分子荧光分析
分子荧光光谱分析
分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析的原理是基于分子的激发态能级和基态能级之间的电子跃迁。
当分子受到外界的激发能量（如光能）时，部分分子中的电子从基态跃迁到激发态。
当电子从激发态返回基态时，会释放出荧光光子，其能量与激发态的能级差相关。
这种发光现象被称为荧光。
荧光光谱是通过测量荧光发射的强度和波长来获得的。
通常情况下，荧光光谱的波长范围较宽，可以从紫外到可见光甚至红外。
荧光峰的位置和强度可以提供分子的结构信息，如它们的共振结构、官能团的位置和取代基的影响等。
因此，荧光光谱分析被广泛应用于有机分析化学、生物化学、医药化学等领域。
在分子荧光光谱分析中，常用的实验方法包括荧光激发光谱、荧光发射光谱和荧光寿命测量。
荧光激发光谱是测量分子在不同激发波长下产生的荧光发射强度的方法。
通过测量不同波长的激发光强度和相应的荧光发射强度，可以绘制激发光谱图。
从激发光谱图中，可以确定最佳的激发波长和激发强度，以获得最大的荧光发射信号。
荧光发射光谱是测量荧光信号的强度和波长的方法。
在荧光发射光谱实验中，分子在固定的激发波长下，通过改变检测器的波长来测量荧光光谱。
从荧光发射光谱图中，可以观察到不同波长下的荧光发射峰，并判断荧光光谱的特征。
荧光寿命测量是测量分子从激发态退激发到基态的时间的方法。
荧光寿命是荧光信号从达到最大强度到减少到原始强度的时间。
荧光寿命的测量可以提供有关分子动力学和化学反应速率的信息。
分子荧光光谱分析在许多领域有着广泛的应用。
例如，在环境监测中，可以通过测量水中有机物的荧光光谱来检测水中有机污染物的存在和浓度。
在生物药物研究中，荧光标记的分子可以用于检测和定量分析生物标志物的表达和鉴定。
此外，荧光光谱分析还可以用于材料科学、食品分析等许多其他领域。
总之，分子荧光光谱分析是一种重要且常用的分析方法，通过测量荧光发射的强度和波长可以获得分子的结构和性质信息。
不同的实验方法可以用于研究不同的分子特性和反应过程。
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
分子荧光的定性分析原理
分子荧光的定性分析原理
分子荧光定性分析是一种用于确定化合物是否具有荧光性质的方法。
荧光是指分子吸收光能后发出的短波长光。
以下是分子荧光定性分析的原理：
1. 激发：荧光分析通常需要先将化合物激发到一个能级，使其能够吸收能量。
通常使用紫外光或可见光来激发化合物。
这个能级通常对应着化合物的电子跃迁。
2. 吸收：化合物吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态能级。
这个激发态能级通常是一个高能量、不稳定的能级。
3. 跃迁：电子在激发态能级上停留的时间很短，随后会再次跃迁到较低的能级。
在这个过程中，荧光光子被释放出来。
光子的能量通常比激发光的能量低，对应着较长波长的光。
4. 发射：荧光光子的发射可以通过荧光光谱来观察。
荧光光谱通常是一个峰状曲线，波峰对应着荧光发射的波长。
通过比较样品的荧光光谱与已知荧光性化合物的光谱，可以确定样品是否具有荧光性质。
5. 荧光颜色：荧光发射的波长与化合物的结构密切相关，不同化合物具有不同的荧光颜色。
因此，荧光颜色也可以用来进行分子荧光定性分析。
需要注意的是，分子荧光定性分析只能确定一个化合物是荧光性还是非荧光性，
并不能提供关于分子结构和化合物量的定量信息。
为了进行准确的分子荧光定性分析，通常需要使用荧光光谱仪或相关的仪器。
分子荧光分析
荧光光谱:固定激发光波长和强度，而让物质发出
的荧光通过单色器测定不同波长的荧光强度。以
荧光的波长〔λ〕为横坐标，荧光强度〔IF〕为
纵坐标作图，便得荧光光谱。
蒽的激发光谱和荧光光谱
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
影响荧光发光的因素
分子构造影响荧光发光
分子产生荧光的条件 ：
①物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定 构造；
NH3
NH2
NH
OH H
OH H
pH<2 无荧光
7~12 蓝色荧光
>13 无荧光
定量分析方法
校准曲线法：以量的标准物质，按试样一样 方法处理后，配成一系列不同浓度的标准
溶液1，.校在准仪器曲调线零法后：再以浓度最大的标准 溶后测液2出作.标其基准他准标，对准调照溶节法液荧:的光相强对度荧读光数强为度10和0；空然 白溶3液．的多相组对分荧混光合强物度；的扣荧除光空分白析值:后，
以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横 坐标，绘制标准曲线；然后将处理后的试 样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测 定其相对荧光强度，扣除空白值后，从校 准曲线上求出其含量。
分子荧光分析法在医学检验中的应用
尿液中的色胺的测定
尿中色胺的含量是色氨酸代谢的 一个标志。色胺有天然荧光，激发峰 285nm，荧光峰360nm。把尿或组织液 的色胺萃取出来，就可直接检测。在 0.1~8μg/15mL范围内，荧光强度与色 胺浓度呈线性关系。
2 苯环上取代基的类型：
给电子基团。如-OH、-NH2常使荧光增强。
与π电子体系互相作用较小的取代基。如-SO3H对 分子荧光影响不明显。
吸电子基团如-COOH、-CO减弱甚至破坏荧光。
3 具有刚性平面构造的分子：
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
第七章-分子荧光法
第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecular luminescence），以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。
物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。
根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，燐光分析法和化学发光分析法。
荧光分析法历史悠久。
早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，就发现含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色，但未能解释这种荧光现象。
