产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定-定稿
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述
农家参谋科技研究-220-NONG JIA CAN MOU高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述王琪（河南师范大学生命科学学院，河南新乡，453007）【摘 要】纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一，具有易获得、廉价等优点。
近年来，随着全球经济的迅速发展，能源消耗巨大，地球环境遭到严重破坏；因此，寻找可再生的清洁能源迫在眉睫，所以高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用得到了人们广泛的关注，也是当今微生物学、农业科学、生态学的研究热点。
本文对之前高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用的研究进行进行整合归总，展望今后的研究方向。
【关键词】高产纤维素；酶菌；筛选；鉴定1 高产纤维素酶自然界中纤维素广泛存在，但是降解过程生产成本高、环境污染问题，效果不理想。
经大量研究发现，纤维素酶是酶的一种，能够有效降解纤维素。
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。
细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，所以近年来各界学者致力于筛选及鉴定高产的纤维素酶菌的研究。
2 高产纤维素酶的筛选与鉴定经查阅资料与分析，从一定地区取样如：土样、常年堆积干枯腐败植物茎秆、东亚飞蝗肠道内等；取一定量样品在三角瓶中富集培养；先梯度稀释，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于马铃薯平板与牛肉膏蛋白胨分离培养基之上，37℃恒温培养24d,菌落计数,然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落,重复划线接种于相应的琼脂平板上,直至纯化得到单菌落。
根据菌落形态观察，保存不同种的菌落，利用牙签蘸取菌落，放入离心管进一步富集；之后取富集液滴在圆形滤纸片上然后分别接种与刚果红培养基，保持对应关系，进行培养；继而用游标卡尺测量菌落周围水解透明圈的直径,并以其大小作为初步判断分解能力的指标；接下来把筛选出的菌株用单染色法、复染色法和指纹代谢法进行初步确定菌株类别；最后用16SrDNA 鉴定，通过PCR 电泳比对后送公司进行测序；确定菌株后进行酶活测定以及优化其酶活力的条件探究。
目前经大量实验，从陕北花马盐湖分离得到一株黑曲霉Aspergillusniger6MA1，发酵条件优化后酶活可达到47.8U/mL；从常年堆积干枯腐败植物茎秆中筛选出一株肠杆菌属Enterobactersp，在未进行发酵条件优化的情况下酶活达到为0.44u/mL；从湿润木屑中分离和筛选获得１株高产纤维素酶目的菌株ＬＹＷ－１等。
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究⼴西轻⼯业GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY2009年7⽉第7期（总第128期）⾷品与⽣物纤维素是地球上分布最⼴，含量最丰富的碳源物质，对⼈类⽽⾔，它⼜是⾃然界中数量最⼤的可再⽣资源，是永不枯竭的⽣物资源。
纤维素可被纤维素酶降解⽣成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应⽤是植物质资源再利⽤的主要途径。
微⽣物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，迄今为⽌，国内外共记录了产纤维素酶的菌株⼤约53个属的⼏千个菌株[1]，其中主要有细菌、放线菌和真菌，⽬前研究的最清楚的是霉菌中的⾥⽒⽊霉T.reesei 。
细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，⼤多数对结晶纤维素⽆降解活性，且所产⽣的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度[1]，因此对细菌的研究较少。
但由细菌产⽣的纤维素酶⼀般为中性或碱性，近⼗年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤、纺织等⽅⾯应⽤前景⼴阔，细菌纤维素酶制剂已显⽰出良好的应⽤性能和巨⼤的经济价值[2]。
我们从青藏⾼原牦⽜粪中分离到⼀株⾰兰⽒阴性菌Ti-bet-YD4600-2，经16S rDNA 序列⽐对分析，Ti-bet-YD4600-2为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.)菌株。
鞘氨醇单胞菌属是Yabuuchi （1990）[3]等通过研究16S rDNA核苷酸序列，胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q 的主要类型，确定的⼀个新属，该属细菌具有着极强的⽣命⼒，分布⼴泛，对除草剂、偶氮染料、多环芳烃等具有较好的降解作⽤，近年来受到⼴泛重视和研究[4]。
１材料和⽅法1.1材料来源通天河（34°49.753N,92°56.142E ）海拔4604m 处取牦⽜粪样品。
1.2培养基[5]分离平板培养基，复筛培养基，滤纸崩解实验培养基，液体摇瓶培养基。
1.3初筛取样品1g 置于装有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶中，摇匀，从三⾓瓶中取1mL 转移到另⼀盛有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶，在25℃和150r /min 下振荡培养2h ，取0.1mL 振荡培养液涂布筛选到以CMC 为唯⼀碳源的培养基平板，倒置恒温25℃培养3~4d ，注意观察菌的⽣长情况，挑取单菌落⽤斜⾯保存。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。
