3.小鼠解剖及动物原代细胞培养
动物细胞原代培养名词解释
动物细胞原代培养名词解释1.引言1.1 概述动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，被广泛应用于生物学研究领域。
通过原代培养，科研人员可以将动物体内的细胞从组织或器官中分离出来，并在适当的培养条件下培养和繁殖这些细胞。
这种培养方法能够维持细胞的生长和功能，使其能够在体外环境下长期存活。
原代培养的过程可以分为两个主要阶段：细胞分离和细胞培养。
首先，需要将动物组织或器官进行机械或酶解分离，以获得单个的细胞悬浮液。
然后，将这些分离的细胞种植在含有适当培养基和营养物质的培养皿中，提供合适的温度、湿度和氧气条件，使细胞得以生长和分裂。
通过原代培养，科研人员可以获得大量的动物细胞来进行各种实验和研究。
这些细胞可以用于研究细胞的生理功能、细胞周期、细胞信号传导以及疾病模型的建立等。
此外，通过原代培养还可以进行细胞遗传学研究、药物筛选和细胞工程等领域的实验。
总而言之，动物细胞原代培养是一种重要的实验手段，可以为科研人员提供源源不断的动物细胞来进行各种研究。
它为细胞生物学、医学研究以及药物开发等领域的进展提供了坚实的基础，并在解决许多科学问题中扮演着重要的角色。
文章结构指的是文章的组织框架和布局。
它的作用在于使读者能够清晰地理解整篇文章的内容和结构，从而更好地把握文章的主旨和论证思路。
本文按照以下结构进行组织和呈现：1. 引言1.1 概述在这一部分，将对动物细胞原代培养的基本概念和背景进行简要介绍，引起读者的兴趣，并提出研究的意义。
1.2 文章结构（即本节内容）在这一部分，将对整篇文章的结构进行概述，介绍各个章节的内容以及它们在整篇文章中的作用。
1.3 目的在这一部分，明确研究动物细胞原代培养的目的，说明研究的意义和价值，为读者提供清晰的导向。
2. 正文2.1 原代培养详细介绍什么是原代培养，原代培养的步骤和方法，以及原代培养在细胞研究中的重要性和应用领域。
2.2 动物细胞介绍动物细胞的结构和特点，包括细胞膜、细胞质、细胞核等重要组成部分，以及动物细胞在生物学研究和医学领域中的应用。
原代细胞培养操作步骤
原代细胞培养操作步骤原理：将动物机体的所有组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置适宜的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程之为称原代细胞培养。
操作步骤（一）胰酶消化法1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，放入75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和**浸入体内）然后用碘酒**腹部，取胎鼠带入超净台内（或者将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。
细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法
小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法小鼠背根神经节神经细胞原代培养是神经学研究、药物筛选及细胞病理学研究中必不可少的一环。
本文将介绍一种新的小鼠背根神经节神经细胞原代培养方法的步骤及注意事项。
步骤1: 动物处理。
用取出小鼠的背根神经节放入无菌的PBS缓冲液中搅拌7-8分钟，使神经节中的细胞离体，并通过多次离心来去除PBS缓冲液。
步骤2: 细胞悬浮。
将含有神经细胞的细胞悬液用1mL冰冷的PBS缓冲液洗涤2次。
再用1mL冰冷的70%酒精进行紧密覆盖，静置5分钟。
再用PBS缓冲液洗涤5次，最后用DMEM/F-12添加10%胎牛血清（FBS）调整至适当浓度。
步骤3: 细胞培养。
将细胞悬液转移到含有0.1%聚赖氨酸的DMEM/F-12培养基中，距离表面1cm左右，进行孵育24-48小时。
孵育室应控制在37℃的恒温条件下，同时CO2含量应设定在5%。
步骤4: 原代细胞出现。
24-48小时后，可见到原代神经细胞在培养皿中生长，而其他非神经细胞则无法生长。
这是因为神经元比其他细胞易受到聚赖氨酸的作用，从而对组织细胞进行筛选。
步骤5: 细胞传代。
当原代细胞数量足够时，可进行细胞传代。
将同等的DMEM/F-12培养基中加入0.5%胰酶，将原代细胞取下进行培养。
注意事项：1.处理过程中必须保持无菌，防止微生物污染。
2.神经节处理过程中的时间要注意，过久会导致细胞死亡，过短则分离不完整。
3.使用的培养基及化学试剂要质量优良。
4.培养条件要严格控制，CO2含量及温度要保持恒定。
本文介绍的方法较为简单易行，对于初学者或初学者也容易了解。
但细胞培养中实验操作需要非常谨慎，为保证实验的准确性和有效性，一定要保证实验过程中的无菌、温度、CO2含量和实验技术的高效性。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
动物细胞原代培养过程
动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。
用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。
1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。
三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。
四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。