直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语，他还论述了Stokes 位移定律和荧光猝灭现象。
到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。
近十几年来，由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入，大大推动了荧光分析理论的进步，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展，加速了各种新型荧光分析仪器的问世，进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性，解决了生产和科研中的不少难题。
目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。
分子荧光分析法实验
1.1 荧光的产生
S2
2 1
V=0
2
S1
1 V=0
VR
ic
VR
A1
A2
F
发生激发 态反应
isc
T1
2
1
V=0
P
3
S0
2 1
V=0
分子内的激发和衰变过程
激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：
A1,A2 吸收: 10-15 s VR 振动松弛： 10-12 s ic 内转化： 10-11 s isc 系间窜越：
10-6 ~ 10-2 s
F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
P 磷光： 10-6 ~ 100 s
1.2 荧光光谱
当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光 强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若 固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发 光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的 曲线，称为激发光谱。
1.2 荧光光谱
5.空白溶液测试：
设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架 内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零 时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
7.未知试样的测定：
将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定标 准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。
1.5 分子荧光分析法的应用简介
常规分析应用：
定性分析：φf；λex；λem；峰形等
其它（略）
分子相互作用研究；
显微成像（物理迁移与化学衍化的原位 “显迹”）
定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C 高端生化研究： 代谢动力学跟踪；
第1节分子荧光分析原理
第1节分子荧光分析原理
分子荧光分析是一种基于光谱学的分析技术，用于检测其中一种物质的含量，它的原理是将吸收的光转换成可见的发射光，并通过检测发射光的强度来测定该物质的含量。
分子荧光分析的基本原理是，物质在紫外光的照射下，由其原子中的电子进行内部能量转换，当原子中的电子进行能量转换时，物质会释放可见光，而这种可见光的强度取决于物质中所含的物质的量。
分子荧光分析的技术基础是分子的能级构型。
分子的能级构型指的是一种构型，它包含一种特殊的分子电子构型，其中电子能量的分布形式是一种动态的状态，它可以在受到激发条件时发生变化，从而由原子中的一种状态转变成另一种状态。
分子荧光分析技术利用一种叫做“荧光”的物理现象，荧光是指在紫外光的照射下，物质由其原子中的电子发射出可见光，而这种可见光的强度取决于物质中所含物质的量。
分子荧光分析的优点有：灵敏度高，发射光强度与激发光强度之间的比值可以高达数万倍；分辨率高，可以检测低于ppb水平的分子；壁效应低，不受外界环境的影响；灵活性高，可以检测多种物质类型；可以进行在线监测；成本低廉，可以实现连续和定期的检测工作。
总结起来，荧光分析原理是：将紫外光照射到试样中。
荧光分析法原理
荧光分析法原理荧光分析法是一种基于物质在激发光源作用下发出的荧光信号来分析物质的方法。
荧光分析法是一种高灵敏度、高选择性和非破坏性的分析方法，广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍荧光分析法的原理及其应用。
荧光分析法的原理是基于分子在受到激发光源激发后，从基态跃迁到激发态，再返回到基态时所发出的荧光信号。
在激发光源的作用下，物质中的分子吸收能量，电子跃迁至激发态，当电子返回到基态时，会放出能量，这种能量以荧光的形式发出。
荧光分析法通过测量样品发出的荧光强度来定量分析样品中的物质成分。
荧光分析法的原理主要包括激发光源、激发光源与样品的相互作用、样品的荧光发射及荧光信号的检测。
首先，激发光源通过特定波长的光激发样品中的分子，使其跃迁至激发态；然后，样品中的分子在激发态停留的时间极短，通常为纳秒量级，之后返回到基态时会释放出荧光；最后，荧光信号通过荧光检测器进行检测和记录。
荧光分析法通常需要使用荧光光谱仪进行测量，通过记录样品在不同波长下的荧光强度来获取样品的荧光光谱，从而进行定量分析。
荧光分析法具有很高的灵敏度，因为荧光信号的强度和物质的浓度呈线性关系，而且荧光信号通常远远高于背景信号，因此可以检测到极低浓度的物质。
同时，荧光分析法还具有很高的选择性，可以通过选择合适的激发波长和检测波长来对不同物质进行区分。
另外，荧光分析法还是一种非破坏性的分析方法，对样品的破坏很小，适用于对样品进行多次检测的情况。
荧光分析法在生物医药、环境监测、食品安全等领域有着广泛的应用。
在生物医药领域，荧光分析法常用于药物分析、蛋白质检测、细胞成像等方面；在环境监测领域，荧光分析法可用于水质、大气、土壤等环境样品中有机污染物的检测；在食品安全领域，荧光分析法可以用于食品中有害物质的检测，如农药残留、食品添加剂等。
