双萤光素酶报告基因技术71页PPT
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT课件
使用高质量的抗体和试剂， 确保实验结果的可靠性。
对实验结果进行统计分析， 避免主观偏见和误差。
严格控制实验条件，包括 温度、pH值、时间等， 确保实验的一致性和可重 复性。
实验优化建议
优化抗体与染色质的比例，提高特异性 结合的效率。
对实验结果进行多重验证，包括重复实 验和对照实验，以确保结果的可靠性。
技术发展历程
01
初始阶段
荧光素酶报告基因技术的出现和应用，为研究基因转录提供了有力工具。
02
发展阶段
染色质免疫共沉淀技术的不断完善和应用，为研究基因转录调控提供了
更准确的方法。
03
结合阶段
将荧光素酶报告基因技术与染色质免疫共沉淀技术相结合，形成双荧光
素酶染色质免疫共沉淀技术，为研究基因转录调控提供了更高效、准确
荧光素酶活性检测
荧光素酶活性检测方法
可以使用荧光素酶活性检测试剂盒或PCR仪等方法，对荧光素酶标记的DNA片 段进行检测。
结果分析
根据荧光素酶活性检测结果，可以得出目的基因的表达情况，并进行相关的数 据分析。
03
双荧光素酶染色质免疫共沉淀 实验结果分析
荧光素酶活性检测结果解读
荧光素酶活性检测是双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的重要环节，通过检测荧光 素酶的活性，可以评估实验中荧光素酶的表达情况。
详细描述
miRNA是一类非编码RNA，通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平调控基因表达。 在案例二中，研究人员利用双荧光素酶染色质免疫共沉淀技术，发现miRNA与靶基 因在转录水平上的相互作用，进一步揭示了miRNA对靶基因的调控机制。
案例三：表观遗传学研究中的应用
总结词
双荧光素酶报告基因分析
双荧光素酶报告基因分析转载请注明来自丁香园发布日期：2010-04-08 10:59 文章来源：北京原平皓生物技术有限公司关键词：双荧光素酶基因表达报告基因检测1. 介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。
荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。
Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。
通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。
实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。
实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。
萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。
由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。
双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DM EM，F12等。
这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。
具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas™微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas™软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。
Veritas™微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1 X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo®试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。
所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。
双荧光素酶报告基因实验
双荧光素酶报告基因实验双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因的表达情况和调控机制。
该实验利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其荧光强度来反映目标基因的表达水平。
以下是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤及注意事项。
实验步骤：1. 转染细胞，首先，将目标基因的启动子区域和报告基因的编码区域克隆到适当的表达载体中，然后将该表达载体转染至目标细胞中。
2. 处理细胞，在转染后的细胞中，根据实验设计的需要，可以给予不同的处理，如药物处理、基因敲除等。
3. 提取蛋白，收集处理后的细胞，进行蛋白提取，并测定蛋白的浓度。
4. 测定荧光强度，将提取的蛋白加入相应的底物，利用荧光分光光度计测定双荧光素酶的荧光强度。
5. 数据分析，根据测定的荧光强度数据，分析目标基因的表达水平及其受到处理的影响。
注意事项：1. 转染条件的优化，不同细胞对转染条件的要求不同，需要进行转染条件的优化实验，以确保转染效率和细胞存活率。
2. 底物的选择，选择适合双荧光素酶的底物，并根据实验需要选择合适的检测波长。
3. 控制实验的设计，在实验中应设置适当的对照组，以确保实验结果的可靠性和准确性。
4. 数据的统计分析，对实验数据进行统计分析，包括均值、标准差等指标的计算，以确保实验结果的可靠性。
总结：双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学实验方法，可以用于研究基因的表达调控机制。
在进行该实验时，需要严格控制实验步骤，注意实验细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文提供的实验步骤和注意事项对您进行双荧光素酶报告基因实验有所帮助。
双萤光素酶报告基因技术
•背景可能高 •折叠 “情形” 可导致信号差别
萤光素酶报告基因的主要优点
• 非放射性 • 检测快（比CAT等） • 灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍） • 半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶
