第十二章 嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)

第十二章嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）不仅能引起人类急慢性肝炎，而且还可导致原发性肝癌的形成。

乙型肝炎是一种世界性传染病，我国是高流行区。

我国有50%～70%的人群受过乙型肝炎病毒的感染，有8%～10%为乙型肝炎病毒表面抗原携带者，约有一亿人口。

根据1980年全国调查表明，我国现患肝炎病人约2000万人，其中60% 以上为慢性肝炎患者。

然而，遗憾的是至今尚无有效的办法来防治HBV的感染。

目前，乙肝疫苗虽已开始研制并应用，但是，即使普及疫苗接种，现有的乙肝患者及带毒者的治疗，至少在今后的50的内仍然是一个严重问题，何况在我国，疫苗推广尚存在问题，而乙肝的治疗更为困难。

近年来，由于基因重组技术的发展，加速了HBV的研究进程，HBV的基因结构，转录及增殖特性已基本搞清，并且整合在原发性肝癌细胞染色体上的HBV DNA序列亦被证实。

同时采用多种载体系统重组HBV DNA片段，在体外已成功地表达了乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg），乙型肝炎病毒核心和e抗原（HBcAg/HbeAg），可望采用基因工程的方法来制备合适的HBV疫苗替代昂贵的HBV血源性疫苗。

第一节嗜肝DNA病毒科的分类与毒粒结构一、嗜肝DNA病毒的分类乙型肝炎病毒于1986年由国际病毒命名委员会正式划归为一个新病毒科的成员，该科下设正嗜肝DNA病毒属（Orthohepadnavirus）和禽嗜肝DNA病毒属（Avihepadnavirus）。

属于本科的还有东方土拨鼠肝炎病毒（Woodchuck hepatitis virus, WHV）、地松鼠肝炎病毒（Ground squirrel hepatitis virus, GSHV）和鸭乙型肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHBV）。

本科病毒具有类似的毒粒结构，构有嗜肝特性，有明显的种属特异性，并可导致持续性病毒感染。

HBV、WHV等可引起慢性活动性肝炎和原发性肝细胞癌。

二、嗜肝病毒的毒粒结构完整的毒粒即Dane颗粒，直径42 nm，由外膜和核壳组成，后者含有一个环状DNA分子、DNA多聚酶、DNA结合蛋白以及蛋白激酶活性。

完整的HBV颗粒由外膜蛋白（HbsAg）与核衣壳组成，核衣壳由HBcAg构成，其核心部分含有病毒DNA，DNA多聚酶/逆转录酶，蛋白激酶及DNA结合蛋白，另一种存在于急慢性乙肝病人血清中呈可溶性状态的蛋白称之为HBeAg，它是由HBV C基因（不含前C区）编码的，当用2-硫基乙醇，热或轻微的蛋白酶处理HBV核心颗粒时，可使HBcAg转变成HBeAg，亦有人认为HBeAg能形成多聚体形式，可能是病毒核心的一结构成分。

（一）外膜蛋白HBsAg的抗原性比较复杂，有一个属特异性的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d/y和w/r”。

“a”决定簇又可分为a1、a2、a3；“W”决定簇又可分为W1、W2、W3、W4，此外，尚有少见的亚型决定簇q、g、n、x和t。

其中最常见的主要血清型为adw、adr 和ayw。

亚型的地区分布不同，我国以adr为主，adw次之。

新疆、西藏、内蒙地区以ayw 为主。

外膜由蛋白、多糖和类脂组成。

糖蛋白插入双层类脂膜。

毒粒的外膜含有主要蛋白、中蛋白和大蛋白三种蛋白。

1．主要蛋白：含226个氨基酸，由S基因编码，有糖基化与非糖基两种形式，前者为GP27，后者为GP24，两者的比例大致为1︰1。

GP27在146位Asn有一N连结的多糖分子。

根据不同亚型的6个主要蛋白的氨基酸序列分析表明，它有3个疏水区段，7～23，80～98和169～226，为两个亲水区段所隔开。

疏水区段的氨基酸比较保守，氨基酸的变异主要发生在亲水区段。

Tiollais等（1983）认为两个主要蛋白分子通过二硫键形成的二聚物是一个结构单位，它具有完全的HBsAg抗原性，其中第二个亲水区段，即122～155位，含有HBsAg主要的属和亚型的抗原决定簇。

