SDS-聚丙烯酰胺凝胶法测定降纤酶纯度2
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量解析
【实验步骤及操作方法】
1.安装垂直板电泳槽 将密封胶条放在平直玻璃板上，将凹形
玻璃板与 平直玻璃板重叠。 用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。 用蒸馏水检漏
2.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3）：取 Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去离子水 溶解后定容至1L。
3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白 质）：取SDS0.1g，巯基乙醇0.1mL，甘油 1.0mL，溴酚蓝28.8g，0.2mol/L磷酸缓冲液 0.5mL，加重蒸馏水至10mL。
【试剂配制】
4. 染 色 液 ： 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R-250 ， 加 入 454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。
5.脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇 6.10% 过 硫 酸 钠 、 10%SDS 、 1% 四 甲 基 乙 二 胺
（TEMED）
【实验材料及预处理】
蛋白质相对分子质量的测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
【实验目的】
• 理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本操
作 • 学会绘制标准曲线。
【实验原理】
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉双 丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的 凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置 药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。
因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标 准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标 准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质 量。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分离技术。
它是利用SDS（十二烷基硫酸钠）将蛋白质分子的电荷中和，使其按照分子量大小进行分离的一种凝胶电泳方法。
在SDS-PAGE实验中，首先需要将待测蛋白质样品加入SDS样品缓冲液中，然后将其煮沸，使其完全变性。
SDS样品缓冲液含有SDS，可以将蛋白质中的三级结构全部破坏，并且SDS还可以将蛋白质分子的电荷中和，使其带有同样的负电荷。
接下来，将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中，让蛋白质分子在电场作用下向电极移动，根据分子量大小在凝胶中进行分离。
最后，可以通过染色或Western blot等方法检测分离出的蛋白质。
SDS-PAGE方法具有分离效率高、准确度高、操作简单等优点，被广泛应用于生物化学、分子生物学、生物工程等领域的蛋白质分离和纯化。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
实验目的：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分离蛋白质并测定分子量。
实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种分离蛋白质的标准方法，可对不同来源和大小的蛋白质进行分离和鉴定。
在本实验中，通过将蛋白质溶解于含有SDS和2-巯基乙醇等条件下的试样缓冲液中，以使蛋白质带有几乎相同的负电荷，通过电泳使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中以大小不同的分子量在电场作用下移动，最终被染色，进行分离鉴定。
实验步骤：
1.准备实验材料：SDS-PAGE电泳装置、试样缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质样品、电泳缓冲液等。
2.制备SDS-PAGE电泳凝胶：按照说明书，将聚丙烯酰胺凝胶拆封并放置在实验室温度下一段时间，使其柔软。
3.制备电泳缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、glycine和SDS等物质，配制电泳缓冲液，使其达到所需浓度。
4.制备试样缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、SDS和2-巯基乙醇等物质，配制试样缓冲液。
5.制备样品：取适量的蛋白质样品，在试样缓冲液中煮沸一段时间，使蛋白质分子展开。
6.装样：将制备好的样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳装置样品槽中。
7.电泳：按照说明书，调整电泳缓冲液pH值和电泳电压等条件，开启电泳装置，进行电泳操作。
8.染色：将电泳板取出，进行荧光染色或银染色法。
9.图像处理：使用图像分析系统或其他软件，进行蛋白质条带的分析和图像处理。
实验结果：经过SDS-PAGE电泳后，样品中的蛋白质在凝胶中呈现出大小不同的分子量条带，通过荧光染色或银染色可以清晰地看到分离的蛋白质条带。
根据蛋白质的分子量大小，可以判断样品中含有哪些蛋白质。
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析-实验方法
一、原理细菌体中含有大量蛋白质,具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色,可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量,可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29.0g,亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g,混匀后加ddH2O,37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10´电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g,甘氨酸18.8 g,10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵(AP)：1gAP加ddH2O至10ml。
