外周血细胞分离的方法有几种
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离
概述
外周血单个核细胞是一种白细胞。
通过分离单个核细胞，可以进行多种分子生物学实验和临床应用。
本文将介绍两种分离外周血单个核细胞的方法。
方法
密度梯度离心
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.将 3 毫升 Ficoll-Paque™ PLUS 加入到 15 毫升离心管中。
3.轻轻加入同等体积的外周血到离心管，保持液面平整。
4.以 400g 的速度离心 40 分钟。
在离心温度达到室温前离心室门不得
打开。
5.用温和的力度将上清液吸出到新的离心管中，并在 1200g 的速度下
洗涤 2-3 次。
6.已经分离的单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程中加入生长
培养基以维持细胞质稳定。
磁性负选择法
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.加入红细胞淋巴细胞分离液，根据厂家指南染色。
3.加入磁性微珠混合液，使单个核细胞与微珠组合。
4.放入磁场中过滤掉未与微珠组合的细胞及其他血细胞。
5.经过多次洗涤和离心，单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程
中加入生长培养基以维持细胞质稳定。
密度梯度离心法和磁性负选择法是分离外周血单个核细胞的两种有效方法。
这些方法对于多种分子生物学实验和临床应用都非常有用。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告一、实验目的本实验旨在通过外周血单个核细胞分离实验，掌握外周血单个核细胞的分离方法及相关技术。
二、实验原理外周血单个核细胞分离是利用密度梯度离心法，将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来。
具体步骤如下：1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
由于不同种类细胞密度不同，在经过密度梯度离心后会形成不同层次的沉淀物。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
三、实验步骤1. 取外周血3ml，加入等体积的PBS缓冲液中，轻轻混合后放入无菌离心管中。
2. 将无菌离心管放入冰箱中静置30min。
3. 从冰箱取出后，将上清液吸取出来丢弃。
留下沉淀物。
4. 加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合后放入无菌离心管中。
5. 将无菌离心管放入密度梯度离心管中进行离心。
离心条件为2000rpm，20min。
6. 取出沉淀物最上层液体，即为单个核细胞。
四、实验结果经过实验操作后，得到了外周血单个核细胞。
观察镜下可见细胞形态完整、染色质均匀分布、核仁清晰。
五、实验注意事项1. 实验前应认真阅读操作步骤和注意事项，并做好充分准备工作。
2. 操作过程中应保持无菌操作环境，并使用消毒好的器材和试剂。
3. 离心时应注意转速和时间的控制，以避免对细胞造成不必要的损伤。
4. 实验结束后应及时清理实验台和器材，并妥善处理实验废弃物。
六、实验总结本实验通过密度梯度离心法，成功地将外周血中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞分离出来，得到了单个核细胞。
在操作过程中，需要注意无菌操作环境和离心条件的控制。
通过本次实验，我们掌握了外周血单个核细胞的分离方法及相关技术，为后续的研究提供了基础。
人外周血NK细胞3种纯化方法的比较
人外周血N K细胞3种纯化方法的比较张彩 田志刚 王郡甫 刘金生 张建华 许晓群 孙江内 N K细胞是机体抵抗肿瘤生长和病毒感染的重要的免疫监视细胞。
近年来,关于N K细胞本质及其功能和机制的研究已成为免疫学研究的热点内容之一。
但国内N K细胞的研究大多是检测N K细胞毒活性和N K细胞数量,很少直接观察N K细胞的特征及其功能特点,N K细胞分离纯化,是进行N K细胞基础与临床研究的基础和基本手段。
我们分别采用Percoll不连续密度梯度离心法、单抗铺皿法(Panning)及补体依赖的细胞毒法对人外周血N K细胞进行了初步分离纯化,现将结果报告如下。
材料与方法外周血非粘附单个核细胞的制备:用淋巴细胞分离液常规分离单个核细胞,经塑料粘附和尼龙毛柱去除B细胞和单核巨噬细胞,即为以T细胞和N K细胞为主的细胞群。
Percoll不连续密度梯度离心法分离人NK细胞〔1,2〕:先用10×PBS将Percoll原液渗透压调至285mOs/kg H2O(1mOs/kg H2O=1mmol/L),用p H 712的PBS将Percoll配成3715%～50%6个梯度或4215%～6617%7个梯度,每梯度相差215%。
将上述Percoll液按密度由高至低依此缓缓加于20ml分血管,将尼龙毛非粘附细胞轻轻铺于上层。
1800～2000r/min离心30～40min,吸取各梯度细胞计数,并用流式细胞仪鉴定CD3、CD56细胞表型。