分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰 期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）
荧光 - Fluorescence
Fire
萤光 - Luminescence
Worm
萤光 （Bioluminescence）
荧光 （Fluorescence）
是化学发光（Chemilumi- nescence） 吸收来自光源的光，再发射
的一种，激发能量来自化学反应
另一光子
萤光发光计（Luminometer）
• 辅助报告基因的相对萤光单位 (RLU) • 启动子交叉交谈或互相干扰 • 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节
载体 - 海肾萤光素酶报告基因载体
第二代
phRL-null phRL-TK phRL-TK (int-) phRL-SV40 phRL-CMV phRG-B phRG-TK
第一代
pRL-null pRL-TK
荧光计（Fluorometer）
液闪仪（Scintilation Counter）
电荷耦合装置光学成像系统 （CCD opitical imaging system）
荧光显微镜
各种报告基因的优点和缺点
报告基因
优点
缺点
萤光素酶 ß-gal
•优越的灵敏度 –高信号值 –无内源活性
•灵敏度好
GUS（葡糖醛酸糖 •灵敏度好
双荧光素酶报告基因ppt课件
3
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2. 用途：
①基因转录调节的研究：最初的功能。 ②作为分子标记的应用：如利用 GFP 作为标记物检
测基因在植物 酵母和哺乳动物细胞中的转移。 ③生物大分子之间的相互作用：激活剂或拮抗剂在
改变活细胞中受体活性作用等方面的研究。 ④其他方面的应用：RNA 干扰研究、影像技术及药
注意事项：
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与
质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清
的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适
转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
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报告基因活性的检测：
商业的试剂盒 报告基因发光检测仪
注意事项： 内参的一致性。
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二、载体
定义：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩 增和表达的一类DNA分子。
特性： 1 复制起点 (ori) 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 3 筛选标志 Amp+ Kan+ Neo+ 4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低 5 表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、
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酶切注意事项（最好双酶切） 1. 酶的保存：低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，
避免反复冻融。 2. 酶切反应体系：酶量不能超过反应体积的1/10。 3. 反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供。 4. DNA样品要求：一定纯度和浓度，不能混有酚、氯
仿、 EDTA、 SDS、 过多盐类等。 5. 温度和时间：通常37℃ 1-2h 6. 反应终止：EDTA 、SDS 、加热 、直接放入 -20℃ 7. 操作要求：无菌新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。 8. 电泳鉴定酶切是否完全 。
双荧光素酶报告
双荧光素酶报告双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统是一种常用的生物荧光检测技术，用于研究基因表达调控、信号转导通路和药物筛选等领域。
该系统利用荧光素酶（Firefly Luciferase）和甲氧基荧光素酶（Renilla Luciferase）作为报告基因，通过检测这两种荧光素酶的活性来分析靶基因的表达水平及其调控机制。
在双荧光素酶报告系统中，Firefly Luciferase和Renilla Luciferase分别作为实验基因和内参基因，通过对这两种荧光素酶的活性进行连续检测，可以准确、快速地分析靶基因的转录水平及其受到的调控。
Firefly Luciferase作为实验基因，其活性的变化反映了靶基因的表达水平；而Renilla Luciferase作为内参基因，其活性的稳定性则可以用来校正实验误差，保证实验结果的准确性和可靠性。
双荧光素酶报告系统的应用非常广泛，既可以用于体外细胞实验，也可以应用于体内动物实验。
在基因表达调控研究中，研究人员常常利用该技术来分析转录因子的激活或抑制效应，探究信号通路的调控机制；在药物筛选领域，双荧光素酶报告系统也被广泛应用于筛选潜在的药物靶点和药效物质。
双荧光素酶报告系统的优势在于其高灵敏度、高稳定性和高通量性，能够满足科研工作者对于快速、准确、高通量的生物荧光检测需求。
同时，该技术操作简便，不需要昂贵的仪器设备，适用于各类实验室的科研人员进行基因表达调控和药物筛选研究。
总之，双荧光素酶报告系统作为一种重要的生物荧光检测技术，为科研工作者提供了一个强大的工具，能够帮助他们深入研究基因表达调控和药物筛选等领域，推动生命科学领域的发展和进步。
相信随着该技术的不断完善和应用，将会为科研工作者带来更多的惊喜和突破，为人类健康和生命科学研究做出更大的贡献。
双荧光素酶报告
双荧光素酶报告引言。
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告是一种常用的生物化学技术，用于研究基因表达调控、信号转导和蛋白质相互作用等生物学过程。
该技术利用荧光素酶和荧光素酶作为报告基因，通过检测其荧光信号的强度来研究基因表达水平和转录因子活性。