2．中蛋白：由281个氨基酸组成，由前S2和S基因编码。

它是糖蛋白，根据糖基化程度，有两种类型：GP33和GP36。

GP33含有一个多糖分子，而GP36含两个多糖分子。

前S2基因编码的55个氨基酸中亲水性的属多，在外膜表面含一个抗原决定簇，后者与二硫键无关，其免疫原性较主要蛋白为强。

3．大蛋白：由前S1、前S2和S基因编码，它有糖基化（GP42）和非糖基化（GP39）两种类型。

不同亚型的大蛋白的氨基酸长度不同：ay亚型有389个氨基酸，ad亚型有400个氨基酸。

GP42含有一个N连结的多糖，至少N端一部分露在外膜的表面。

每一毒粒含有300～400个主要蛋白分子和40～80个中蛋白和大蛋白分子。

（二）核衣壳蛋白HBV的HBcAg含有一种主要蛋白（P22C），并含有一种蛋白激酶，能使P22C蛋白磷酸化。

P22C羧基端富有Arg（精AA）、Ser（丝AA）和Pro（脯AA）。

在Arg丰富区内有一个八肽的串联重复序列：Ser-Pro-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Gln（谷胱酰胺），这与P22C和HBV 基因组结合有关。

这样的结构与鱼精蛋白和其他DNA结合蛋白相类似。

HBeAg是一个隐蔽的抗原决定簇，可经衣壳的裂解而释放，在患者血清中，呈较小的蛋白(15 Kd)，由P22C经蛋白酶水解形成，其C端为Thr(苏AA)-Thr-Val-Val(缬AA)序列。

（三）基因组HBV的基因组为部分双链环状DNA，单链区长度不等。

其长链（L(-)）的长度是固定的，约3200个核苷酸。

短链（S(+)）的长度为L(-)链的50%～100%。

L(-1)和S(+)链的5′端的位置是固定的，而S(+)链3′端的位置都是可变的。

基因之所以能维持环状结构是由于两条链的5′端各有一个粘性末端序列。

S(+)链的5′端位于1601，L(-)链的5′端位于1826。

粘端的两侧各有一个11 bp的直接重复序列（DR）：5′TTCACCTCTGC，各开始于1824和1590。

称为DR1和DR2。

第二节嗜肝DNA病毒基因组的结构一、四种嗜肝DNA病毒基因组结构上的异同嗜肝DNA病毒具有类似的基因组结构。

HBV（adw）基因组全长为3200 bp。

一般以S(+)链中EcoR I单一切点5′GAATTC的第一个T作为物理图的起始点；无EcoR I切点的，则以相同位置为起始点。

WHV和GSHV的基因组约为3300bp，而DHBV为3021 bp。

HBV与WHV，GSHV和DHBV的核苷酸序列的同源性分别为70%、55%和40%，其中WHV和GSHV核苷酸序列的同源性最高为80%。

不同毒株的HBV L(-)链转录物均含有4个ORF，而且在不同的HBV亚型中基因的缺失或插入均为3的倍数，从而使ORF保持不变；相反，S(+)链的转录物为无任何足够长度的ORF。