7、2´SDS 电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml,b-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6 g,甘油 2.0ml,0.1%溴酚兰 1.0ml,ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g,甲醇225ml,冰醋酸46ml,ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置(一)聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%)的配制: ddH2O 4.0ml 30%储备胶 3.3ml 1.5M Tris-HCl 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% AP 0.1ml 取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间,以水封顶,注意使液面平。
最新实验 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合蛋白质
实验电泳法——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合蛋白质【实验目的】1.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理。
2.熟悉并掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和常规操作。
【实验原理】1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N’,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂和引发剂作用下，聚合交联而成，具有网状结构的凝胶。
以此为支持物，可以对蛋白质或核酸等大分子物质进行电泳分离。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳根据蛋白质分子或其它生物大分子所带电荷的差异及分子大小的不同对不同组分进行分离。
然而，有时两个分子量不同的蛋白质，由于分子大小的差异被电荷的差异所补偿，最终以相同的泳动速度向阳极移动，不能达到分离的目的。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)就是设法将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略而不计的程度。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质的疏水相互作用，造成蛋白质三级结构的解体。
由于SDS带有负电荷，使SDS-蛋白质复合物带有相同密度的负电荷，带电量远远超过了蛋白质分子本身的电荷，因而掩盖了不同蛋白质分子本身电荷的差别。
【实验步骤】按下表配方制备凝胶：→将12％的分离胶（10毫升）加入玻璃板之间，缓慢加入蒸馏水密封，待胶凝固→倒掉上层水，加入5％浓缩胶（5毫升），插入样品梳，室温放置，待聚合反应完成→制备样本→小心取出样品梳，取预先制备好的样品10uL，缓慢加入点样孔中→按图所示安装电泳槽，加入适量电泳缓冲液：→恒压电泳约1小时，至指示剂到达胶板底部时停止电泳→卸开电泳槽，撬开玻璃板，小心取出凝胶，剥离分离胶→将凝胶放置在培养皿中，加入染色液浸没凝胶，脱色摇床摇晃30分钟后观察【实验结果】如图所示：┸【讨论与分析】Mark 各种混合蛋白质╭────┸────╮1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理？答：①聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
实验四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
7）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按 1:1体积比加入上样缓冲液，在100℃加热5分钟以使蛋白质 变性。 8）浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶 固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。
※要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。
1）把胶放入塑料盒中，加入银染固定液约3～5倍的体积， 没过凝胶，在摇床上慢速振荡30min。
2）蒸馏水洗胶3次，每次2min。
3）转移凝胶到银染溶液中，注意：37%甲醛0.5mL在使 用前才能加入。摇床上慢速振荡染色30 min。 4）转移凝胶到10℃以下的蒸馏水中振荡洗涤10sec 。
掌握垂直板电泳的操作方法。
运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二、实验原理
带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种 现象称为电泳。
区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层 样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介 质中迁移。 支持介质的作用：防止机械干扰和由于温度变化以及 大分子溶液的高密度而产生的对流。
滤纸 微量注射器 大培养皿
四、实验要求
根据老师提供的蛋白质样品，先查阅资料，按
其分子量选择合适的凝胶浓度进行SDS-PAGE 凝胶电泳，选择考马斯亮蓝或银染法进行染色，
测定样品的分子量和纯度情况。
样品1：蔗糖酶 样品2：肌酸激酶（从中华鳖肌肉中提取） 样品3：牛血清白蛋白 样品4：酪氨酸酶（从双胞蘑菇中提取）
聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应
单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis） 催化剂：过硫酸胺 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）
降纤酶SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳操作规程
降纤酶SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳操作规程目的：建立降纤酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作规程，保证正确操作。
2. 依据：中华人民共和国卫生部标准（试行）（97）卫药标字01号。
3. 范围：适用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定降纤酶分子量及纯度的操作。
4. 职责：QC检验员对本标准的实施负责。
5. 程序：5.1. 定义：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量，是根据大多数蛋白都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应，使蛋白分子相对迁移率（Rf）的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
5.2. 仪器装置：由稳压电泳仪和垂直板电泳槽组成。
5.3. 试剂与仪器：β-巯基乙醇、丙烯酰胺、N，N ′—亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠（SDS）、溴酚蓝、甘氨酸、过硫酸铵、三氯醋酸、甲醇、考马斯亮蓝R-250、甘油、盐酸、醋酸、四甲基乙二胺。
烧杯、刻度吸管、微量移液器。
5.4. 溶液的配制：5.4.1.丙烯酰胺—N，N′—亚甲基双丙烯酰胺贮备溶液：称取丙烯酰胺29.2g。
N、N′—亚甲基双丙烯酰胺0.8g，加水溶解，并稀释至100ml，过滤至棕色瓶中，4℃保存。