单抗铺皿(P anning)法:无菌平皿用羊抗小鼠Ig G011mg/ml包被8h以上或过夜,用PBS/NCS 洗3次后,加入用CD3、CD4、CD8单抗标记的细胞悬液,室温或4℃平放40min,轻悬,使细胞重新分布,再放置40min。
分别收集非粘附细胞和粘附细胞,流式细胞仪检测CD56+N K细胞所占比例。
补体依赖的细胞毒(CCDC)法:CD3、CD4、CD8单抗标记的细胞悬液用PBS洗3次,加新鲜正常兔基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870729)作者单位:山东省医学科学院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心通信作者:田志刚,250062(E2mail:TZG@)血清(1∶2稀释)100μl,37℃孵育1h,用淋巴细胞分离液分离活细胞,流式细胞仪检测CD56+N K细胞所占比例。
人外周血B、T淋巴细胞的分离方法介绍
人外周血B、T淋巴细胞的分离方法介绍
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。
水平离心2000rpm×20分钟。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。
中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。
计数200个淋巴细胞。
计算出活细胞百分率。
分离外周血单个核细胞的常用方法
分离外周血单个核细胞的常用方法
1 单个核细胞分离
单个核细胞是指人类外周血中的唯一细胞，在医疗和科学研究中有着重要的意义，因此，研究者需要以有效而可行的方式从其他细胞中单独分离出单个核细胞。
2 流式细胞术
流式细胞术是一种可用于快速识别和分离特定细胞类型的工具，是比较常见的单个核细胞分离方法。
它需要一种特殊的支架，可用来将原始血液的细胞在特定底物上悬浮，并將核细胞从其他细胞中区分出来，血液细胞由这种支架移动。
支架接受射流时，可引导其中的细胞以不同的方向流动，以便对它们进行特定的筛选分类。
最后，在特定的位置，需要的细胞可以独立收集，以便进行实验分析。
3 反应性空气层析
反应性空气层析是一种新兴的单个核细胞分离方法，使用反应性气体将血液中的细胞推向表面，然后由计算机识别特定的细胞类型，并将符合要求的细胞以单个状态分离出来。
它可以分离出仍保存临床意义的活性细胞，具有更大的整体分类准确度，还可以用来检测感染细胞和其他癌症标记物。
4 磁性粒子分离
磁性粒子分离是另外一种单个核细胞的分类方法。
它是通过一种
叫做磁性粒子的高度猝灭的物质，将其他类型的血细胞从外周血中分
离出来，以留下核细胞。
它可以用于血液细胞中比较罕见的细胞类型，因为它具有较高的敏感度。
总而言之，流式细胞术、反应性空气层析和磁性粒子分离是分离
人类外周血中单个核细胞的常用方法。
上述方法都可以实现较高的分
离精度，为后续进行系统研究奠定基础。
外周血单个核细胞分离方法探讨
对外周血单个核细胞分离方法探讨韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚 2004-7-24 17:06:00 中华现代临床医学杂志 2003年11月第1卷第9期【摘要】目的探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。
方法取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer，CIK）培养。
结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll 密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86.4%、86.0%、85.1%。
结论羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。
关键词羟乙基淀粉淋巴细胞分离液单核细胞Study on the methods of separating peripheral blood mononuclear cellsHanYaping，Liu Yuan，Zhang Lili，et al.Deparment of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of Nanjing M edical University，Nanjing210029.