常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。
2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。
3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。
二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。
常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。
2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。
3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。
三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。
2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。
3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。
4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。
综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。
通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。
一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果
ｃｎｉｏｓｏ ０ｒｒｎａ２ ｅｒｅ Ｃ ｈ ｅｐａ ａ ｅ ｏ ｄｇ ｃｎｓ Ｅ ／ ｅ ） ｅｏｌｃｎ ｅ（ Ｂ ／ ｅ ）ａｄＢ ｏｄｔ ｎ ｆ ２ ａ ８ｄｇ ｓ ．Ｔ ｅｋ ｌ ｓ ｆ ｎ ｏｌ ａａｅ（ Ｇ Ｃ ｎ ， ｘｇｕａａ Ｃ Ｈ Ｃ ｘ ｎ ． ｉ １ ／ｉ ｔ ｅ ｖｕ ｅ ｕ ｓ
基。 １ ）全国优 秀博 士学位论文专项 基金 （０５４ ； ２０４ ） 黑龙江 省杰出青
年基金 （Ｃ ０ ９ ９ 。 Ｊ ２０ ０ ） 第 一作者简介 ： 李保 深 ， ，９５年 ２月 生 ， 男 １８ 东北 林业 大学林 学 院， 硕士研究生 。 通信作 者 ： 高大文 ， 东北林 业大学林 学院 ， 授。Ｅ ｍ ｉ ｄｗｎ 教 — ａ ：ａｅ— ｌ
ｇ ｅ ｓ ａｅ（ ． ａｅ ｅ ． ５ ， ． ８ ｎ ． ８ ／ ｓ ｃ ｖ ｌ ｌ ｏｉ ｓ Ｂ Ｇ ｓ ）ｗ ｒ ３ ８ ６ ２ ６ １ａ ｄ １ ４ ７Ｉ ｍＬ ｒ ｐ ｔ ｅ ． ｙ ｄ ｅ Ｕ ｅｅ ｉ ｙ
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ｇｏ ｇ ｉ． ｏ ｏ ａ ＠ ｍａｌ ｅｍ
１ 材料 与方 法
收稿 日 ： １ 期 ２ ０年 ｌ ２ ０ ２月 ９日。 责任编辑 ： 红 。 程
１２ 分析方法 。 将纯培养菌株接人发 酵培 养基 中 ， ２ 、 ０ ／ ｉ 摇 床 ８℃ １ ｍｎ ２ｒ 培养 ７ｄ 用 移 液 枪 吸取 １ｍ ， Ｌ发 酵 液 离 心 （ ０ ／ ｉ ， ９０ ０ ｒｍ ｎ ５ ｍｉ） 上清液即为粗 酶液 。 ｎ， 酶活力 的测 定 ： 滤 纸糖 化力 的测 定 。取粗 酶 液 ０ ５ ① ． ｍ ， Ｌ加入醋酸一醋 酸钠 缓冲液 （Ｈ 值 ４８０ １ ｏ Ｌ ２ｍ ， ｐ ． ，． ｍ ｌ ） Ｌ ／ 然后 加入一张（ ｘ ） １ ｍ ６ ｍ 新华 １ ｃ ｃ 号滤纸 ， ℃恒 温水浴 １ ５ ０ ｈ
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定一、采样地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化二、培养基：（1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。
（2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。
20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。
（均需要加入抗生素100μg/ml）产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。
1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。
0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。
刚果红染液：2% 刚果红溶液。
NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。
三、实验方法3.1 真菌菌株的分离取土样方法如前所述。
取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。
纤维素酶酶活测定
纤维素酶酶活测定纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究
中山大学学报 （ 自然 科 学 版 ）
ＡＣ ＴＡ Ｓ ＥＮＴＩ ＣＩ ＡＲＵＭ ＮＡＴＵＲＡＬＩ ＵＭ ＵＮＩ ＶＥＲＳ ＴＡＴＩ Ｉ Ｓ Ｓ ＵＮＹＡＴＳ ＥＮＩ
Ｖｏ． Ｎｏ ５ １５１ ．
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一
株 产 纤 维 素 酶细 菌 的分 离 鉴 定 及其 酶 学 特 性研 究
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公司。 １２ 方法 ．
１２ １ 样 品预 处理 取 采 集 到 的 土壤 样 品 ５ ｇ于 ． ．
纤 维 素是地球 上 光合作 用产 量最 高 的多糖 ，它 是 由葡萄糖 以 Ｂ一１ ４糖 苷键 连接 而成 的线状 大 分 ， 子物 质 。据 报道 ，纤 维 素全 球 年产 量 为 １５× 卜 ． １ 万 ｔ ０ 。高效纤 维 素 酶 的研 究 开 发是 可 再 生 性 资
纤维素酶高产细菌的筛选、鉴定及酶学特性分析