2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。
（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。
五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。
2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。
3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。
制的细胞悬液。
六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。
2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。
（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。
RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
其中含有10%胎牛血清。
）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
原代细胞培养 实验报告
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
动物细胞原代培养流程
动物细胞原代培养流程
1. 取材。
- 从健康动物体内取出所需组织，如肝脏、肾脏等，尽量选择新鲜、无菌的组织材料。
- 取材过程要迅速，减少组织暴露在外界环境中的时间，以降低污染风险。
2. 组织处理。
- 将取出的组织块用平衡盐溶液（如PBS）清洗，去除表面的血液、杂质等。
- 把组织剪成小块，一般为1 - 3mm³大小，便于后续消化。
3. 消化。
- 加入适量的消化酶（如胰蛋白酶或胶原酶），在适宜的温度（通常为37°C）和时间（根据组织类型和酶的活性而定）下进行消化。
- 消化过程中可轻轻摇晃容器，使消化酶与组织充分接触。
4. 终止消化。
- 当组织块变得松散，大部分细胞游离出来时，加入含血清的培养液终止消化。
血清中的某些成分可以抑制消化酶的活性。
5. 过滤。
- 将消化后的细胞悬液通过滤网（如200目滤网）过滤，去除未消化完全的组织块。
6. 离心。
- 将过滤后的细胞悬液进行离心，转速一般为1000 - 1500r/min，离心时间5 - 10分钟。
- 离心后弃去上清液，得到细胞沉淀。
7. 细胞计数与活力检测。
- 用适量的培养液重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数（可使用血球计数板等工具）。
- 同时检测细胞活力（如台盼蓝染色法，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色）。
8. 接种培养。
- 根据细胞计数结果，将适量的细胞接种到培养容器（如培养瓶、培养皿）中。
- 加入适量的培养液，放入培养箱中，在适宜的温度（37°C）、湿度（95%左右）和二氧化碳浓度（5%）下进行培养。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材的方法如下：
1. 准备工具和试剂：显微镜、组织培养耗材（培养皿、离心管、无菌吸管等）、组织培养基、酶消化液（如胰蛋白酶）、PBS缓冲液、抗生素/抗菌剂。
2. 选择适当的组织：根据需要培养的小鼠细胞类型，选择相应的组织。
常用的组织包括肝脏、肺、脾脏、肌肉等。
3. 术前准备：将工作台面清洗消毒，准备好所需的培养皿和离心管，并在显微镜下准备好所需的组织。
4. 组织分离：将小鼠人工麻醉后，用无菌PBS缓冲液冲洗外部组织，然后取出所需的组织。
将组织切成小块，放入含有适当酶消化液的离心管中，进行酶消化。
消化时间和温度根据具体实验要求来确定。
5. 组织纯化：将酶消化后的混合细胞悬液通过滤网过滤，去除组织碎片和大颗粒。
然后将悬液离心，收集沉淀细胞。
细胞沉淀可以通过悬液离心的速度和时间的调整来控制纯化程度。
6. 细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要的细胞数量。
7. 细胞培养：将收集到的细胞沉淀转移到含有适当培养基的培养皿中。
根据细胞类型的不同，培养条件和培养基的配方也会有所区别。
一般来说，细胞培养条件包括适当的培养基、温度、CO2浓度和湿度。
8. 细胞培养维护：定期更换培养基，观察细胞的生长情况，及时处理培养皿中的细菌或真菌污染，并进行细胞的传代培养。
以上是小鼠细胞原代培养取材的基本方法，具体操作中还需要根据实验需求和细胞类型的特点进行相应调整。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后， 以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取 用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装臵 的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外 打开。
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动物细胞原代培养
原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
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动物细胞原代培养