5.4.2.三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加水溶解，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至8.8，加水稀释至100ml，4℃保存。
5.4.3.三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH6.8）：量取上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8）适量，加水（1：3）稀释，用2mol/L盐酸液调节pH值至6.8，4℃保存。
5.4.4.10%十二烷基硫酸钠溶液：称取十二烷基硫酸钠10g，加水溶解，并稀释至100ml，室温保存。
5.4.5.供试品缓冲液：水 4.8ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液(6.8) 1.2ml甘油 1.0ml10%SDS溶液 2.0ml0.5%(W/V)溴酚蓝溶液0.5mlβ-巯基乙醇0.5ml总体积10.0ml5.4.6.电极贮存液（pH8.3）：称取三羟甲基氨基甲烷15g，甘氨酸72g，SDS5g，加水溶解，并稀释至1000ml，4℃保存。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
实验名称：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1. 了解SDS-PAGE实验的原理和方法；2. 掌握SDS-PAGE实验的操作流程；3. 分析不同蛋白质在SDS-PAGE中的分离情况；4. 对实验结果进行解读和总结。
二、实验原理SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
其原理是利用SDS将蛋白质变性并赋予等电点，将蛋白质按照分子量大小在凝胶中进行分离。
通过电泳操作，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，最终形成不同的条带，便于观察和分析。
三、实验步骤1. 准备样品：获取需要分析的蛋白质样品，并进行处理使其可以被SDS-PAGE分离；2. 制备凝胶：根据实验需要，配置聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶板中固定好；3. 样品加载：将处理好的蛋白质样品加载到凝胶槽中；4. 电泳分离：在设定好电压和时间的条件下，进行电泳操作，使蛋白质在凝胶中分离；5. 染色观察：将分离后的蛋白质用染色剂染色，然后观察分离的条带；6. 结果分析：根据实验结果，进行蛋白质的分析和解读。
四、实验材料与仪器1. 样品：蛋白质样品；2. 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶；3. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳的设备；4. 电源：用于提供电泳操作所需电压的电源设备；5. 染色剂：用于染色观察蛋白质条带的染色剂。
五、实验结果与分析经过SDS-PAGE实验操作，观察到样品中不同蛋白质在凝胶中的分离情况。
根据不同分子量的蛋白质在凝胶中形成了明显的条带，条带的位置和密度反映了样品中蛋白质的分布情况。
通过染色观察和数据分析，可以得出样品中蛋白质的组成和含量。
六、实验结论SDS-PAGE实验是一种重要的蛋白质分析方法，通过实验操作可以对蛋白质样品进行分离和分析，从而了解样品的蛋白质组成和特性。
本次实验结果表明，SDS-PAGE可以有效地对蛋白质样品进行分离，为后续的分析和研究奠定了基础。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中.SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比.在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml):0。
6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周,或在－20℃保存数月。
2。
凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0。
8g，加重蒸水溶解后,定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月.3。
pH8。
9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8。
9，定容至100ml，4℃保存。
4。
pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH6。
7，定容至100ml，4℃保存.5。
TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8。
3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7。
5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul)在一个Eppendorf 管中混合。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶
蛋白带迁移距离 R f= ————————
溴酚蓝迁移距离
• 2.作图
•
以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，
• Rf为横坐标绘图
3.通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标准曲线上 • 读出他的分子量
*a.标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2—0.8之间均匀分布.
•
吸附位点,使探针与印迹反应,且不吸附到
•
载体上,此过程称为封闭.
• 封闭目的:使印迹结果背景干净,印迹的斑点或谱
•
带更为清晰.
• *第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
• 抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴 极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。此阶段分离效果肉眼不 可见(只有在染色后才显出电泳区带)。
• 2.封闭:保持膜上没有特殊抗体结合的场所,使场所处于饱
•
和状态,用以保护特异性抗体结合到膜上并与蛋白
•
质反应.
• 3.初级抗体(第一抗体):特异性
• 4.第二抗体或配体试剂:与一抗特异性结合并作为指示剂
• 5.显色
• 封闭：用一种与待测物不反应的物质(如蛋白质、
•
tween 20等)封阻载体印迹区域以外的剩余
• 不同蛋白质的SDS复合物的m0值都很接近，分子量相 • 差5倍的蛋白质之间，m0值只相差10%，如果忽略这个差 • 别,就可以认为，各种蛋白质-SDS复合物的m0基本上是 • 一个定值。这表明，不同蛋白质的SDS复合物都带有相 • 同密度的负电荷，并具有同样的构象它们的净电荷量与 • 摩擦系数(f由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决 • 定)之比（q/f）都接近于一个定值而不受各种蛋白质原来 • 电荷、分子大小和形状的影响，因而，在溶液中，自由迁 • 移率就表现出一致性；但在一定浓度的凝胶中，由于引入 • 凝胶的分子筛效应，电泳迁移率mR就成为蛋白质分子量 • 函数.