纤维素酶高产细菌的筛选、鉴定及酶学特性分析作者：李碧婵陈金燕苏雅娜张敏来源：《湖北农业科学》2016年第17期摘要：从武夷山森林腐烂枯叶及附近土壤中筛选分离得到1株产纤维素酶活力较高的菌株CS-7。
通过形态特征观察和16S rDNA序列分析，将其鉴定为蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）。
对菌株CS-7所产纤维素酶的相关酶学特性进行研究，结果表明，该菌株所产纤维素酶CMC酶活为7.91 U/mL，FPA酶活为2.40 U/mL；酶的最适反应温度和最适反应pH分别为60 ℃和6；在40～50 ℃温度范围内热稳定性较好；在pH 5.0～7.0范围内pH稳定性较好。
研究结果表明，CS-7菌株是能产生耐高温中性纤维素酶的菌株，具有进一步研究开发利用的潜力。
关键词：纤维素酶；筛选；CMC酶活；滤纸酶活；酶学特性中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）17-4572-05DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.17.053Abstract： A cellulase producing strain CS-7 was isolated from soil samples collected from forest decayed leaf and soil around Wuyishan. Based on morphological and physiological characterization， CS-7 was characterized as Bacillus cereus. The enzymatic properties of cellulase from CS-7 were studied. The results showed that the CMCase activity of enzyme produced by CS-7 was 7.91 U/mL. The FPase activity was 2.40 U/mL. The optimal conditions for the enzymatic reaction were 60 ℃ and 6.0. The enzyme preparations of CS-7 strain were stable at 40～50 ℃ and pH 5.0～7.0. These results indicated that microbial strain CS-7 could produce heat-resistant neutral cellulase which has great potential for further exploration and utilization.Key words： cellulase； screening； CMCase； FPase； enzymatic property纤维素是葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的线性多糖，由绿色植物光合作用产生，是自然界中分布最广、储量最多的碳水化合物，是植物细胞壁的主要成分[1]。
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定
产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【摘要】通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料.采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定.结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).%In order to provide bacteria for development of cellulase preparations and cellulase engineering,the high-yield cellulase bacteria strains were screened.Separate cellulase producing strains isolated from cow or sheep dung and putrid maize straws or wood chips with Congo red plate to screen cellulase producing strains through the determination of enzyme activity with DNS assay,and observe its shape,dyeing and cultural characteristics.16S rDNA universal primers were applied to amplify genomic DNA of the strain,and to identify the species of rescreening strains.The result indicated that the isolated 16 bacterial strains with higher cellulase production were gram positive,short rod and central spores.In which,10 strains were Bacillus subtilis,6 strain were Bacillus amyloliquefaciens.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】6页(P7-11,19)【关键词】纤维素酶;16SrDNA;分离;鉴定;枯草芽孢杆菌;解淀粉芽孢杆菌【作者】吴自祥;张天亮;杨润霞;贾晓蕊;万学瑞;马亚茹;王艳;吴润;王川;魏姣;刘磊;张小丽【作者单位】甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q939.99随着世界经济的快速发展，能源需求量急剧上升，为了实现可持续发展，世界各国均在寻求新的替代能源，如风能、核能、太阳能、生物质能等等。
(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.
