实验一细菌基本检验技术一

• 高压蒸汽灭菌法 • 1.05kg／cm2(15磅/英寸2)，121.3℃保持1530分钟；0.7kg／cm2(10磅/英寸2)，115.6℃ 保持20-30分钟； • 适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭 菌； • 指示菌：菌种采用USP（美国药典）31版和 ISO11138（国际标准组织）指定的嗜热脂肪 芽孢杆菌（ATCC 7953），本菌芽孢对热的 抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中 抗力最强的肉毒杆菌芽孢相似。
• 实验结果： • 注意事项： • 分析讨论： • 思考题： 1、高压蒸汽灭菌效果的生物指示剂监测方法？ 2、杀灭不同微生物的紫外线照射剂量？
3、一间60m2，高3米的房子，应至少安装多少
支30w紫外线灯（在距灯管1米处测定的强度 ＞70w/cm2）？
• 培养基配制的基本程序
• 称量（按一定配方称量各种物质）→溶解→ 测定及调整PH→滤过→分装→灭菌、备用。
四、细菌的接种培养与生长现象观察
实验目的： • 初步掌握细菌接种的无菌操作技术要领； • 学会常用的几种接种细菌的方法； • 学会观察和描述细菌在不同培养基中的生 长情况。
实验材料： • 菌种：金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的24h斜 面培养物 • 培养基：普通琼脂平板、肉膏汤、半固体 培养基及普通琼脂斜面培养基
图6平板分区划线法
图7培养后菌落的分布情况
• 细菌的生长现象观察 1、液体培养基中生长现象观察：培养前的液 体培养基多为清彻透明的。接种细菌后， 由于细菌种类不同，可有以下三种生长形 式。 • 混浊：液体变为混浊。 • 菌膜：液体澄清，表面有一薄膜。 • 沉淀：管底有沉淀物，液体澄清。
2、半固体中生长现象观察： 无鞭毛（无运动）的细菌：经培养后仅沿 穿刺线生长，培养基清亮。 有鞭毛（有运动）的细菌：沿穿刺线向外扩 散，穿刺线摸糊不清，培养基混浊。 3、斜面上生长现象观察：可见有均匀一致的 菌苔，如有不同的菌落或菌苔出现，则表 明污染了杂菌。
• 沾有凡士林或石蜡的器皿，应单独高压灭菌，然后
趁热倒出内容物，将试管等倒立于吸水纸上置
100℃烤箱内半小时，吸出油污，再放入5％碳酸氢
钠水中煮两次，然后用肥皂水洗刷干净，凉干或烤 干备用。
• 染有活菌的吸管应投入3％来苏液内浸泡30分
钟，再用肥皂水洗涤一次，最后用自来水冲洗
干净。
• 染有活菌的玻片，可浸入3％来苏液或清洁液
实验一
细菌基本检验技术一
一、常用消毒灭菌方法介绍
• 消毒与灭菌的方法 加热 物理方法 过滤 照射 化学方法 一）加热法 加热空气灭菌 160℃-170℃ 2小时 适用于玻璃器皿如吸管和 培养皿等的灭菌 2、湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法 煮沸消毒法
• 间歇灭菌法
• 阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌； • 100℃30分钟 室温下18-24小时 100℃30分钟
室温下18-24小时
100℃30分钟；
• 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基 等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间 歇灭菌法。
• 煮沸消毒法
• 煮沸消毒时间为10-15分钟； • 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。