总之，荧光分析法作为一种高灵敏度、高选择性和非破坏性的分析方法，具有广泛的应用前景。
随着科学技术的不断进步，荧光分析法在各个领域中的应用将会更加广泛，为人类的生活和健康提供更多的保障。
第3章分子荧光分析法
3.2 荧光光谱仪
3.2.1 荧光光谱仪基本结构
光源
单色器
吸收池
与紫外-可见 光谱仪的不同
单色器 检测器
信号显 示系统
01:42:38
光源
1. 光源的要求： 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命
常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源
2.氙灯光源
01:42:38
3.3.3 荧光定量分析
定量依据
I f Kc
1. 标准曲线法（校准曲线法）
c1
c2
c3
c4
c5
cx
2. 单点校正法（标准对比法）
As Ax
cs
01:42:38
cx
A
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
1
2
3
4
5
cmol L-1
cx
Ax As
cs
1）溶剂对荧光强度的影响
一般溶剂效应 特殊溶剂效应
介电常数、折射率 溶剂与荧光物质间的特殊作用
巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率
溶剂 乙腈 丙酮 氯仿 四氯化碳
相对介电常数 38.8 21.5 5.2 2.24
荧光峰/nm 410 405 398 390
荧光效率 0.064 0.055 0.041 0.002
荧光激发光谱与发射光谱的特征 a.Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液 中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发 射之间产生了能量损失。
分子荧光分析法
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1.分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光 源。
主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽
间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器
之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧 光。
第五章 分子荧光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。
4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。 光二极管阵列检测器。
二、仪器的类型 1.光电荧光计：滤光片荧光计。
溴钨灯，滤光片，光电管。 2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，
光电倍增管。
第五章 分子荧光分析法
第三节 定性定量分析
第五章 分子荧光分析法
第一节 第二节 第三节 第四节
基本原理 仪器 定性定量分析 荧光新技术和应用实例
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程 分子的激发态 荧光的产生 激发光谱和荧光光谱 激发光谱和荧光光谱的关系 二、分子结构与荧光关系 荧光效率 分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的外界因素 荧光强度与荧光物质浓度的关系
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子荧光分析法
分子荧光分析法标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]分子荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
分子荧光光谱分析
分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析是一种用于分析化学物质的基本技术，这种技术可以检测特定物质的含量或结构。
荧光光谱分析被大量应用于食品、农业、医药、环境分析等领域，在所有的分析技术中占有重要地位。
荧光光谱分析的基本原理是，经过一定的处理，把紫外线或可见光辐射照射到样品上，通过检测分子散射回来的光来测量特定分子的含量或结构。
当光辐射射到样品中时，分子会吸收辐射，然后经过一定的激发，输入一定的能量，使分子达到激发态，并以光子的形式释放这些能量，形成荧光光谱。
根据测量的荧光光谱，可以研究分子的稳定性、结构和含量。
荧光光谱分析主要有三类技术：荧光光谱仪、激发源谱仪和时间谱仪。
荧光光谱仪是一种用于检测可见光和紫外光的仪器，它可以检测样品中各种物质的荧光特性；激发源谱仪是一种用于精确测量荧光信号量的仪器，它可以同时获得多种物质的信号；时间谱仪是一种用于检测分子的荧光瞬变过程的仪器，可以检测各种分子行为的时间信息。
荧光光谱分析有一定的优势，例如精确，可以精确的检测分子的结构和运动；灵敏，可以检测出极少的物质；选择性，可以根据激发光的波长来选择不同的分子；全面，可以同时检测多种物质；适用性强，可以用于模拟各种物理和化学环境，如溶液、气体和固体等；可重复性强，可以将检测结果记录下来，以便重复使用。
荧光光谱分析的研究和应用正在不断深入，它已成为化学、生物、物理过程观察的重要手段，在食品、农业、医药、环境分析等方面均有广泛应用。
随着科学技术的发展，分子荧光光谱分析将会在更多领域有更多的应用，对于科学研究和技术应用将产生重要作用。
分子荧光光谱分析是一门复杂的学科，涵盖了物理学、化学、生物学等学科，能够有效检测分子的数量和结构，而且还可以用于模拟复杂的物理和化学环境，是一种有效的分析技术。
随着科学技术的发展，荧光光谱分析将会在更多领域有更多的应用，为社会发展做出更大的贡献。
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2 共扼效应 因为: 共扼程度越大, * 与之间的能级差越小,就越利于基态电子 被激发. 所以大多数能产生荧光的物质都具有共扼结构，如芳环等.