目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究
一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究邓先余;邹谋勇;黄志坚;易俗【摘要】Using CMC plat screening and Congo red dying methods, a strain of cellulase-producing bacterium named CXB001 was isolated from the soil around rotten root of Hibiscus mutabili on the campus of Hunan University of Science and Technology. Physical and chemical test and molecular phylogenetic a-nalysis based on 16S rDNA sequences showed that the strain was Bacillus velezensis. Biological charateris-tics revealed that the optimal growth temperature is 37℃ , and the gr owth temperature ranges from 10℃ to 50℃ , while the growth pH ranges from 5.0 to 11.0. The culture conditions at pH 6.0-9.0, 34 ~ 40 ℃ and 1.5% ~3. 5% NaCl are the most suitable for enzyme production. The optimal temperature for CXB001 to produce cellulase is 50℃ , while the optimal reaction pH is 5. 0, and the strain has nice enzyme stability in 20℃, pH 5. 0 ~7.0. Further experiments revealed that Co2+ could stimulate the cellulase, while Mg2+ and Fe2+ inhibit the enzyme reaction.%采用CMC平板筛选和刚果红染色等方法,从湖南科技大学校园腐烂木芙蓉根部土壤中分离1株产纤维素酶菌株CXB001,经生理生化测试、16SrDNA分子进化树分析,鉴定菌株为Bacillus velezensis.对该菌株的生物特性研究表明,其最适生长温度为37℃,在10～50 ℃,pH5.0 ～11.0中能生长,在pH 6.0～9.0,34～40℃,1.5％～3.5％ NaC1的培养条件下,最适产酶.CXB001所产纤维素酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0；在20℃、pH 5.0～7.0具有较好的稳定性.Co2+对纤维素酶具有激活作用,Mg2+,Fe2+对纤维素酶具有抑制作用.【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)005【总页数】7页(P93-99)【关键词】纤维素酶;Bacillus velezensis;16S rDNA;酶学特性【作者】邓先余;邹谋勇;黄志坚;易俗【作者单位】湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201;湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201;中山大学生命科学学院,广东广州510275;湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201;中山大学生命科学学院,广东广州510275【正文语种】中文【中图分类】Q936纤维素是地球上光合作用产量最高的多糖，它是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的线状大分子物质[1-2]。
纤维素酶高产菌的筛选和鉴定
纤维素酶高产菌的筛选和鉴定魏亚琴;邵建宁;麻和平;张文齐;杨勇;刘彩云;赵昊星;慕婷婷【摘要】从兰州榆中县兴隆山国家自然保护区采集土样,先用羧甲基纤维素钠刚果红培养基筛选出79株Hc值较大的产纤维素酶菌株,再经液体发酵复筛测CMC酶活和滤纸酶活.结果表明,经复筛后菌株No-15A的纤维素酶活力最高,羧甲基纤维素酶活1 376.20 U/mL,滤纸酶活497.78 U/mL,其粗酶液分解滤纸快速明显,且该菌株生长速度最快,每日菌落直径增长量为4～5 cm.经形态学初步鉴定菌株No-15A 属青霉.