双荧光素酶报告技术具有高灵敏度、高通量和高精度的特点，被广泛应用于生物医学研究、药物筛选和基因治疗等领域。
一、双荧光素酶报告的基本原理。
双荧光素酶报告技术是基于荧光素酶和荧光素酶的反应原理。
荧光素酶（Firefly luciferase）是一种生物发光蛋白，它能够氧化荧光素底物产生强烈的荧光信号。
荧光素酶（Renilla luciferase）是另一种生物发光蛋白，它也能够氧化荧光素底物产生荧光信号，但其光谱特性与荧光素酶不同。
利用这两种生物发光蛋白的不同特性，可以同时检测两种基因表达水平或蛋白质相互作用的活性。
二、双荧光素酶报告的实验步骤。
1. 克隆报告基因，首先需要将荧光素酶和荧光素酶的基因分别克隆到适当的表达载体中，以便在细胞中进行表达。
2. 转染细胞，将表达荧光素酶和荧光素酶的载体转染到目标细胞中，使其表达报告基因。
3. 应用底物，添加荧光素底物到转染的细胞中，观察荧光信号的强度。
4. 测量荧光信号，利用荧光素酶检测系统测量荧光信号的强度，得到荧光素酶和荧光素酶的活性。
三、双荧光素酶报告的应用。
1. 研究基因表达调控，双荧光素酶报告技术可以用于研究转录因子对基因表达的调控机制，从而揭示基因调控网络的结构和功能。
2. 研究信号转导通路，双荧光素酶报告技术可以用于研究细胞信号转导通路的活性和调控机制，从而揭示细胞内信号传递的分子机制。
3. 药物筛选，双荧光素酶报告技术可以用于筛选药物对基因表达和信号转导的影响，从而寻找潜在的药物靶点和药物候选物。
4. 基因治疗，双荧光素酶报告技术可以用于评估基因治疗载体的转染效率和基因表达水平，从而优化基因治疗的疗效和安全性。
双荧光素酶报告
双荧光素酶报告：揭秘生命的光与色人类对于光与色的追求始终不曾停止。
从古至今，探究光的秘密一直是科学家们津津乐道的研究课题之一。
而在现代生命科学领域，技术则为我们提供了一扇窥探生命机制的大门。
在这篇文章中，我们将一同探究技术的原理、应用和发展前景。
首先，让我们来了解一下技术的基本原理。
技术是通过双荧光素酶（dual-luciferase）系统来检测和表达基因的活性。
该系统中包含了两种不同的荧光素酶：荧光素酶（firefly luciferase）和Renilla荧光素酶（Renilla luciferase）。
通过将这两种荧光素酶与感兴趣的基因进行融合，我们可以通过测量其荧光素酶活性来推断基因的表达情况。
这种技术具有高灵敏度、高专一性和实时性等特点，使得它成为了研究基因调控、信号通路和蛋白相互作用等生命科学领域的重要工具。
接下来，让我们看看技术在生命科学研究中的应用。
首先，技术常被用于研究基因调控机制。
通过将荧光素酶与感兴趣的启动子或转录因子结合，我们可以测量其活性从而了解基因的表达水平以及相关调控因子的作用机制。
其次，技术也被用于研究细胞信号通路。
通过将荧光素酶与信号通路中的关键分子进行融合，我们可以实时监测信号通路的活性，从而揭示细胞内复杂的信号传递网络。
此外，技术还可以应用于研究蛋白质相互作用、药物筛选和基因治疗等领域。
随着生命科学研究的不断发展，技术也在不断推陈出新。
一些研究人员将其与其他技术相结合，发展出了更加高效、精确的测量方法。
比如，一种名为“双底物酶抗体探针”的新型技术利用了底物与荧光素酶抗体的结合来检测和定量荧光素酶的活性。
这种新技术不仅提高了测量的灵敏度，还可以通过调整底物类型来实现多目标的检测。
另外，还有一些科学家致力于开发新型的荧光素酶，以扩大技术的应用范围。
他们通过对已知荧光素酶结构的改造和改进，成功合成了一系列具有不同特性的新型荧光素酶，如可逆荧光素酶和多色荧光素酶。
这些新型荧光素酶在提高测量效率的同时，还为研究人员提供了更多的选择和可能性。
双荧光素酶报告基因
• 1 对数期细菌置于冷Cacl2、Mgcl2中，制备 感受态
• 2 加入重组质粒，冰浴30分钟，不要震荡
• 3 42℃水浴60~90S，热休克
• 4 马上冰浴
第十七页，共22页。
第七节 筛
抗药性筛选(shāixuǎn)：ampr tetr kanr 插入表达筛选(shāixuǎn): 蓝白斑筛选(shāixuǎn)： 测序 菌落或噬菌斑杂交筛选(shāixuǎn) 酶切鉴定：插入否？插入方向？
和表达的一类DNA分子。 特性： 1 复制(fùzhì)起点 (ori) 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 3 筛选标志 Amp+ Kan+ Neo+ 4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低 5 表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、
信号肽、核定位序列等
第十二页，共22页。
载体(zàitǐ)的分类
注意事项： 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与 质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清 的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适 转染条件对于效率的提高(tí gāo)有巨大的作用。
第二十页，共22页。
报告基因活性的检测： 商业(shāngyè)的试剂盒 报告基因发光检测仪
第十八页，共22页。
转染 ：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗 传标志的过程 。 若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称“瞬 时转染(transient transfection)”； 若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制(fùzhì)而复 制(fùzhì)称“稳定转染(stable transfection)”。
第十五页，共22页。
连接-定向克隆（最常用(chánɡ yònɡ)）
双荧光素酶系统实验操作步骤及方法_.ppt
[串点成面·握全局]
一、近代交通业发展的原因、特点及影响 1．原因 (1)先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促 进中国社会发展。 (2)列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压 中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。 (3)工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供 了物质条件。