SDS-聚丙烯酰胺凝胶法测定降纤酶纯度2
目录中文摘要 (1)Abstract (1)引言 (1)1 材料和方法 (2)1.1电泳试剂 (2)1.2 仪器 (2)1.3 试剂的配置及存放 (2)1.3.1 丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备溶液（Acr-Bis液） (2)1.3.2 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8） (2)1.3.3 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH6.8） (2)1.3.4 10%十二烷基硫酸钠溶液 (2)1.3.5 样品缓冲液 (2)1.3.6 2倍电极贮备液（pH8.3） (3)1.3.7 100g/L过硫酸铵溶液(即10%AP临用前配制） (3)1.3.8 N,N,N',N'—四甲基乙二胺（TEMED）成品液 (3)1.3.9 固定液 (3)1.3.10 染色液 (3)1.3.11 脱色液 (3)1.3.12 保存液 (3)2 实验设计 (3)2.1 分离胶的配置 (3)2.2 浓缩胶的配置 (3)2.3 标准品与样品的制备 (3)2.3.1 标准蛋白溶液 (3)2.3.2 样品溶液 (4)2.4 电泳 (4)2.5 染色和脱色 (4)2.6 将电泳板拍照保存 (4)2.7 实验改进 (4)2.7.1 试剂的配置调整方法 (4)2.7.1.1 样品缓冲液配置调整 (4)2.7.1.2 电极贮备液配置调整 (5)2.7.1.3 pH6.8的浓缩胶缓冲液的替代 (5)2.7.2电泳电压数值的确定 (5)2.7.3染色脱色方法的改进 (6)3 实验讨论 (7)3.1电泳仪漏液问题 (7)3.2出现的异常现象总结 (7)3.2.1 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡 (8)3.2.2 “微笑”（两边翘起中间凹下）形带产生原因 (8)3.2.3 “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带产生原因 (8)3.2.4 出现拖尾现象 (8)3.2.5 带出现纹理现象 (8)3.3总结 (9)致谢 (10)参考文献 (11)SDS-聚丙烯酰胺凝胶法测定降纤酶纯度的条件初探食品科学与工程专业李玉敬指导教师姜新杰摘要：蛇毒蛋白对抑制血栓形成和溶解血栓具有较好的疗效，但由于得不到性质稳定、组分单一的酶蛋白，影响了其临床效果。
生物化学实验十一 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测
实验十一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子质量一、目的要求学习和掌握采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子质量的基本原理和方法。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合交联形成的三围网状结构。
通过改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例可以控制凝胶孔径的大小，这取决于两个重要的参数T和C，其中T是两个单体（Acr和Bis）的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分浓度。
T=（a+b）/m×100(%) C=b/(a+b)×100(%)式中，a为Acr质量（g）；b为Bis质量（g）；m为水或缓冲液的终体积（mL）。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续系统两种。
在连续系统中，电泳槽中缓冲液的pH与凝胶中一致，而在不连续系统中上述两者的pH不相同，不连续系统的分辨率较高。
从凝胶形式上可分为柱式或板式。
将凝胶装于垂直的玻璃管中进行电泳分离称柱式电泳，此法制备凝胶方便，样品需要量少，凝胶条便于长期保存；板式电泳的优点是可以在同一凝胶板上同时检测盒比较多个样品，在平板电泳的基础上还建立了分辨率更高的双向电泳。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统具备三种效应，因此大大提高了分辨率。
(1)浓缩效应：在电泳开始时，样品在浓缩胶与分离胶界面上形成了高度压缩的薄层，作为在分离胶中进一步分离的起始样层，有时甚至能浓缩几百倍。
(2)电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带。
由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。
(3)分子筛效应：当蛋白质分子通过浓缩胶进入分离胶时，颗粒小、呈球形的样品分子移动快，柯利达、形状不规则的分子在通过凝胶空洞时的阻力大，移动就缓慢。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质分子的主要极力为上述的电荷效应和分子筛效应，即这些分子所带净电荷的差异和分子质量大小的不同。
《中国药典》2020版—SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
《中国药典》2020版—SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法0541电泳法第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法适用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂(1)水 (去离子水，电阻率不低于18.2MΩ?cm)。
(2)分离胶缓冲液（4×，A液）：1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调pH 值至8.8, 加水稀释至100ml。
(3)30%丙烯酰胺溶液（B液）：称取丙烯酰胺58.0g、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200ml，滤纸过滤(避光保存)。
(4)10%SDS溶液（C液）：称取十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至100ml。