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)005【总页数】4页(P19-21,25)【关键词】纤维素酶;羧甲基纤维素酶活;滤纸酶活;青霉【作者】魏亚琴;邵建宁;麻和平;张文齐;杨勇;刘彩云;赵昊星;慕婷婷【作者单位】甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;兰州大学生命科学学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;南开大学生命科学院,天津,300071;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000【正文语种】中文纤维素是自然界分布最广泛、最丰富、最廉价的多糖物质，是植物细胞壁主要成分［1］，也是地球上年产量最大，具有巨大潜力的可再生天然资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1 000多亿t，中国每年农作物秸秆总产量为7亿多t，仅农业生产中形成的农作物残渣，如稻草、玉米秸、麦秸，每年就5亿t之多［2］，目前这些资源大部分通过简单焚烧，在浪费能源的同时也对环境造成污染。
随着石油、煤炭、天然气等不可再生资源日渐耗竭，有效转化，科学利用数量极其庞大的纤维素资源具有广阔的前景［3］。
利用纤维素酶水解纤维素成葡萄糖并进一步发酵转化成燃料乙醇、SCP饲料蛋白和各种平台化合物等，对缓解全球能源危机、饲料资源和化工原料紧张，保护环境等均具有重大意义［4］。
纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化
纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. 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纤维素酶活力测定方法
纤维素酶活力测定方法
纤维素酶活力测定方法是一种用于测定微生物体内所含有的纤维素降解酶活力的方法。
该方法主要包括取样、准备底物、加入酶液、反应与终止反应、读数等步骤。
其中，取样时需根据实验要求选择合适的微生物培养基，将微生物培养至适当的菌液浓度；准备底物时需选用纤维素作为底物，并在一定条件下将其水解为产生葡萄糖；加入酶液时需将适量的菌液加入底物中，使其产生酶解作用；反应与终止反应时需控制反应时间、温度和pH等条件，使产生的葡萄糖分子保持在一定范围内；读数时需使用分光光度计等设备测量反应液样品的吸光度，计算出纤维素降解酶的活力值。
该方法可用于评估微生物的生物降解能力和纤维素酶的活力大小，对于相关工业生产和农业生态环境等方面具有重要的应用价值。
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定
本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。
目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。
采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。
因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。
关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验1分离和初筛实验2复筛和保存实验3酶活测定和继代保存实验实验4紫外诱变育种实验5产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6产酶条件优化结果实验1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2，实验原理自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质的生物，从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。
这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。
在发酵堆肥中，有大量耐高温纤维素分解菌，但大多数是混合分解菌。
菌株需要1。
内切葡萄糖苷酶(endo-1，4-β-d-葡聚糖酶，简称EC 3.3.1.4，EBG)，也称为Cx酶，CMC酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解β-1，4-糖苷键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤维素小分子。
2.胞外-1，4-β-D-葡聚糖酶(酶代码3.2.1.91)，也称为C1酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶(CBH)，它从纤维素长链的非还原端水解β-1，4-糖苷键，一次切割纤维二糖分子；3β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶，EC3.2.21，缩写为BG)，也称为纤维二糖酶，可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三糖。