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历史ⅱ岳麓版第13课交通与通讯 的变化资料
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[自读教材·填要点]
一、铁路，更多的铁路 1．地位 铁路是 交通建运设输的重点，便于国计民生，成为国民经济 发展的动脉。 2．出现 1881年，中国自建的第一条铁路——唐山 至开胥平各庄铁 路建成通车。 1888年，宫廷专用铁路落成。
出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事
业是
()
A．电报业
B．大众报业
C．铁路交通业 D．轮船航运业
[解析] 材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。
[答案] A
[题组冲关]
3．假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因fireflyluciferase的上游luc启动子细胞内目的基因的转录被激活未处理对照刺激物处理启动子luc转染细胞启动子luc的启动子被激活luc的转录luc表达量测得的荧光值同时为了减少内在的变化因素如
(2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪30年代情况才发生变 化。
3．交通通讯变化的影响 (1)新式交通促进了经济发展，改变了人们的通讯手段和 ，出行 方式转变了人们的思想观念。
(2)交通近代化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便 捷。
双萤光素酶报告基因技术PPT71页
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
双萤光素酶报告基因技 术
6、纪律是自由的第一条件。——黑格 尔 7、纪律是集体的面貌，集体的声音， 集体的 动作， 集体的 表情， 集体的 信念。 ——马 卡连柯
8、我们现在必须完全保持党的纪律， 否则一 切都会 陷入污 泥中。 ——马 克思 9、学校没有纪律便如磨坊没有水。— —夸美 纽斯
10、一个人应该：而 有原则 ，热情 而不冲 动，乐 观而不 盲目。 ——马 克思
双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）一、实验目的：分析启动子活性二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter AssaySystem（Promega）试剂盒来检测。
利用单通道多标记荧光检测仪测定荧光素酶活性。
在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被同时转染入细胞内作为内参。
三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega）试剂盒，PBS，细胞裂解液，96孔，四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪五、实验方法及步骤：1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。
每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。
实验结果均为3次独立的实验结果的平均值。
所有的结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。
六、注意事项1.做好对照。
2.多做几个复孔，求平均值。
七、补充知识点双荧光素酶报告基因实验1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega E2920）组成如下：? Dual-Glo?萤光素酶缓冲液Dual-Glo?萤光素酶底物（冻干粉）Dual-Glo?Stop-Glo?缓冲液Dual-Glo?Stop-Glo?底物2.报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或“效果”3.原理–制备含有luc/ R luc的DNA–转染–提供刺激–测量荧光–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)4.载体- 萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter海肾萤光素酶报告基因载体pRL-TK5.试剂制备–将Dual-Glo? 萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo? 萤光素酶底物中，Dual-Glo? 萤光素酶试剂，分装后-70℃保存，避免反复冻融–用Dual-Glo? S top &Glo? 缓冲液按1:100 稀释Dual-Glo? Stop &Glo? 底物（现用现配）–所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于–20°C两步加入试剂：加，读，加，读6.检测步骤：实验前，将Dual-Glo? 萤光素酶试剂平衡到室温1.确认使用的细胞板可以用于荧光检测2.测萤火虫荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的Dual-Glo? 萤光素酶试剂，混匀。
双荧光素酶报告基因
或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。
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一、目的基因的获取
1. 直接从染色体DNA中分离 2. 通过mRNA反的基因 5. PCR扩增目的基因 6. 人工体外合成基因片段
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④其他方面的应用：RNA 干扰研究、影像技术及药 物筛选等。
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3. 实验技术： 基因克隆 转染细胞 产物检测
基因克隆的特点和技术路线
• 特点：分子水平上操作，细胞水平上表达 • 技术路线：
1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆，大量扩增