【Abstract】 Objective To investigate the difference among three protocols o f isolating peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）through observing the re covery rate，t he adherent ability and lymphocytes proliferation acˉtivity of t he isolated PBMCs.Methods Use three different isolation protocols，HES（hydrixy ethylstarch）sedimentation method，HES centrifugation method and Ficoll density gradient centrifugation，to isolate PBMCs from healthy donors.Then compare these isolation protocols through observing the recovery rate of PBMCs，the number of plastic-adherent cells and the cytokine-induced killer cells proliferation.Resul ts The recovery rate of PBMCs is86.4%by HES sedimentation method，83.7%by HES c entrifugation and sedimentation method and85.1%by Ficoll density gradient centr ifugation［method］ separately.Conclusion Our observation provide evidence that HEScentrifugation method could efficiently isolate PBMCs from human peripheral blood.Key words hetastarch ficoll monocyte外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。
实验一外周血淋巴细胞的分离
Enzyme-linked immunoabsobant assays
融合剂
• PEG： • 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质
双分子层不稳定，引起细胞融合。 • 分子量：1500-2000
HAT选择性培养
HAT: 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基碟呤（aminopterin，A） 胸腺嘧啶（thymidine, T）
细胞的DNA生物合成有两条途径：
• 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 • 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。
实验四
B淋巴细胞杂交
杂交瘤的目的 --- 制备单克隆抗体
杂交瘤技术的基本原理
具有分泌抗体功能的B细胞难以在体外长期存活。 利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能 长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养 获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞. （Hybridoma）
• 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从 脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合 成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能 在HAT选择培养液中生存下来。
实验步骤：免疫脾细胞的制备
处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置 于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的 平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬 液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓瘤 细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清 •骨髓瘤细胞:脾细胞为1:10 •一个脾脏可获约108个细胞
外周血的NK细胞分离培养
外周血的NK细胞分离培养1.样本采集常规操作采集患者外周血，避免样本污染。
2.细胞分离超净工作台中，分装血样于50mL离心管中，取全血样1mL计数（3mL全血留样）。
2000rpm离心10min，取上层血浆于50mL离心管（未灭活血浆留样）。
56℃灭活30min，3000rpm离心10min，去沉淀后4℃保存上清。
生理盐水1:1稀释混匀血细胞，缓慢加到装有Ficill的离心管内（界面清晰，血样：Ficoll不超过2:1），1600rpm离心20min。
吸弃上清，吸取白膜层到离心管，加生理盐水至45mL，混匀后1500rpm离心10min。
吸弃上清，生理盐水重悬后合并一管，加生理盐水至45mL。
混匀，取样计数计算细胞总量，1800rpm离心10min。
参照试剂盒说明书配置培养液、滋养细胞液。