随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低，这种酶的特异性相对较差。
只有三种酶协同作用，才能很好地分解纤维素。
就单个菌落而言，木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量，因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。
只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。
从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。
使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源，并使用CMC-Na通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。
刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。
实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定
实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。
产中性纤维素酶真菌的鉴定及其酶学性质的初步研究
（ 华 中农 业 大 学 植 物 科 技 学 院 ， 汉 ４０ ７ ； 湖 北 省 成 宁 职 业技 术 学 院 生 物 工 程 系 ， 宁 ４ ７ ０ ） 武 ３ ０ ０ ’ 成 ３ １０
摘要
通过 ＣＭＣ平 板初 筛 、 摇瓶 发 酵 复筛 ， 土 样 中筛 选 到 １株 能 够产 中性 纤 维 素 酶 的真 菌 ， １Ｓ 从 经 ８
第 ２卷 第 ５ ７ 期 ２０ ０ ８年 １ Ｏ月
华
中
农业Leabharlann 大学学报
Ｖ０＿ ７ Ｎｏ ５ ｌ２ ．
０ｃ ．２ ０ ６ １ ６ ４ ｔ ０ ８， ２ ～ ２
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ａｈ ｎ ｒｃ ｌｕ ａ ｉｅｓｔ ｏ ｒ ａ ｆＨｕ ｚ ｏ ｇ Ａｇ ｉｕｔ ｒｌＵｎｖ ｒｉｙ
产 中性 纤 维 素 酶 真 菌 的鉴 定 及 其 酶 学 性 质 的初 步 研 究
ｒ ＮＡ基因序列分析初步确定该菌株为瓶霉菌 （ ｈａｏ ｈｒ ｐ ） Ｒ Ｐ ｉｌｐ ｏａｓ ． 。该 菌株 在适 宜的条件 下摇 瓶培养 ７ ， ２ｈ 产生
的内切葡 聚糖酶 活力可达到 ２ ９ Ｕ／ 。酶学性质初步研 究显示 ， ． ５Ｉ ｍＬ 菌株所产 内切葡 聚糖 酶活力 的粗酶 液最适 ｐ 值为 ６ ０ ． ， 在此 ｐ 范围 内具较高 的稳定性 ； Ｈ ． ～７０ 且 Ｈ 粗酶液 的反应 温度 以 ４ Ｏ℃左右为宜 ， 且在 ５ Ｏ℃以下具
中 的应 用 ｌ ， 中性 或碱 性 纤 维 素酶 的主 要成 分 是 ０ １ｇ Ｋ２ Ｏ４２ ０ｇ Ｃ － ５ ｇ （ ＿ 而 ３ ］ ． ， ＨＰ ． ， ＭＣ Ｎａ１ ， ＮＨ４ ２ Ｏ ）Ｓ ４ 内切 （葡聚糖 酶 ， ｝ ＿ 仅对 非 结 晶 区纤 维 素 水解 活力 较 ２ ０ｇ 酵母 粉 １ ０ｇ 蒸 馏 水 １０ ０ ｍＬ， Ｈ ． ～ ． ， ． ， ０ ｐ ８０
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产纤维素酶真菌的酶活测定及复核鉴定摘要：试验中的真菌一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。
包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌对其进行了微生物纯化、分离、筛选、酶活的测定及复核鉴定等。
关键词：纤维素酶活筛选真菌 ITS 鉴定纤维素是自然界存在量最大的一类天然资源，且可无限再生。
麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。
并且我国每年产秸秆约7亿多吨，实现秸秆资源高效利用，是我国可持续发展面临的重要问题。
能源危机和环境危机是整个人类社会目前面临的严峻问题，而合理有效的处理和利用纤维素资源将为解决这些问题提供一种有效的手段。
本实验通过对菌种产纤维素酶活的测定确定其酶活高低，并综合形态观察和ITS序列分析对其进行鉴定。
1.材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种试验菌种一部分来源于九寨沟的土壤中和枯枝落叶中，还有部分来自于河北迁安市及胜利油田的污染土壤中。
包括ACCC 31726、ACCC 32491、ACCC 32567、ACCC 32568等共计29株菌，所有菌种均来源于中国农业微生物菌种中心（ACCC）。