日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用 软毛刷轻 轻的掸去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻 擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
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动物细胞原代培养
实验动物的选择
小鼠，清洁级。(选择大约一半足孕时间的胚 胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未 分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些 细胞衍生获得。)
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动物细胞原代培养
实验材料
药品：RPMI1640培养液，小牛血清(FCS)， 0. 25% 胰蛋白酶 ，PBS（-） 器材：培养瓶1支/组，50ml离心筒2支/组，培 养皿1套/组，吸管1支/组，EP管1支/组 （在无菌室共用试剂车取用），剪子1把 /组，镊子1把/组，滤器1支/组。 设备：水浴摇床、离心机、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜
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动物细胞原代培养
操作步骤
1、开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。 2、使用 （1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。 观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
培养原代小鼠组织细胞检验细胞实验室技术操作规程
培养原代小鼠组织细胞检验细胞实验室技术操作规程一、实验室准备工作1.实验室应保持洁净，定期进行清洁和消毒。
2.实验室应配备必要的细胞培养设备，包括培养箱、显微镜、离心机、培养罐等。
3.实验室应准备充足的培养基、消毒液和培养器具。
二、实验前准备工作1.按照动物行为规范，进行实验前小鼠的选取和准备。
2.准备必要的实验器具和试剂，包括镊子、剪刀、离心管、离心管架等。
3.配制适宜的培养基，并用无菌技术将其分装至各培养器具中。
4.将小鼠解剖台、镊子、剪刀、显微镜用70%酒精进行消毒。
三、组织取材和细胞培养1.根据实验设计要求，选择需要培养的组织。
可选择肾脏、肝脏、肺等组织。
2.将小鼠固定在解剖台上，用70%酒精清洁，并在无菌条件下进行解剖。
3.快速而轻柔地取出目标组织，并将其置于含有生理盐水或PBS的培养皿中。
4.用镊子和剪刀将组织切成小块，尽量减少组织的暴露时间。
5.将组织块转移到含有酶溶解液的离心管中，如胰蛋白酶、胶原酶等。
6.将离心管封闭并置于37℃恒温水浴中进行组织消化，时间根据实验需要而定。
7.定时检查组织消化情况，当组织被充分消化后，用细胞培养基中和酶消化作用。
8.通过过筛网过滤消化液，将过滤液收集到离心管中。
9.添加培养基，并用70μm孔径的细胞过滤器过滤细胞悬液以去除组织碎片。
10.细胞数目根据需要进行计数，在细胞均匀分布的情况下，根据实验要求选取适当比例的细胞进行接种。
四、细胞培养条件和细胞处理1.细胞培养箱应设定适宜的温度、湿度和CO2浓度，一般为37℃、5%CO22.接种细胞时，应选择恰当的培养血清浓度，一般为10-20%。
3.定期观察细胞的形态和生长情况，进行细胞传代。
4.根据实验要求，可进行细胞处理，如药物处理、感染处理等。
5.不定期检测细胞的污染情况。
如发现细菌、真菌或其他细胞污染物，应及时进行处理。
五、细胞实验的安全措施1.进行实验时，应佩戴实验手套、实验面罩等个人防护装备，以保护实验者的安全。
3.小鼠解剖及动物原代细胞培养
实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
1.实验材料：实验室购买的雄性小鼠、13.5天孕鼠。
DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCl 8.00g，Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH2P04 0.20g，pH调至7.2，超纯水定容到1000mL，分装，121 ℃灭菌20 min）2.实验步骤：2.1 处死小鼠用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或怀孕雌鼠尾巴中部放在铁笼上，使小鼠前肢接触铁笼（后肢悬空），左手从小鼠后方向前按住鼠头及颈部。
左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，同时右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，造成小鼠立即死亡。
当小鼠停止抽搐，松开左手。
实验五 动物细胞的原代培养
实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。
3．初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。
细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。
原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。
