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。
2.斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。
3.培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。
4.保藏斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。
为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。
保藏时间依微生物种类而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2～6个月，移种一次；而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。
此法的缺点是容易变异，污染杂菌的机会较多。
二、注意事项
1.从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后，接种环上带有油和菌，故接种环在火焰上灭菌时要先在火焰边烤干再直接灼烧，以免菌液四溅，引起污染。
2.在真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状态，以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。
3.熔封安瓿管时注意火焰大小要适中，封口处灼烧要均匀，若火焰过大，封品处易弯斜，冷却后易出现裂缝而造成漏气。