1.1.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基马铃薯200.0g 葡萄糖20.0g 琼脂15.0~20.0g蒸馏水1000.0mL pH 自然马铃薯去皮，切成块煮沸30.0min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000.0mL羧甲基纤维素培养基（CMCNa）NH4NO3 1.0g KH2PO4 1.0g KCl 0.5g Mn SO4 0.004g ZnCl20.0017g CoCl20.002g MgSO4•7H2O 0.5g FeSO4 0.01g CMCNa 10g 琼脂20g 蒸馏水1000ml pH 6.5羧甲基纤维素液体培养基（同羧甲基纤维素固体培养基配方，不加琼脂）液体发酵培养基玉米秸秆粉（40目）10.0g 麸皮 2.5g KH2PO4 1.5g (NH4)2SO4 1.3g K2HPO4·3H20 2.9g CaCl20.15g MgCl2 1.0g FeSO4 0.005g MnSO40.0061g NaCl 1.0g 蒸馏水1000 mL1.1.3主要试剂1.0%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）：2g羧甲基纤维素钠（粘度300~600里泊）溶于200.0mL蒸馏水中，水浴加热至溶解，用一层纱布过滤，取滤液100.0mL加pH4.8的醋酸盐缓冲液20.0mL，再加蒸馏水410.0mL，贮冰箱备用。
一周后应重新配制。
3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)制备：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和2.0mol/L NaOH溶液262.0 mL，加到500.0mL含有185.0g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5.0g结晶酚和5.0g亚硫酸钠，搅拌溶解。
冷却后用蒸馏水定容至1000.0mL，贮于棕色瓶中，半个月后使用。
pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8mL冰醋酸定容至100.0mL，称取27.2g的醋酸钠溶解并定容至100.0mL，将上述两种溶液等体积混合。
1%水杨苷溶液：1g的水杨苷溶液加少许pH6的缓冲液,，再用pH6的缓冲液定容至100mL。
1 mg/mL刚果红、水杨苷、whatman NO.1试纸、1 mg/mL 的葡萄糖标准液、羟基纤维素钠、葡萄糖、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、无水乙醇（预冷）、70%乙醇（预冷）、氯仿异戊醇（24:1）、液氮、CTAB缓冲液、ITS1、ITS5、Buffer、Taq酶、dNTP、TE缓冲液、DNA电泳胶（0.8g，100ml，5%TBE）、PCR电泳胶（1.0g，100ml，1%TBE）。
1.2 实验方法1.2.1菌种的初筛采用的刚果红染色法对菌株的酶活力进行初步筛选。
1.2.1.1实验原理：刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物便没法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
1.2.1.2实验步骤：菌落长满平皿后，加入适量1.0mg/mL的刚果红溶液，染色1h后倾去染液，加入适量1.0mol/L的NaCl溶液，洗涤1h。
菌体若能分泌纤维素酶，则在菌体周围会出现清晰的透明圈，根据透明圈与菌落直径比值的大小选择菌株。
1.2.2菌株的复筛将初筛的11株真菌接种到液体发酵培养基中，加一个空白对照管，进行摇瓶发酵培养(28℃，200r/min)，分别测定菌株在培养第3d、4d、5d、6d 的CMC酶，以酶活力为指标筛选菌株。
1.2.3纤维素酶活力测定1.2.3.1原理：纤维素酶是一种多组分的酶，其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素；C x酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维素寡糖；而β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维素寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量就可测定纤维素酶的活力。
1.2.3.2葡萄糖标准曲线的绘制准确称取葡萄糖250.0mg，溶于蒸馏水中，定容至250.0mL。
分别吸取0.1%标准葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别定容至50.0mL。
再分别吸取上述溶液各2.5mL于试管中，各加2.5mL 3,5-二硝基水杨酸，煮沸5min(另设1管对照，取2.5mL蒸馏水，加2.5mL3,5-二硝基水杨酸，同样煮沸5min)。