所以，L(-)链携带有病毒的全部的编码容量，也正因为是这样把长链称为负链。

4种病毒两条链的5′端均有DR1和DR2，以维持基因组呈环状结构，但是，其重复序列及其间隔距离有差异。

HBV L(-)转录物的4个ORF称为S、C、P和X。

其中P区与其他三个ORF相重叠。

但是DHBV L(-)链转录物缺少X区。

HBV、WHV、GSHV和DHBV不同编码区的长短略有不同。

HBV以及其他嗜肝DNA病毒的基因组在哺乳类动物DNA病毒中是最小的一种，其编码还有广泛的重叠以充分扩大其编码容量。

L(-)链可以阅读其长度的1.5倍。

总结HBV、WHV、GSHV和DHBV基因组结构的差异，如下表：嗜肝DNA病毒基因组结构的差异aa：氨基酸数。

对HBV的主要亚型ayw、adr、adw和aydw进行全序列分析认为，亚型之间的差异为8%～10%，而同一亚型之间的变异为1.5%～2.0%。

4株WHV的全序列分析表明，变异率为1%～3.5%。

二、嗜肝DNA病毒基因组的转录物在感染的猩猩肝细胞中发现有两种主要的HBV聚（A）RNA转录物，分别为2.1（或2.2）kb和3.5 kb，均由L(-)链转录。

2.1kb RNA的5′端在前S2区上游约20 bp处，3′端在C基因起始端，它包括前S2区段，S基因和X区段。

3.5 kb RNA的5′端在前C基因区，3′端与2.1 kb RNA的3′端相同，它包括HBV的全基因组加上大约100 bp。

这提示3.5 kb RNA 来自共价闭合的双链RNA。

HBV转录物未发现拼接现象，至少在2.1 kb和3.5 kb RNA是如此。

2.1 kb RNA是PreS2和S1蛋白的mRNA；而3.5 kb RNA是核心蛋白的mRNA，可能也是DNA多聚酶的mRNA。

除以上2个主要转录物外，还有2.6 kb mRNA，产生pre S1蛋白及0.8～0.9 kb mRNA，它可能与X蛋白有关。

理论上HBV应有4个启动子。

现已知2.1 kb mRNA 启动子与SV40晚期启动子同源，3.6 kb mRNA启动子位于1573～1657 bp区段，并有一个细胞蛋白参与转录调节。

在WHV和GSHV感染并有病毒繁殖的肝脏中也有2.1 kb和3.7 kb的转录物以及一些次要的转录物。

DHBV有第三个主要聚（A）RNA转录物，起始于前S1区起始密码子下游的几个核苷酸处。

第三节嗜肝DNA病毒的繁殖机制HBV DNA在肝细胞内以两种形式存在，一种是游离DNA，一种是整合到宿主细胞染色体中。

游离DNA，它代表病毒复制的中间型，见于HBV感染的急性期和某些慢性期；而整合DNA则常见于慢性病毒感染，特别是原发性肝细胞癌中。

游离的与整合的DNA可存在于同一样本，但并不意味着两种形式不同时存在于同一细胞内。

除肝细胞外，其DNA还可见于肾、胰和皮肤组织细胞中，游离形式和整合形式的HBV DNA还可在骨髓单形核血细胞中发现，这可能与发病机理有关。

关于嗜肝DNA病毒的繁殖机制，根据对DHBV和HBV的研究认为，不同于其他DNA病毒，主要有RNA的中间型。

主要步骤如下：嗜肝DNA病毒的种属特异性可能是由于前S区存在肝细胞受体的识别位点；当病毒进入细胞后，DNA到达核内，即转变为完全的开环双链DNA，随后成为超螺旋DNA，L(-)链通过细胞的RNA聚合酶被转录成3.5 kb RNA，称作前基因组。

从每个基因组合成多拷贝的前基因组。

前基因组带上DNA多聚酶和DNA连结蛋白，以前基因组为模板，经反转录酶合成L(-)DNA。

反转录起始于DR1区，而DNA连结蛋白共价结合子L(-)链的5′端，可能作为L(-)链合成的引物。

在DNA合成过程中，前基因组被一种类似RNase的活性物所降解，这样反转录的产物是一个全长的L(-)链DNA。

有一种大约20 bp 的小RNA片段，可能来自前基因组的5′端，在DR2处，作为合成正链的引物。