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பைடு நூலகம்
克隆扩增或表达 √ √√
举例 PBR322 PCDN3
PUC8 PBUDCE41 YE
pGEX-4T M13 pAdV5
(1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC 13
常用的报告基因载体类型： 1）basic 载体：不含 P/E,用于检测启动 子活性。 2）control载体：含启动子，用于检测增 强子或沉默子的活性。
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二、载体
定义：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩 增和表达的一类DNA分子。
特性： 1 复制起点 (ori) 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 3 筛选标志 Amp+ Kan+ Neo+ 4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低 5 表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、
受态
双荧光素酶报告基因检测
双荧光素酶报告基因检测双荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它利用双荧光素酶作为报告基因，通过检测其表达水平来研究目标基因的调控机制、信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
本文将介绍双荧光素酶报告基因检测的原理、应用及其在科研和临床中的意义。
双荧光素酶报告基因检测的原理是利用双荧光素酶基因（Luciferase）和绿色荧光蛋白基因（GFP）等作为报告基因，将其与目标基因的启动子或调控元件相连，构建成表达载体，转染到细胞中。
当目标基因的启动子或调控元件被激活时，报告基因也会被激活，从而产生荧光素酶或绿色荧光蛋白，可以通过荧光素酶活性检测或荧光显微镜观察来检测目标基因的表达水平和细胞定位。
双荧光素酶报告基因检测在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因的调控机制。
通过构建不同长度或突变的启动子或调控元件，可以研究基因的启动子活性、转录因子结合位点以及信号通路的调控机制。
其次，它可以用于筛选药物或研究药物的作用机制。
通过将报告基因与目标基因共转染到细胞中，可以研究药物对目标基因表达的影响，从而筛选出具有特定生物学活性的化合物。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于研究基因的表达模式、细胞信号转导通路以及疾病发生发展的相关机制。
在临床诊断中，双荧光素酶报告基因检测也有着重要的意义。
例如，在肿瘤诊断中，可以利用双荧光素酶报告基因检测来研究肿瘤相关基因的表达水平，从而为肿瘤的分子诊断和靶向治疗提供依据。
此外，双荧光素酶报告基因检测还可以用于检测病毒感染、细胞凋亡、细胞增殖等生物学过程，为临床诊断和治疗提供重要参考。
总之，双荧光素酶报告基因检测作为一种重要的生物学检测技术，在科研和临床中有着广泛的应用前景。
它不仅可以帮助科研人员深入研究基因调控机制和疾病发生发展的相关机制，还可以为临床诊断和治疗提供重要的实验依据。
相信随着技术的不断进步和完善，双荧光素酶报告基因检测将在生物学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
双荧光素酶报告基因
克隆扩增或表达 √ √√
举例 PBR322 PCDN3
PUC8 PBUDCE41 YE
pGEX-4T M13 pAdV5
(1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC 13
常用的报告基因载体类型： 1）basic 载体：不含 P/E,用于检测启动 子活性。 2）control载体：含启动子，用于检测增 强子或沉默子的活性。
信号肽、核定位序列等
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载体的分类
分类依据 1.按功能分成
类
别
（1）克隆载体 （2）表达载体
2.按进入受体细胞类 型分
（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
3.按载体来源分
质粒载体 噬菌体载体 病毒载体
4.按克隆片段得大小 （克隆能力）分
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(1)<1kb (2)<10kb (3)<22kb (4)<50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb
报告基因分析
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1. 基本概念和实验原理 报告基因: 编码可供检测的酶与蛋白质的基 因。是现代分子生物学研究领域中用于分 析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启 动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子 相互作用关系的一种重要工具。
可作为报告基因的条件: ① 编码产物的活性不受宿主细胞的干预。 ②编码产物在宿主细胞中不存在, 易于区别。 ③编码产物的活性的测定必须具有快速、简便、 灵敏度高、重复性好的特点。 常用的报告基因：氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、
2021/10/10
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连接-定向克隆（最常用）
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60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
双萤光素酶报告基因技术
21、静念园林好，人间良可辞。 22、步步寻往迹，有处特依依。 23、望云惭高鸟，临木愧游鱼。 24、结庐在人境，而无车马喧；问君 何能尔 ？心远 地自偏 。 25、人生归有道，衣食固其端。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