冷却后，用紫外分光光度计在550nm波长下比色，记录各管的吸光值，以吸光值作横座标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵座标，绘制标准曲线。
酶活力定义：在上述条件下，每小时释放1μg葡萄糖的量为一个酶活力单位（U）。
葡萄糖含量（mg）0.1 0.2 0.3 0.4 0.5OD550nm值0.048 0.211 0.355 0.595 0.724葡萄糖标准曲线1.2.3.3酶液提取将液体发酵液取出后（包括空白对照），用离心机4500r/min离心10min（去除杂蛋白及一些影响吸光值测定的杂质），取上清液则为粗酶液。
1.2.3.4 CMC酶活力测定用CMC 酶活力代表内切酶活力。
在试管中加入1.2mL1.0%浓度的羧甲基纤维素钠的缓冲液，再加入0.4mL适当稀释的酶液，于50℃恒温水浴锅保温30min，迅速加入DNS试剂2.4mL，沸水中煮5min，冷却至室温，加蒸馏水至20.0mL，混合均匀，取上清液在550nm处测定吸光值。
1.2.3.5滤纸酶活力（FPA）测定取Whatman NO.1滤纸一条（1cm×6cm，约50mg），卷成筒状，投入试管底部，加1.0mL pH值4.6的0.05M醋酸-醋酸钠缓冲液，再加入适当稀释的酶液0.4mL，盖上塞子。
将其置于50℃恒温水浴锅保温60min。
取出试管，迅速加入DNS试剂2.4mL，沸水中煮5min，冷却至室温，加蒸馏水至20.0mL，混合均匀。
取上清液在550nm处测定吸光值。
1.2.3.6 β-葡萄糖苷酶活力测定在试管中加入1.2ml1.0%水杨苷溶液的缓冲液并加入0.4mL适当稀释的酶液，50℃恒温水浴锅保温30min后迅速加入2.4mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却后加水稀释到20.0mL，在550nm处测定吸光值。
空白对照，对照样品预先煮沸灭酶活10min，其它同上。
1.2.4 菌株鉴定1.2.4.1 菌落形态观察将菌株分别接种到PDA平皿中培养，进行菌落形态观察和显微形态观察。
1.2.4.2 菌株DNA鉴定菌株活化：将菌株接种到盖有玻璃纸的PDA平皿中，于28℃培养3~4d，待菌丝茂盛而未大量形成孢子时，用已经灭菌的药匙刮去菌丝进行DNA鉴定。
1.2.4.2.1 DNA提取（1）将已刮好的装在离心管中的菌丝（装在2离心管中）加入液氮。
（2）将其放入研磨机研磨至均匀。
（3）将预热65℃的CTAB缓冲液800ml加入离心管中并且摇匀。
（4）将离心管放在65℃水浴锅中水浴30min。
（5）水浴结束后加入Tris饱和酚：氯仿异戊醇(25:24:1) 等体积混合，12000r 5min （6）离心结束后取上清液加等体积的氯仿异戊醇（24:1）混合，12000r 5min （7）离心结束后取上清液加等体积的氯仿异戊醇（24:1）混合，12000r 5min （8）取上清液加满冰箱预冷（4℃）的无水乙醇，放4℃冰箱20min。
（9）看是否有沉淀，多沉淀的用黄色枪头挑出放入一个干净的离心管中。
无絮状沉淀离心10000r 10min，然后倒出液体。
（10）将冰箱预冷的70%的乙醇加入离心管1ml洗涤DNA。
（11）重复第10步（第二遍加时稍微摇一下，充分接触）（12）把离心管倒立在吸水纸上至管壁没有水珠，观察DNA的量。
若DNA含量高，加入100ul TE缓冲液，中等加80ul TE缓冲液，少则加入60ul TE缓冲液。
（13）再离心2min，放入4℃冰箱中。
1.2.4.2.2 DNA电泳(1) 制备凝胶：电泳缓冲液配制的1.0%琼脂糖用微波炉融化，混匀冷却至，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳（琼脂糖的厚度在样品梳的1/3左右）。
(2) 取DNA提取产物5.0μL，与2.0μL加样缓冲液混匀，点样于1.0%的琼脂糖凝胶，以MarkerⅤ（全式金生物技术公司提供）为分子量标记。
(3) 5V/cm恒压电泳，当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源，电泳结束后将凝胶先在溴化乙锭染色液中染色10~15min，然后在凝胶呈像仪上观察其明暗程度并保存于电脑中。
1.2.4.2.3 ITS扩增反应及测序利用TransGen公司的2×Taq SuperMix进行扩增反应。
以提取的菌株DNA为模板，以ITS1（5’-CGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）（White T. J. et al., 1990）为引物，扩增ITS 片段，扩增体系如表。
PCR反应体系成分体积备注dNTP引物ITS1（10μmol/L）引物ITS4（10μmol/L）BufferIaqEDNA模板ddH2O1μL1μL1μL5μL1μL5μL补足至50μL（1OD稀释至500μL）（1OD稀释至500μL）PCR反应条件列表PCR条件温度时间预变性变性退火延伸循环数延伸95℃95℃53℃72℃3472℃3min2min35s1min—10min取PCR扩增产物于1.0%的琼酯糖凝胶上，以Marker Ⅴ为分子量标记。