黄芩中总黄酮的提取及高速逆流色谱分离纯化

芩的总黄酮粗提物，再应用高速逆流色谱 （HSCCC） 进行分离纯化，得到纯度达90.2 %的总黄酮有效部 位，为本课题下一步药理药效研究奠定基础。
1 仪器与试药
黄芩，购于深圳市药材公司，经广东药学院张纪 新副教授鉴定为唇形科（Labiatae）植物黄芩（Scutellar－ ia baicalensis Georgi.）的干燥根，粉碎至40目备用。
中药新药与临床药理 2010 年 7 月第 21 卷第 4 期
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黄芩中总黄酮的提取及高速逆流色谱分离纯化
李玉兰，张小燕 ，陈桂红（深圳市西乡人民医院，广东 深圳 518102）
摘要：目的 探讨中药黄芩中总黄酮的提取方法，并应用高速逆流色谱进行分离纯化，得到纯度较高的总黄酮 有效部位。方法 采用正交设计法乙醇回流提取得到总黄酮粗提物，再应用高速逆流色谱进行分离纯化。结果 最佳提取工艺条件为：60 %乙醇提取 2 次，溶剂量分别为 12 倍、10 倍，时间分别为 2 h、1 h，粗提物总黄 酮含量达15.8 %；高速逆流色谱两相溶剂系统为氯仿-甲醇-水-醋酸 （4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 0.1，V/V），进样量为400 mg， 得到 45 mg 纯度达 90.2 %的总黄酮有效部位。结论 本实验应用乙醇回流提取及高速逆流色谱分离纯化可得 到纯度较高的黄芩总黄酮有效部位。 关键词：黄芩；总黄酮；提取工艺；高速逆流色谱 中图分类号：R284；TQ460.6 文献标识码：A 文章编号：1003-9783（2010）04-0437-03
中药黄芩为唇形科（Labiatae）植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi.） 的干燥根，是中国药典收录的传 统中药。黄芩性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解 毒、止血、安胎等功效[1]。现代药理研究证明黄芩具 有抗氧化作用、抗炎、抗变态作用、抗菌抗病毒作 用、抗肿瘤作用以及良好的改善心血管功能的作用， 其抗炎、抗肿瘤等多种活性作用的主要活性成分为黄 酮类成分[2-3]。目前，黄芩总黄酮的提取及纯化方法 有水煎煮法、乙醇提取法、超声波法、微波提取法和 大孔树脂法等[4-5]，多为传统方法，所得总黄酮纯度 较低，本文采用正交设计法乙醇回流提取先行得到黄
样品测定：黄芩药材提取液稀释定容至适当体 积 ； 取 总 黄 酮 粗 提 物 适 量 用 甲 醇 溶 解 定 容 ， 在 278 nm处测定吸光度，从标准曲线上读出总黄酮含量， 测得精提物中总黄酮含量为15.8 %。 2.2 高速逆流色谱分离纯化 2.2.1 两相溶剂体系及分配系数的测定 本实验中 HSCCC溶剂系统经参考文献[9-10]确定为氯仿-甲醇-水醋酸体系。用紫外分光光度法测定样品在本溶剂体系 不同比例中的分配系数。称取适量（约2 mg）总黄酮粗 提物置于5 mL试管中，分别加入已经达到平衡的上、 下相溶剂各1 mL，振荡使样品充分溶解，静置平衡， 分取上、下层溶液，用紫外分光光度法测定溶剂体系 上、下层所含总黄酮的浓度，求得二者样品在该溶剂 系统中的分配系数（K），结果见表4。根据试验结果， 选择氯仿-甲醇-水-醋酸（4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 0.1，V/V）作为分 离纯化黄芩中总黄酮的HSCCC两相溶剂体系。
表4 黄芩样品在氯仿-甲醇-水-醋酸体系中的分配系数
溶剂体系 （氯仿-甲醇-水-醋酸）
K
4 ∶ 3 ∶ 4 ∶ 0.1
2.14
4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 0.1
2.56
4 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 0.1
26
4 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 0.1
1.49
中药新药与临床药理 2010 年 7 月第 21 卷第 4 期
Total Flavonoids Extraction from Radix Scutellariae and Its Purification by High -speed Counter -current Chromatography LI Yulan，ZHANG Xiaoyan，CHENG Guihong （Shenzhen Xixiang People's Hospital，Shenzhen 518102 Guangdong， China） Abstract: Objective Total flavonoids extraction process from Radix Scutellariae by ethanol reflux was investigated， and high-speed counter-current chromatography（HSCCC）was