(5)四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）：商品化试剂，通常浓度为10%的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。
(6)10%过硫酸铵溶液（E液）：称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100ml。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
(7)浓缩胶缓冲液（4×，F液）：0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100ml。
(8)电极缓冲液（10×）：称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g ，加水溶解并稀释至约800ml，用盐酸调pH值至8.1-8.8之间，加水稀释至1000ml。
(9)非还原型供试品缓冲液（4×）：称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀释至约80ml，用盐酸调节至pH6.8，加水稀释至100ml。
-肠激酶酶活及纯度检测-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
附录A（规范性附录）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳A.1原量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的分离原理，是依据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。
A.2仪器设备A.2.1电泳装置，符合YY/T0087的要求。
A.2.2凝胶薄层扫描仪。
A.3试剂除非另有规定，本方法使所用的试剂均为分析纯，水为GB/T6882规定的三级水。
A.3.1A液1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加水稀释至100mL。
A.3.2B液30%丙烯酰胺溶液-0.8%N，N´-亚甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。
A.3.3C液1%十二烷基硫酸钠溶液。
A.3.4D液10%N，N，N´，N´-四甲基乙二胺。
A.3.5E液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
A.3.6F液0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
A.3.7电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠lg，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.3，加水稀释至1000mL。
A.3.8供试品缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷0.303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠0.8g，量取盐酸0.189mL、甘油4mL，加水溶解并稀释至10mL。
该缓冲液用于非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
如用于还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加β-巯基乙醇2mL。
A.3.9固定液称取三氯醋酸5g，加水200mL溶解后，加甲200mL，再加水至500mL。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法——蛋白质的分子量测定
【实验目的】1.掌握SDS-聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl 或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴2mol/L Tris-HCl （pH8.8）：取24.2g Tris，加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵1mol/L Tris-HCl （pH8.8）：取12.1g Tris，加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定不同蛋白质产品的纯度
聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定不同蛋白质产品的纯度一、基本原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成，具有三维网状结构，能起分子筛作用。
用它作电泳支持物，对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。
此外，凝胶电泳由于体系的不连续性，具有独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离效应用凝胶电泳分离血清样品时，除了与纸电泳一样具有电荷效应外，还有浓缩效应（不连续电泳发生于浓缩胶中）和分子筛效应（发生于分离胶中），故其分辨率比纸电泳高。
1、浓缩效应当样品胶和浓缩胶选用pH6.7Tris/HCI 缓冲液、电极液选用pH8.3Tris/甘氨酸缓冲液时，在电泳的开头，盐酸几乎全部解离释放出氯离子（Cl -），甘氨酸（pl 为6.0、pKa ’为2.34，pKa ”为 9.7）则只有1%～0.1%解离释放出甘氨酸根离子（NH 2-CH 2-COO -），而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离为带负电荷的离子。
这三种离子带有相同类型的电荷，并同时向正极移动，其有效泳动率按如下次序排列：-----∙〉∙〉∙-gly gly protein protein Cl a m am a m式中m 代表泳动率，a 代表解离度，ma 代表有效泳动率。
根据有效泳动率的大小区分，把最快的Cl -称为快离子（又称前导离子）；把最慢的 gly -称为慢离子（又称尾随离子）。