3.细胞培养（山东齐鲁细胞治疗NK细胞培养试剂盒）0d，T75培养瓶接种：30mL细胞悬液+NK-1试剂[2]+5%自体血浆，37℃，%CO2培养箱培养。
（接种密度）3d，离心换液：T75培养瓶中细胞转移至50ml离心管1600 rpm/min升6降4离心10min去除上清。
细胞沉淀+NK细胞培养液（30mL）+5%自体血浆于新T75培养瓶。
5d，转移到T175培养瓶，细胞状态好，加培养液到50mL（5%自体血浆）。
6d，观察细胞，细胞状态好，加培养液到120mL（5%自体血浆）。
7d，观察细胞长势，装袋并添加1支NK-2试剂[2]，加培养液到220mL（1%自体血浆），菌检。
8d，加培养液到500mL（1%自体血浆）。
9d，加培养液到1000mL（1%自体血浆）。
10d，加培养液到1400mL（1%自体血浆）。
11d，加培养液到1600mL（1%自体血浆）。
12d，加培养液到1800mL（1%自体血浆）。
13/15d，根据细胞长势及临床安排收获细胞。
计数计活及流式检测。
[1]:NK细胞培养液：1支D试剂、1支E试剂溶解到1瓶C试剂中。
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离1. 抗凝血预离心分别取正常人新鲜抗凝全血A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，取得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。
2. 沉淀细胞稀释和离心分离在所获取沉淀A 中细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。
B: 无菌抗凝血和Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。
另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重合于分层液上。
此时稀释后细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。
和用水平离心机以r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。
管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄白膜层，关键台单个核细胞，还混杂有少许血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄白膜3. 单个核细胞提取、洗涤和悬浮、贴壁吸去最上层血浆，搜集血浆层和淋巴细胞分离液交界面单个核细胞，尽可能全部吸出PBMC。
加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超出离心管2／3。
混匀后离心1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存血小板，去上清液。
注意：还能够先用吸管把雾状层上面液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要部分慢慢吸出来。
第二种方法，比较简单部分。
再用一样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留淋巴细胞分离液。
再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充足去除血小板等杂质。
按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepasRPMI-1640液3～4 mL) 重新混悬细胞37℃、5% CO2孵育箱中培养2 ～3 h后去除上清，得到贴壁单核细胞。
外周血细胞分离
外周血细胞分离
外周血细胞分离是一种将外周血中的各种类型细胞分离出来的技术。
这种技术可以用于许多研究领域，如免疫学、癌症研究、药物研发等。
常用的外周血细胞分离方法包括密度梯度离心、磁珠分选、细胞排序等。
密度梯度离心是将外周血样本加入一层密度梯度液，通过离心将不同密度的细胞分离出来。
磁珠分选则是利用磁珠表面特异性抗体对外周血细胞进行特异性分离。
细胞排序则是利用流式细胞术将细胞按照特定标记分离出来。
外周血细胞分离技术的应用广泛，例如在肿瘤免疫治疗中，可以利用该技术将患者外周血中的免疫细胞进行分离、扩增和激活，再注射回患者体内以增强其免疫反应。
此外，在药物筛选方面，外周血细胞分离技术也可用于评估药物对不同类型细胞的作用效果。
- 1 -。
外周血巨噬细胞提取的方法
外周血巨噬细胞提取的方法步骤一：样品收集步骤二：稀释血液将收集到的外周血样品转移到无菌离心管中。
血液与提取缓冲液（例如PBS）的体积比通常为1：1或更高。
确保将血液和缓冲液充分混合，并避免产生气泡。
步骤三：测定血细胞数目使用血细胞计数仪或显微镜对血液样品中的细胞数目进行计数。
这一步骤有助于确定需要提取的巨噬细胞数量和稀释比例。
步骤四：离心在无菌离心管中以200g-300g的速度离心10分钟。
离心的目的是分离外周血样品中的细胞成分，将巨噬细胞沉淀在离心管底部。
步骤五：去除血清将上清液倒出，并保留巨噬细胞沉淀。
使用洗涤缓冲液（例如PBS）轻轻洗涤沉淀，可重复此步骤2-3次以去除血清残留物。