图2 半固体培养基接种方法
3、斜面培养基接种方法：主要用于纯培养和细菌菌 种保存 • 如液体培养基接种法，左手握持菌种管及待接种管。 • 用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取 不许菌苔，退出管后再伸入待接种管，自斜面底部 轻轻向上部蜿蜒划线或自斜面底部轻轻向上部划一 直线，再回到斜面底部向上部蜿蜒划线（勿触破培 养基表面，沾菌的接种环进出试管时不应触及度管 内避）。 • 接种毕，接种环火焰灭菌后放下。两管口迅速通过 火焰2~3次灭菌，先将指掌间棉塞塞入接菌管内， 后将无名指、小指间棉塞塞入菌种管上，将管放回 原处。 • 37℃孵育18~24小时，观察生长情况。
的尖端向前稍微滚动，使将管尖包裹，再将纸条末端折
叠包严吸管尖端，将吸管继续滚动至纸将吸管全部包严。
• 烧瓶：
• 包扎：按瓶口大小，用上述方法制成棉塞 塞入瓶口，再在棉塞外包以厚纸，用纱绳 以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外界细菌 污染。
• 棉签（棉拭）： • 棉签制作：取稍许脱脂棉，做成一定形状 置于左手中指上，用一竹签自前向后卷入
图4平板连续划线法
图5培养后菌落的分布情况
• 分区划线法 • 用接种环取菌做原划线后先在平板1/4 面积处划线，再把平板旋转一定角度，将 接种环在火焰上灭菌，冷却后做第二区划 线，起始每条划线都与第一区划线相交， 相交数次后划线不必再相交接，待第二区 划线完时，灭菌接种环，按上法划第三区、 第四区划线。
图1 液体培养基接种法
2、半固体培养基接种法：只能用接种针接种，主 要用于细菌动力观察，保存菌种
• 左手握持菌种管及待接种管（方法同前）
• 右手持接种针火焰灭菌，挑取少许菌苔，于待接种
培养基中心垂直插入（图2）近管底处，然后转动
接种针原路退出；
• 接种毕，接种针灭菌后放下，分别塞好棉塞。37℃
孵育18~24小时，观察有无细菌生长，细菌有无动 力。
中过夜，取出后水洗。细菌染色之载玻片放入
5％肥皂水中煮沸10分钟，刷洗干净，再清水 冲洗，最后浸入95％酒精中片刻，取出软布擦 干备用。
• 玻璃器皿的包扎和灭菌
• 培养皿（简称平皿）：
• 包扎：培养皿由盖皿和底皿组成，先将盖皿和
底皿套合后，数个（10个或15个或随意性）一
叠用纸包裹或装在金属的平皿框架内。
酸 类 食 醋 碱 类 石灰水 石炭酸 酚 类 来苏尔 醛 类 福尔马林 升 汞 重金属离子 硝酸银 高锰酸钾
过氧化氢
氧化剂 氯 气 漂白粉 去污剂 染 料 金属螯合剂 新洁尔灭 结晶紫 8-羟奎啉硫酸盐
3%
0.2-1ppm l-5% 水稀释20倍 2-4% 0.1-0.2%
清洗伤口
饮用水清洁消毒 洗刷培养基、饮水及粪便消毒 皮肤，不能遇热的器皿消毒 外用紫药水，浅创伤口消毒 外用、清洗消毒
其观察要点如下：
• 大小：以直径（mm）表示之，1mm左右为小菌落，2— 3mm为中等大菌落，3mm以上为大菌落 • 形态：圆形、卵圆形及不规则形 • 颜色：无色、白色、黄色等 • 边缘：整齐或不整齐、锯齿状、毛发状等 • 光滑度：光滑、皱纹等 • 湿润度：湿润、干燥 • 隆起度：扁平、凸起、中心凹陷等 • 透明度：透明、半透明、不透明 • 溶血性：在血平板上产生溶血毒素的细菌，可以使培养 基中的红细胞破坏溶解，可分为完全溶血、草绿色溶血 及不溶血。 • 根据菌落的特点，可分为光滑型（S型）菌落和粗糙型 （R型）菌落。S型菌落为圆型、边缘整齐，表面光滑、 湿润。R型菌落与之相反。