在电泳刚开始时，三层凝胶（样品胶、浓缩胶和分离胶）中都含有快离子，只是电极缓冲液中含有慢离子。
电泳进行时，由于快离子的泳动率最大，因此很快超过蛋白质，于是在快离子后边形成一离子浓度低的区域，即低电导区。
电场强度与电导成反比关系：ηIE =(伏/厘米)式中E 代表电场强度，l 代表电流强度，η代表电导率。
因此，在低电导区就产生了较高的电场强度。
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目录中文摘要 (1)Abstract (1)引言 (1)1 材料和方法 (2)1.1电泳试剂 (2)1.2 仪器 (2)1.3 试剂的配置及存放 (2)1.3.1 丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备溶液（Acr-Bis液） (2)1.3.2 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8） (2)1.3.3 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH6.8） (2)1.3.4 10%十二烷基硫酸钠溶液 (2)1.3.5 样品缓冲液 (2)1.3.6 2倍电极贮备液（pH8.3） (3)1.3.7 100g/L过硫酸铵溶液(即10%AP临用前配制） (3)1.3.8 N,N,N',N'—四甲基乙二胺（TEMED）成品液 (3)1.3.9 固定液 (3)1.3.10 染色液 (3)1.3.11 脱色液 (3)1.3.12 保存液 (3)2 实验设计 (3)2.1 分离胶的配置 (3)2.2 浓缩胶的配置 (3)2.3 标准品与样品的制备 (3)2.3.1 标准蛋白溶液 (3)2.3.2 样品溶液 (4)2.4 电泳 (4)2.5 染色和脱色 (4)2.6 将电泳板拍照保存 (4)2.7 实验改进 (4)2.7.1 试剂的配置调整方法 (4)2.7.1.1 样品缓冲液配置调整 (4)2.7.1.2 电极贮备液配置调整 (5)2.7.1.3 pH6.8的浓缩胶缓冲液的替代 (5)2.7.2电泳电压数值的确定 (5)2.7.3染色脱色方法的改进 (6)3 实验讨论 (7)3.1电泳仪漏液问题 (7)3.2出现的异常现象总结 (7)3.2.1 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡 (8)3.2.2 “微笑”（两边翘起中间凹下）形带产生原因 (8)3.2.3 “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带产生原因 (8)3.2.4 出现拖尾现象 (8)3.2.5 带出现纹理现象 (8)3.3总结 (9)致谢 (10)参考文献 (11)SDS-聚丙烯酰胺凝胶法测定降纤酶纯度的条件初探食品科学与工程专业李玉敬指导教师姜新杰摘要：蛇毒蛋白对抑制血栓形成和溶解血栓具有较好的疗效，但由于得不到性质稳定、组分单一的酶蛋白，影响了其临床效果。
本实验在国家药品监督管理局国家药品标准的基础上进行了改进，主要针对电泳试剂的配置及浓缩胶和分离胶的配方、电泳电压、染色脱色方法的改进，使得分离胶的凝结时间由50分钟缩短为35分钟，浓缩胶凝结时间由35分钟缩短为20分钟，改进后，分离效果明显优于国标方法，得到了组分单一的酶蛋白，图谱更加清晰。
关键词：降纤酶；SDS-聚丙烯酰胺凝胶；纯度TO Study the Conditions of SDS-PAGE Determination ofDefibrase PurityStudent majoring in Food Science and Engineering Li YujingTutor Jiang XinjieAbstract：Snakes poisonous protein to hold the blood clots forming and dissolve blood clots to be effective, but with the nature of a stable and composition; the clinical effect. the experiment at thenational drug administration of state medical standards on the basis of improved. electrophoresisreagents for the configuration and a recipe, electrophoresis voltage, and stain out of the improvement of separation of condensation time from 50 minutes to 35 minutes, as a time by, condensed into 20 minutes, 35 minutes. Stain off the color spectrum is more clear.To improve the SDS-PAGE initial survey the defibrase for: the configuration and deposit of Reagents , formuLa of stock gel and separation gel, solutions of different problems.Key words: defibrase;SDS- PAGE; purity引言蛇毒是毒蛇的毒腺分泌出来的一种液体，主要成份是毒性蛋白质，约占干重的90～95%。
其中酶类和毒素约含二十多种[1-3]。
此外，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳去离子水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等[4]。
蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具特点。
蛇毒是毒蛇分泌出来的一种含有多种酶类的毒性蛋白质、多肽类物质，也是毒蛇咬人后引起中毒反应的物质。
新鲜的蛇毒为略带腥味的蛋清样粘稠液体，呈黄色、淡黄色、绿色，甚至无色[5-6]。
蛇毒有很好的医疗作用如：治癌作用、抗凝作用、止血作用、镇痛作用等。