步骤六：裂解红细胞使用裂解缓冲液（例如裂解红细胞缓冲液）裂解红细胞，以消除它们对巨噬细胞的干扰。
在向沉淀中加入裂解缓冲液之前，先把沉淀悬浮均匀。
步骤七：离心在离心管中以200g-300g的速度离心10分钟，以使巨噬细胞重新沉淀。
步骤八：取出上清液将上清液倒出，并保留巨噬细胞沉淀。
步骤九：洗涤巨噬细胞使用洗涤缓冲液（例如PBS）轻轻洗涤沉淀，可重复此步骤2-3次以去除残留物和冲洗缓冲液。
步骤十：培养巨噬细胞将洗涤后的巨噬细胞转移到培养皿中，添加培养基和适当的生长因子和添加剂。
这有助于维持巨噬细胞的正常生理状态并促进其增殖和分化。
步骤十一：观察和分析将培养的巨噬细胞放在显微镜下观察其形态和生长状态。
此外，可以使用相关实验技术，如流式细胞术、基因表达分析等，对提取的巨噬细胞样品进行进一步分析和操作。
外周血巨噬细胞提取的方法主要包括血样品的稀释、离心、去除血清、裂解红细胞、洗涤巨噬细胞和培养等步骤。
这种方法可以方便地从外周血样品中提取和培养巨噬细胞，为研究和诊断提供了重要的实验材料。
请注意，在进行任何实验操作之前，务必遵守相关的生物安全和伦理规定，并严格遵循实验室安全操作规程。
外周血巨噬细胞提取的方法
外周血巨噬细胞提取的方法引言：外周血巨噬细胞是一类具有吞噬细菌、清除腐败细胞和参与免疫调节等功能的重要免疫细胞。
提取外周血巨噬细胞对于研究其功能和应用于临床诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外周血巨噬细胞提取方法，包括密度梯度离心法、附着法、负选择法和磁珠分选法。
一、密度梯度离心法密度梯度离心法是一种常用的外周血巨噬细胞提取方法。
首先，将外周血样品与等体积的生理盐水混合，然后缓慢倒入离心管中。
接下来，将离心管放入离心机中进行离心，离心速度和时间要根据具体实验要求来确定。
离心完成后，可以观察到不同密度的细胞在离心管中分层，外周血巨噬细胞通常位于上层的白细胞层。
最后，使用移液管将上层白细胞层吸取出来，并进行进一步的处理和分离。
二、附着法附着法是一种简单而高效的外周血巨噬细胞提取方法。
首先，将外周血样品加入到含有巨噬细胞黏附剂的培养皿中，使细胞在培养皿上附着。
然后，倒入培养基，将非附着的细胞倒出。
接下来，加入培养基和细胞活化剂，促使外周血巨噬细胞分化和增殖。
最后，通过离心或洗涤的方式将附着的外周血巨噬细胞收集起来。
三、负选择法负选择法是一种常用的外周血巨噬细胞提取方法，它通过去除其他类型的细胞来富集外周血巨噬细胞。
首先，使用特定抗体标记其他类型的细胞，如淋巴细胞和红细胞。
然后，将标记的细胞和外周血样品混合，通过磁珠分选或离心的方式将标记的细胞去除。
接下来，收集未被标记的细胞，即富集了外周血巨噬细胞。
四、磁珠分选法磁珠分选法是一种高效的外周血巨噬细胞提取方法。
首先，使用特定抗体标记外周血巨噬细胞表面的特定蛋白。
然后，将标记的细胞和磁珠混合，通过磁力分选的方式将标记的细胞富集起来。
接下来，使用磁力将富集的细胞与磁珠分离，得到纯化的外周血巨噬细胞。
总结：外周血巨噬细胞提取的方法有多种，包括密度梯度离心法、附着法、负选择法和磁珠分选法。
每种方法都有其特点和适用场景。
选择合适的提取方法可以高效地获得外周血巨噬细胞，并为后续的实验和研究提供可靠的基础。
红细胞分离
红细胞分离红细胞分离是指将人体外周血中的红细胞与其他细胞分离出来的一种生物学技术，广泛应用于临床病理诊断、血库工作、药物研制、基础研究等领域。
本文将探讨红细胞分离的原理、方法与应用。
一、红细胞分离的原理血细胞的分离是根据细胞的理化特性进行的，不同类型的细胞在大小、密度、电荷、抗原等方面存在差异。
红细胞的密度为1.09g/cm³，体积大约为6.8×10^-14L，根据不同的特性，可以采用离心、梯度离心、免疫学、磁性等方法进行红细胞的分离。
离心法：利用高速离心原理，根据细胞悬浮液中细胞的大小、密度、形态等差异，将不同的细胞分离出来。
将血液标本加入离心管中，设置不同的离心速度和离心时间，红细胞向下聚集，最后在离心管底部收集分离出来的红细胞。
梯度离心法：利用不同密度溶液的层状堆叠，形成密度逐渐递增的梯度离心液，在离心过程中，细胞会沉在感应浓度的不同介质处，形成分层，最终得到不同的红细胞、白细胞或血小板等。
免疫学：红细胞是具有血型抗原的细胞，利用不同的血型抗体制备特异性的抗体，可以针对血型进行免疫细胞分离。
红细胞表面覆盖有各自不同的特异性抗原，如ABO 系统的A、B、O抗原和Rh系统的D抗原等，利用特异性抗体与红细胞表面抗原结合，然后用离心等方法将被特异性抗体结合的红细胞分离出来。
磁性：利用磁性微珠载体上的抗体，可以通过磁力浓缩、磁力分离工艺，将红细胞与其他细胞进行选择性、高效的分离。
将磁珠Ⅰ（红细胞选择性抗原的特异性抗体）加入样品中，溶液在空间上形成薄膜。
以生物磁珠Ⅱ进行捕获后，用磁盘吸附方式进行分离。
二、红细胞分离的方法红细胞分离的方法有多种，其中离心法、梯度离心法、免疫学和磁性等方法是常用的，以下介绍部分红细胞分离的方法。
1. 离心法（1）常规离心分离法：将血样加入离心管中，设置适当的离心速度与时间，最后在离心管底部收集分离出来的红细胞。
（2）微量红细胞分离法：将血液标本加入微量离心管内，加入适量的淀粉，进行混匀后，离心到沉淀形成。
外周血中嗜碱性粒细胞(BASO)分离方法
外周血中嗜碱性粒细胞(BASO)分离方法