三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一.实验目的1．掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。
2．熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。
3．了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。
二.实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养（Cell culture）才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传代培养。
1．原代培养（primary culture）是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化培养法。
组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。
动物细胞的原代及传代培养
动物细胞的原代及传代培养一、试验目的1、了解动物细胞原代培养的原理及基本方法，掌握组织块法及消化培养法的操作过程，掌握无菌操作的技术要领；2、了解传代培养方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长情况。
二、实验原理动物细胞的原代培养是指把直接从动物获得的细胞、组织或器官在体外培养直至第一次传代为止。
要求在严格无菌的条件下对动物进行切割成组织块或经消化液使组织细胞游离为单个细胞，然后在人工配制的营养液内使其不断地生长和繁殖。
传代培养是指将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移、接种到另一培养瓶的培养过程。
三、实验材料和试剂鸡胚，HeLa细胞实验器材：无菌工作台，细胞培养箱，离心机，无菌解剖器材，培养皿，培养瓶，滴管等。
实验试剂：平衡盐液，细胞消化液，培养液四、实验步骤（一）动物细胞的原代培养1、取材①将鸡蛋用酒精消毒，用剪刀敲破鸡蛋的圆端，剥壳去膜，倒掉壳内的液体；②拉出鸡胚，剪去头后置于装有Hank液的培养皿内，用Hank液清洗；③然后用镊子小心拔掉鸡胚的毛，将拔完毛的鸡胚。
2、组织块培养法①剪取背部及大腿部的皮肤肌肉组织十余块于培养皿中，用剪刀剪成1mm3大小的组织块；②用弯头吸管吸取组织块送入培养瓶底部，均匀排列；③翻转培养瓶后吸取3管培养液，滴入到培养瓶内（注意：吸管不能碰到瓶口）；④标记在培养瓶写上“原代”，写上姓名和学号。
3、消化培养法①剪取十余块组织块放入干净的培养皿中，吸取3-5管消化液，放入37℃的培养箱中消化10-20min，到组织变成松散、粘稠状，然后加入1管营养液（停止消化）；②取一只干净的细管将组织块打散，放置一段时间，用吸管吸取上清液于离心管中，离心10min；③倒掉上清液，用营养液悬浮沉淀，转入干净的培养瓶中，加入适量的培养液，37℃的培养箱中培养；④标记在培养瓶写上“消化”，写上姓名和学号。
（二）动物细胞的传代培养①取已长成单层HeLa细胞的培养瓶，倒掉培养液，加入3管消化液，37℃条件下消化2-5min，在显微镜下观察细胞单层出现缝隙，倒去消化液，停止消化；②加入3-4管培养液，用弯头吸管反复吹打壁上的细胞层（尽量不形成气泡），添加2-4管培养液；③用吸管吸取一半左右细胞悬液，分装到另一个培养瓶中；④作标记，注明细胞代号、日期和操作者姓名；⑤37℃静置培养，24小时后即可观察。
解剖小白鼠实验
实验步骤
动 物 细 胞 原 代 培 养 过 程 图
方法与步骤
（1）动物拉椎处死 （2）取肝及剪碎：剖开腹部，将肝脏取出，放
入小培养皿中，用PBS液洗涤1次；将肝剪成 1mm大小的块，再用PBS液洗涤2次，直到液体 澄清。
（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的 组织放入试管内，加入的0.25％胰蛋白酶 液，完全没过组织，置37℃水浴中消化 20 ～ 30min，每隔10min摇动一次，直到 组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白 色为止。取出试管，吸去胰蛋白酶液，加 入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块， 使其分散成细胞悬液，取上清液至另一试 管中。
倒置显微镜
自动双重纯水蒸馏器 纯水仪
培养板
培养瓶
实验材料
2月龄的小鼠
实验试剂
（1） 1640-RPMI培养液 （2） 小牛血清 （3） 青、链霉素 （4） PBS液 （5） 5％NaHCO3 （6） 75％酒精
实验步骤
一、培养前的准备工作
（1） 清洗与消毒 （2） 配制溶液 （3） 紫外线消毒 （4） 洗手和着装 （5） 进入无菌室
滤器
滤器工作原理
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。
使用CO2培养箱应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松， 以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90℃ ，14 h)。
③箱内无菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以 保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
（4）观察与计数：从细胞悬液中取出1 滴滴于载玻片上，显微镜下观察细胞的 数目。看到球型的细胞，证明消化下来 细胞，实验成功。
作业:
1.在细胞培养过程中如何防止污染?