0.18
0.61
荧 光 效 率 增 大
0.93
3 刚性平面结构: 可以减小面外振动,减小与溶剂或其他溶质的 相互作用.减小能量以非光能方式损失.
HO OH
分子荧光分析
1. 发射光谱分析
样品池 + 光源
1
2. 吸收光谱分析
2
样品池
1
1
第一节 基本原理
一、分子荧光的产生 先知道分子能级的单重态和多重态 能级的多重度 M = 2S + 1 (S为自旋量子数代数和) 同轨道上的一对电子：
自旋方向相反S = 0, M=1表示能级为单重态 (S);
自旋方向相同S = 1, M=3表示能级为三重态 (T)。
HO
O
OH
O O
O O
酚酞
荧 光 素
4 取代基效应: 接在苯环上的给电子基团使处于基态的电子数 增多,电子跃迁的几率增大, 使荧光增强.
五荧光物质的浓度与荧光强度的关系 ——定量分析理论依据
荧光效率
=发射荧光量子数/吸收光量子数
不是所有被激发的分子都可以发射荧光，能发射荧 光的实际分子数相对于被激发分子的总数之比叫荧光效 率。
荧光效率决定荧光强度If
=Ia =Io -It =Io （1-e-ε lc）
Io: 激发光强度
If =2.3Iolc =Kc
荧光强度If与激发光强度和溶液浓度成正比，此关 系只有在极稀溶液条件下才成立.
六、荧光猝灭
荧光分子与溶剂分子或其他分子相互 作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝 灭。 包括： 碰撞猝灭，能量转移等。
6 溶液荧光猝灭
（1）碰撞猝灭：指处于激发态的荧光分子与猝灭剂分 子相碰撞，使激发态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回 到基态，产生猝灭作用。 （2）静态猝灭：由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生 成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还引起溶液吸 收光谱的改变。 （3）发生电子转移反应的猝灭：某些猝灭剂分子与荧光 物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，因而引起 荧光猝灭。 （4）荧光物质的自猝灭：在浓度较高的荧光物质溶液中， 激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子 碰撞而引起的自猝灭。
二、直接测定 待测组分能直接产生荧光 三、间接测定 待测组分不能直接产生荧光 * 转化成有荧光的物质 如: 无机离子+有机螯和剂有荧光的物质 有机物荧光物质 * 荧光猝灭法, 待测物本身不产生荧光,但可以使有 荧光的物质猝灭,通过测量荧光强度的减低值来间接 分析组分含量. * 敏化发光法:待测组分不能直接吸收激发光, 但却 很容易从另一种物质(敏化剂)中获得能量.可以让敏 化剂先吸收激发光,再将激发能传递给待测物, 使待 测物产生荧光.
荧光光度法与UV法测定灵敏度哪个强？为什么？ 荧光光度法灵敏度比UV法强上百倍。 1、在UV中 A=lgI0/I, 所检测的是两信号的比值；而 荧光法是直接测定发射光强度If =2.3Iolc 2、在荧光光度分析中, 所检测的是很低背景信号下的 荧光强度, 很容易进行高灵敏检测. 而且增大入射光强 度或提高荧光信号的放大倍数还可以降低检出下限.