• 二）过滤灭菌 蔡氏(Seitz)过滤器 膜过滤器：多孔纤维素(乙酸纤维素或 硝酸纤维素)，孔径一般为 0.45m/0.22m • 许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热 消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采 用过滤除菌的方法。
• 三）紫外线灭菌（照射）
• 紫外线波长在200-300nm，具有杀菌作用， 其中以265-266nm杀菌力最强； • 照射剂量(J/m2)=照射时间（s）×UVC照射 强度（w/m2）； • 适应于室内空气、物体表面和水及其它液 体的消毒。
四）化学方法
常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表
类 别 实 例 常用浓度 应用范围
醇 类
乙 醇
乳 酸
50-70%
0.33-lmol/L 3-5m1/m3 1-3% 5% 2-5% 40%溶液2-6ml/m3 0.1% 0.1-1% 0.1-3%
皮肤及器械消毒
空气消毒(喷雾或熏蒸) 熏蒸消毒空气，可预防流感病毒 地面消毒 空气消毒(喷雾) 空气消毒、皮肤消毒 接种室、接种箱或厂房熏蒸消毒 植物组织(如根瘤)表面消毒 皮肤消毒 皮肤、水果、茶杯消毒
4、琼脂平板上菌落观察：
• 菌落：一个细菌在固体培养基上，经过一定时间的 生长繁殖之后，所形成的肉眼可见的细菌集团。 • 菌苔：很多菌落连在一起，融成一片。 • 由于细菌种类不同，以及培养基的成分不同，形成 的菌落的特点也不同，可呈现一定的形态、色泽等， 有助于鉴别细菌。因此，应当对菌落进行认真观察。
• 吸管及毛细吸管：
• 包扎：（管口要求塞棉花）以拇、食指持一端拉直的回 形针，并以食指夹取少许棉花（根据吸管孔径大小确定
棉花多少），轻轻从管口端塞入1.5～2cm，抽出回形针。
塞入的棉花松紧必须适中，过松时使用中棉花容易脱落， 过紧时吹吸时流速太慢，管口露出的棉花纤维可在酒精 灯火焰上烧去。管口塞好棉花后将吸管尖斜置于一条约 4×40cm左右的纸条上，离终端4cm，将纸条包住吸管
图3 斜面培养基接种法
4、琼脂平板接种方法：只能用接种环接种 • 连续划线法 • 右手持接种环在火焰上灭菌待冷（约2~5秒钟）取稍许 菌种。 • 左手抓握平板培养基，微开皿盖，接种环与培养基表面 成45度角，在平板一侧边缘反复来回划线（此称原划
线），然后运用腕力向两侧作“Z”形划线，划线向下
延伸，直至划完整个平板（注意划线不能接触平皿边缘， 要匀直，不划烂培养基，要充分利用平板）
• 灭菌：160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽灭菌15
磅/寸2灭菌20分钟，再置烤箱内烤干备用。
• 试管：
• 包扎：培养用的试管，其管口必须用棉塞塞紧。 • 棉塞制作法：取大小合适的棉花块（视管口口 径大小而定），松松地卷成圆筒，将两端毛边 略向内折入，再逢腰折转，在折端套一大小合 适的纱布块，塞入试管口内，纱布的散端可用 线扎紧，剪去须尾。 • 棉塞的要求： ①、要有适当的长度，2/3塞入试管内，1/3露于 管口外； ②、大小适宜，应手持棉塞外露部分时试管不掉 离棉塞，同时又能轻轻拔出（过松达不到滤菌 的目的，过紧妨碍空气流通）；
• 以右手无名指与小指拔取菌种管棉塞，再用手掌 与小指拔取待接种管，随后将两管管口迅速通过 火焰灭菌。 • 用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑 取不许菌苔，退出管后再伸入肉汤管中，在接近 液面与管壁处轻轻研磨（图1）并沾取少许肉汤调 和，使菌混于肉汤中。 • 接种毕，接种环灭菌后放下。分别塞好棉塞，立 于试管架上，37℃孵育18~24小时，观察生长情况。