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实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养
引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2 或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
细胞培养的意义 :具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
1.实验材料：
实验室购买的雄性小鼠、 13.5 天孕鼠。
DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCI 8.00g, Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH 2P04 0.20g，pH 调至 7.2，超纯水定容到 1000mL，分装，121 C灭菌20 min）
2. 实验步骤：
2.1 处死小鼠
用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或怀孕雌鼠尾巴中部放在铁笼上, 使小鼠前肢接触铁笼（后肢悬空）,左手从小鼠后方向前按住鼠头及颈部。
左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部, 同时右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方, 造成颈椎脱臼，造成小鼠立
即死亡。
当小鼠停止抽搐，松开左手。
将整个小鼠浸入盛有 75% 乙醇的烧杯中。
2.2 解剖小鼠
将雄性小鼠或怀孕雌鼠从烧杯中移入超净台取出后放在无菌大平皿中，用碘酒棉球消毒腹部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。
用镊子提起腹部皮肤，剪刀剪开皮肤，打开腹腔，将剪开的皮肤分别拉向两边。
观察小鼠内脏器官。
2.3 小鼠肾细胞培养
用镊子及剪刀，剪开腹腔。
取出肾脏，置于无菌培养皿中，加入少量 PBS 洗液。
换眼科剪及镊，将肾膜剪破，去掉肾膜、脂肪及肾盂。
将肾组织转移于另一无菌培养皿，换弯头眼科剪，将肾组织剪碎至约 1 立方毫米大小，加入 PBS 洗液洗涤，吸掉洗液，重复数次，直到洗液澄清、无血球为止。
用大口径枪头将上述组织液转移至 50ml 离心管。
静止 1 分钟，换小口径枪头吸掉洗液。
④按组织总体积的10倍量加入0.25%胰蛋白酶液，置于37C水浴酶解消化60 分钟左右。
每隔 5 分钟摇动一次。
⑤从水浴中取出，吸掉弃去胰蛋白酶液，向离心管加入 5毫升DMEM培养液反复吹打组织块至细胞悬液。
⑥吸取少量细胞悬液，用血球计数板进行计数。
根据上述计数结果，调整细胞终浓度至每毫升含30〜50万个细胞进行分瓶培养。
一周内每天观察细胞培养情况、拍照。
3. 结果与讨论
第一天：小鼠肾细胞浓度 1:3
第二天：
小鼠肾细胞浓度1:1
小鼠肾细胞浓度1:2
小鼠肾细胞浓度1:3
第四天：
小鼠肾细胞浓度1:1
小鼠肾细胞浓度1:2
小鼠肾细胞浓度1:3
2007 年
实验结论讨论：第一天小鼠肾细胞浓度1:1和1:2的培养瓶颜色由红色变为 黄色，我们推测为细胞浓度太高而培养基内营养物质耗尽， 但是第二天之后变色
的培养瓶又变回了原本的红色，但是不清楚原因是什么。
虽然我们组没有第三天 的图片，不过从第二天和第四天可以明显看出小鼠肾细胞的生长轨迹。
不过通过 第一天到第四天的图片可以看出小鼠肾细胞浓度
1:1的培养瓶内无法找到明确 的细胞，浓度太高营养物质耗尽细胞死亡，而小鼠肾细胞浓度 1:2的培养瓶虽 然中途变过色，但是从第四天的观察来看，该培养瓶内有细胞生长，说明细胞没 有死亡，但不清楚培养基中途变色的原因，猜测可能是刚开始的时候培养瓶的盖 子拧太紧而导致细胞缺氧。
而小鼠肾细胞浓度1:3从第一天到第四天的图片对比 可看出小鼠肾细胞在1:3的浓度下能够正常生长，而且第四天小鼠肾细胞已经分 散,细胞明显。
因此可以得出结论1:3的浓度更加适合小鼠肾细胞的原代细胞培 养，而1:1的细胞浓度太高营养物质太快耗尽而容易导致细胞死亡。
参考文献：吴国娟，杨明，小数肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定，解剖学报,
12月，第38卷，第6期。