按波长分
（a）共振荧光
（b）直跃线荧光
（c）阶跃线荧光
（d）反斯托克斯荧光
1、共振荧光：具有与激发光相同的波长，在气体和 结晶中产生。 2、非共振荧光：当荧光与激发光的波长不相同时， 产生非共振荧光。有： 直跃线荧光：激发态分子跃迁至高于基态的亚稳态时所 发射的荧光。 阶跃线荧光有两种： 正常阶跃线荧光：为被光照激发的分子以非辐射形式 去激发返回到较低能级，再以辐射形式返回基态而发射的 荧光。 反Stokes荧光：物质分子中的电子在被光激发的过程中 如伴有热助激发，则它由高能态辐射跃迁至基态时，将发 射出波长小于其吸收波长的荧光，即为反Stokes荧光。 3、敏化荧光：受光激发的原子与另一种原子碰撞时， 把激发能传递给另一个原子使其激发，后者再以辐射形式 退激发而发射荧光。
分子荧光分析
分子荧光分析是属于分子发光分析。 分子荧光 光致发光 分子磷光 分子发光 化学发光 生物发光 基本概念： 1、分子发光：某些物质的分子吸收各种能量跃迁到较 高的电子激发态后，又返回基态的过程中伴随有光辐射。 2、光致发光：物质因吸收光能而激发光的现象。 3、化学发光：若吸收化学反应能激发发光的现象。 4、生物发光：发生在生物体内有酶类物质参与的化学 发光反应的现象。
第二节 仪器结构
1
光源
样品池
聚焦
2 数据 检测器 一、荧光分析特点： 1、灵敏度高 2、选择性好 (既可以选择特征发射波长， 又可以选择特征吸收波长) 3、样品用量少 （稀溶液适用） 4、应用范围有限
信号处理
二、构件 光源：氙灯 滤光片：干涉滤光片(半峰宽窄,透射率高) 单色器: 光栅 检测器: 光电倍增管
三、背景信号
1 2 3 散射和反射信号: 溶液, 样品池, 光学元件及漏光等原因 拉曼散射: 主要由溶剂产生. 背景发光: 其他器物产生的荧光, 溶剂纯化, 避免使用塑料 制品.
第三节 荧光分析方法 If =2.3Iolc =Kc
一、荧光定量分析的条件
1 溶剂
不同溶剂条件下，其荧光强度和发射的波长 都不一样. 温度 低温有利于荧光强度的增大. PH值 最佳PH范围 试剂 试剂的纯度和空白实验
2
3 4
5 内滤光作用和自吸收现象
内滤光作用：溶液中若存在能吸收激发光或 荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱， 这种现象称为内滤光作用。内滤光作用的另一种 情况是荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与 该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。 自吸收现象：在溶液浓度较大时，一部分荧 光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低 了溶液的荧光强度。
四 有机化合物结构与分子荧光的关系
化学结构与荧光效率（） 1 跃迁类型 *，* n，以* 的荧 光效率最高，而* n跃迁的化合物荧光效率 低 。如含有羧基、羰基、硝基和卤素等化合物 荧光效率低。 因为： • * 摩尔吸光系数大上百倍, 吸光效率高. • * 时间短, 速率大. • * 能量损耗小.
基态
激发单重态
激发三重态
以热量的形式散发
S 激发态 T 激发态
荧光 磷光
激发光
S 基态 由电子第一单重激发态返回基态所发射的辐射就是荧光。 由电子的第一三重激发态返回基态发射的辐射是磷光。
二、分子吸收光谱与分子荧光光谱的关系
•激发光谱（吸收光谱）：通过固定发射波长，扫描激发波长 而获得的荧光强度---激发波长的关系曲线。 它反映了在某一固定的发射波长下，不同激发光激发的 荧光的相对效率。 激发光谱可用于荧光物质的鉴别，并在进行荧光测定时 选择适宜的激发波长。 •发射光谱（荧光光谱）：通过固定激发波长，扫描发射（即 荧光测定）波长所获得的荧光强度---发射波长的关系曲线。 它反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子的相对 发射强度。 发射光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧光测定时选 择恬当的测定波长或滤光片的依据。 两光谱呈镜像关系
三、荧光类型 按时间分
瞬时荧光（prompt）：一般溶液中发出的荧 光，从S1S0跃迁时发射，大约需10-8秒。 迟滞荧光（delayed）：某些分子跃迁至T1态 后，因相互碰撞或通过热激活作用又回到S1态的 各个振动能级，经振动弛豫到达S1态的最低振动 能级降至S0态而发生荧光。 其寿命与该物质的分子磷光相当。在晶体或 粘稠介质中产生，发射时间长。