Percoll密度梯度离心分离法：
1、Pcrcoll混悬液的配制：Percoll 90ml,HBSS 9ml, HEPES(0.25mol/ l)1ml(PH 7.3),HCL(1mol/l)0.4ml 调节至PH7.4
2、制备Percoll密度梯度管
密度 Percoll/HBSS(ml/ml)
1.070 24:20
1.079 27:15.9
1.088 23:10
3、加分层液的顺序：底层先加4ml 1.088g/mlPercoll液，第二层加4M l1.079g/mlPercoll液，嘴上曾加3ml 1.070g/ml的Percoll液，制成3个密度梯度管，用于分离碱性粒细胞。
4、将新鲜的抗凝血（用0.1mol/lEDTA PH 7.7抗凝）按等体积加于Per coll密度梯度分层液上，室温下1200r/min离心25分钟。
5、将每一细胞层分别吸出各放于1支试管内，加无Ca,Mg离子的Hanks 液在4度下洗涤3次，每次1200r/min,离心10分钟弃去上清。
6、将分别得到的各层细胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色，在显微镜下检查嗜碱性粒细胞（大多数在中间层，但不同个体嗜碱性粒细胞的密度不同，因此可能会出现在其他细胞层），嗜碱性粒细胞染成紫红色。
外周血单核细胞的分离以及培养
一、牛外周血单核细胞的分离1、采血袋采集200ml血液2、首先在15ml离心管加3ml分离液（室温）3、轻轻的将3ml全血加到3ml分离液中4、400g室温离心30min5、离心后，吸取白膜层（0.5cm）转移到新的离心管6、加10ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）7、250g室温离心10min8、加5ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）9、250g室温离心10min10、重复8、9，加0.5ml培养液悬浮，二、磁珠分选11、将分离得到的PBMCs 进行细胞计数。
12、离心细胞悬液，300×g，10 分钟。
吸去上清。
13、将细胞沉淀用buffer（含0.5％BSA 的PBS）悬浮，按每107个细胞加80μL buffer 和20μL 抗CD14 磁珠，充分混匀，2-8℃孵育15 分钟。
14、300×g，10 分钟。
吸去上清。
用500μL buffer 重悬细胞。
15、将柱子放在磁珠分离器上，吸取细胞悬液加到柱子中，用500μL buffer 清洗三遍柱子。
16、待清洗三遍后，将柱子从磁珠分选器上取下来，加入1mL buffer，用助推器快速推动柱子中的洗脱buffer，收集单核细胞，计数。
17、单核细胞300×g 离心，10 分钟，用含10％的胎牛血清、100U/mL 青链霉素、PH7.2-7.4 的1640（IMDM）全培养液调整细胞浓度为按1×106单核细胞铺入10cm培养皿，37℃5%CO2温箱中培养。
三、磁珠分选注意事项1、柱容量：1×107磁性标记细胞可上达2×108细胞总量。
注意：当分选的细胞比淋巴细胞大时，柱容量需减少。
2、建议白细胞样本大小：在106—2×108细胞总量中有104—107标记细胞3、典型富集率：50fold至1000fold,取决于磁性标记的活力和特性，达到10000fold 富集量就可以分装两柱。
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外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细
胞的重要来源。
其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。
自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞，下层主要为红细胞。
此方法简便但各层中
的细胞种类多，不纯。
血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和
少量红细胞。
下层虽以红细胞为主，但也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞
形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开。
其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水
浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两
者易于分离开，取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。
此法分离的细胞纯度也不高。
氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。
淋巴细胞中混有的少
量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂解，以排除红细胞的干扰。
另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。