applied for the separation and purification of flavonoids. Methods The optimal extraction condition for flavonoids was investigated with orthogonal test design，and high-puri－ ty target of flavonoids was obtained by HSCCC. Results The optimal condition of extraction was: extraction with 60 % ethanol for two times，the solvent being 12，10 times as much as the herbal materiall，and extraction time being 2 hours，1 hour. Under the above condition，content of total flavonoids in the crude extract was up to 15.8 %. The ex－ periment of HSCCC was performed with a two-phase solvent system composed of chloroform-methanol-water-acetic acid（4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 0.1，V/V）. When the injection volume of crude extract was 400 mg，45 mg total flavonoids was ob－ tained with a purity of 90.2 %. Conclusion High-purity flavonoids from Radix Scutellariae is obtained after ethanol reflux extraction and purification by HSCCC. Keywords: Radix Scutellariae; Total flavonoids; Extraction processs; High-speed counter-current chromatography
2
15.121 172.266 < 0.01
B（溶 剂 量）
4.909
2
2.454 27.962 < 0.05
C（提取时间）
3.709
2
1.854 21.127 < 0.05
误差
0.176
2
0.088
从正交试验结果及方差分析表来看，各因素对黄 芩中总黄酮提取率的影响程度为A>B>C，均为显著性 差异因素；A3>A2>A1，B1>B2>B3，C1>C2>C3，最佳提 取条件为A3B1C1，即乙醇浓度 （60 %）、溶剂用量（12 倍，10倍），提取时间（2 h，1 h），提取二次为最佳提
取工艺条件。 2.1.2 总黄酮粗提物的制备 取黄芩药材500 g，按最 佳提取工艺条件提取，过滤，合并两次滤液，60 ℃ 减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得黄芩总黄酮粗提物 106 g，得率为21.2 %。 2.1.3 黄芩总黄酮含量测定 参考文献[8]，采用紫外 分光光度法，以黄芩苷为对照品，测定样品中总黄酮 的含量。
测定波长的选择：取黄芩苷对照品溶液，在紫外 分光光度仪上，于200~400 nm波长范围内测定吸收 曲线。结果表明黄芩苷在278 nm波长处有最大吸收， 所以选择278 nm作为总黄酮测定波长。
标准曲线的绘制：取黄芩苷对照品适量，精密称 定，加甲醇制成每1 mL含0.03 mg的溶液，作为对照 品贮备液。分别精密量取对照品贮备液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲 醇稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。于278 nm处测定吸光度，随行空白。以吸光度 （A） 为纵坐 标，对照品浓度（C）为横坐标进行线性回归，其回归 方程为A=57.333C-0.008（r=0.999 6）。
表2 正交试验结果
序号 A（乙醇浓度） B（溶剂量） C（提取时间） 总黄酮含量/%
1
1
1
1
12.2
2
1
2
2
10.3
3
1
3
3
9.3
4
2
1
2
14.6
5
2
2
3
11.9
6
2
3
1
13.8
7
3
1
3
15.4
8
3
2
1
15.3
9
3
3
2
14.4
表3 正交提取工艺总黄酮方差分析
变异来源
偏差平方和 自由度 均方
F
P
A（乙醇浓度） 30.242
黄芩苷对照品（批号：0715-9909），中国药品生 物制品检定所；乙醇为工业纯；氯仿、甲醇、醋酸均 为分析纯。
收稿日期：2010-01-01 作者简介：李玉兰（1976-），女，本科，主管中药师，研究方向：临床药学和药品质量控制与研究。Email: lylszba@ 。 基金项目：深圳市宝安区科技局社会公益科研资助项目（2009431）。