在实际生产中SDS-聚丙烯酰胺凝胶法是常用的检测蛋白纯度的方法，在国标的基础上改进出合适的实验条件，为生产中蛋白质（降纤酶）的检测提高了效率。
由国家卫生部批准用于临床的降纤酶系由长白山白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇蛇毒中提取的蛋白水解酶[5]蛇毒中含有大量的降纤酶。
为了保证临床使用安全和减少毒副反应，卫生部强调生产过程中一定要有严格的质量控制和纯度鉴定手段。
为此，规定了一种快速电泳法来确定提取的降纤酶中是否含有杂质。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂[6-7]，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS～蛋白质复合物[8]，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块[9]，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：LogMW=K-bX[10]，式中：MW 为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，随着分子质量的增加，迁移速率也在增加[11]。
SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用[12]：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；N,N,N',N'—四甲基乙二胺（TEMED）与过硫酸铵（AP）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS阳离子去污剂），作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用去多肽折叠[13]。
1 材料1.1 电泳试剂双丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、十二烷基硫酸钠、甘油、溴酚蓝溶液、β-巯基乙醇、甘氨酸、过硫酸铵、三氯醋酸、甲醇、考马斯亮蓝R250、冰醋酸（以上试剂为分析纯）低分子量标准蛋白质：六种（14400，20100，31000，43000，66000，97400）万科生产1.2 仪器wi188275电泳仪，东西仪（北京）科技有限公司；DCL-1800CY电磁炉，万怡微；YDR1-PHS81UF00pH计，中西制造；81M/DK-S26电热恒温去离子水浴锅，北京中西生产；SF1WA-1A微量进样器，云南昆明西化仪；1～1000 uL移液枪，Labnet生产;1.3 试剂的配置及存放1.3.1 丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备溶液（Acr-Bis液）：取丙烯酰胺29.2g，双丙烯酰胺0.8g，加去离子水溶解并稀释至100mL，过滤至棕色瓶中，4℃保存。
注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中，称重时注意周围空气流速，称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双丙烯酰胺掩盖。
玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并扩散到空气中。
完全溶解的溶液应清澈无色透明。
待溶解完全后补加双蒸水至100 mL，转入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱可保存10个月。
1.3.2 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8）：取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加去离子水溶解，用2moL/L盐酸溶液调节pH值至8.8，加去离子水稀释至100mL，4℃保存。
1.3.3 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH6.8）：取上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8）适量，加去离子水（1：2）稀释，用2moL/L盐酸溶液调节pH值至6.8，4℃保存。
1.3.4 10%十二烷基硫酸钠溶液：取十二烷基硫酸钠10g，加去离子水溶解并稀释至100mL，室温保存。
1.3.5 样品缓冲液：取去离子水4.8mL，三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH6.8）1.2mL，甘油1.0mL，10%十二烷基硫酸钠2.0mL，0.5%（W/V）溴酚蓝溶液0.5mL,β-巯基乙醇0.5mL混匀，4℃保存。
1.3.6 2倍电极贮备液（pH8.3）：取上述三羟甲基氨基甲烷15g，甘氨酸72g，十二烷基硫酸钠5g，加去离子水溶解并稀释至1000mL，4℃保存。
临用前5倍稀释。
1.3.7 100g/L过硫酸铵溶液(即10%AP临用前配制）：2g过硫酸铵加20mL双蒸去离子水，倒入无色塑料试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存10个月。
1.3.8 N,N,N',N'—四甲基乙二胺（TEMED）成品液购买后为避免母液受到污染分装成2或5mL小管。
1.3.9 固定液：取三氯醋酸5g，加去离子水200mL溶解，加入甲醇200mL，再加去离子水至500mL。
1.3.10 染色液：取考马斯亮蓝R250 0.5g，溶于200mL去离子水中，量取甲醇200mL、冰醋酸50mL，再加去离子水至500mL。
1.3.11 脱色液：取甲醇400mL，醋酸100mL，加去离子水至1000mL，充分混合。
1.3.12 保存液：取甲醇400mL，醋酸100mL、甘油100mL，加去离子水至1000mL，充分混合。
2．实验设计2.1 12%分离胶的制备取去离子去离子水3.35mL，三羟甲基甲烷缓冲液（pH8.8）2.5mL，10%十二烷基硫酸钠100µL，丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备液4.0mL，混匀，脱气15分钟后，再加入10%过硫酸铵溶液50µL，四甲基乙二胺5µL，充分混匀，立即小心地倒入制胶模具中，在胶面上覆盖一层去离子水，水平静置至胶体凝固。