脂糖纤-3-1
雷公藤红素对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的抑制作用及其机制
雷公藤红素对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的抑制作用及其机制刘旭，杨胜荣，王希敏天津市南开医院，天津300010摘要：目的观察雷公藤红素对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响，并探讨其作用机制。
方法用脂肪细胞诱导培养基培养3T3-L1细胞，分别给予0、0.2、0.3、0.4、0.5µmol/L的雷公藤红素处理48h，CCK8检测细胞增殖能力。
以0、0.3µmol/L的雷公藤红素作用于3T3-L1细胞，采用油红O染色法观察3T3-L1细胞成脂分化情况、细胞中脂质累积情况。
分别采用RT-PCR法和Western blotting法检测3T3-L1细胞中的CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体g2（PPARg2）、脂肪酸蛋白4（FABP4）的mRNA和蛋白。
利用在线药物靶点预测软件Swiss Target Predication分析雷公藤红素的潜在作用靶点并验证。
结果0.3µmol/L以上剂量的雷公藤红素作用后细胞增殖能力明显减弱。
0.3µmol/L雷公藤红素作用后，3T3-L1细胞中脂质累积明显减少，C/EBPα、PPARg2、FABP4mRNA及蛋白相对表达量均降低（P均<0.05）。
PTPN11可能是雷公藤红素的潜在作用靶点，雷公藤红素可在mRNA和蛋白水平下调PTPN11表达（P均<0.05）。
结论雷公藤红素可抑制前脂肪细胞3T3-L1成脂分化，其机制与下调PTPN11表达、抑制脂肪生成相关蛋白信号通路有关。
关键词：雷公藤红素；前脂肪细胞；成脂分化；PTPN11doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.08.007中图分类号：R965文献标志码：A文章编号：1002-266X（2021）08-0028-04Inhibition of celastrol on adipogenic differentiation of3T3-L1preadipocytesLIU Xu，YANG Shengrong，WANG XiminNankai Hospital，Tianjin300010，ChinaAbstract：Objective To investigate the effect of celastrol on the adipogenic differentiation in3T3-L1preadipocytes and to explore its potential mechanism.Methods The3T3-L1preadipocytes were cultured and treated with celastrol （0，0.2，0.3，0.4，and0.5µmol/L）for48h.The cell proliferation was measured by CCK-8assay.3T3-L1preadipo⁃cytes were treated with0and0.3µmol/L celastrol.The adipogenic differentiation and lipid accumulation of3T3-L1adipo⁃cytes were observed by oil red O staining.The gene expression levels of CCAAT/enhancer binding proteinα（C/EBPα），peroxisome proliferator-activated receptor（PPARg2），and fatty acid binding protein-4（FABP4）mRNA and protein were determined by RT-PCR and Western blotting，respectively.The potential targets of celastrol were analyzed and identified by Swiss Target Predication software.Results The cell proliferation ability decreased significantly after celastrol treat⁃ment at a dose of more than0.3µmol/L.After0.3µmol/L celastrol treatment，lipid accumulation in3T3-L1cells was significantly reduced，and the relative expression levels of C/EBPa，PPARg2，FABP4mRNA and protein all decreased （all P<0.05）.PTPN11might be a potential target of celastrol.Celastrol could down-regulate the expression of PTPN11 both at mRNA and protein levels.Conclusion Celastrol significantly inhibits cell proliferation and differentiation of3T3-L1preadipocytes through the down-regulating of PTPN11expression and inhibiting adipogenesis-related protein signaling pathways.Key words：celastrol；preadipocytes；adipogenic differentiation；PTPN112型糖尿病（T2DM）发病率呈逐年升高趋势，我国目前有超过1亿的成年糖尿病患者［1］。
miR-1405p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究
中国畜牧兽医2022,49(7):2631-2644C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n em i R-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究原佳慧,张鹏翔,吉树森,卢嘉茵,罗小毛,闫艺,王海东(山西农业大学动物医学学院,太谷030801)摘要:ʌ目的ɔ研究m i R-140-5p在前脂肪细胞(3T3-L1)成脂分化过程中的功能及其作用机制㊂ʌ方法ɔ待3T3-L1细胞汇合度达100%时诱导其成脂分化,收集分化第―1(诱导分化前1d)㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天的细胞,用实时荧光定量P C R检测m i R-140-5p相对表达量;将m i R-140-5p m i m i c s㊁N C转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,实时荧光定量P C R检测成脂标志基因C A A T增强子结合蛋白β(C/E B Pβ)㊁C A A T增强子结合蛋白δ(C/E B Pδ)与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(P P A Rγ)相对表达量;利用m i R a n d n和T a r g e t S c a n在线网站预测m i R-140-5p的靶基因;通过对比序列差异分析P300/C B P相关因子(P C A F)的3'-U T R序列中与m i R-140-5p的结合位点序列在小鼠㊁人等不同物种间的序列保守性㊂将m i R-140-5p m i m i c s㊁i n h i b i t o r㊁N C转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,实时荧光定量P C R检测m i R-140-5p㊁P C A F相对表达量,W e s t e r nb l o t t i n g检测P C A F蛋白水平;将P E G F P-N1-P C A F㊁P E G F P-N1转染3T3-L1细胞,油红O染色观察脂滴形成情况,实时荧光定量P C R检测P C A F㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因相对表达量,W e s t e r nb l o t t i n g检测C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ蛋白表达水平㊂将3条P C A F s i R N A(s i R N A1㊁s i R N A2㊁s i R N A3)㊁s i R N A N C转染3T3-L1细胞,W e s t e r nb l o t t i n g法检测P C A F蛋白水平,筛选最佳P C A Fs i R N A㊂将最佳P C A Fs i R N A和s i R N A N C转染3T3-L1细胞,油红O染色观察脂滴形成情况,实时荧光定量P C R检测P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ与P P A Rγ基因相对表达量,W e s t e r nb l o t t i n g检测C/E B Pβ㊁P P A Rγ蛋白表达水平㊂分别将m i R-140-5p m i m i c s㊁N C与P G L0-P C A F3'-U T R载体和P G L O空载体共转染293T细胞,用双荧光素酶报告试验检测m i R-140-5p与P C A F的靶向关系㊂ʌ结果ɔ在诱导3T3-L1细胞成脂分化过程中,与诱导分化前1d相比,在细胞成脂分化第1㊁2天时m i R-140-5p相对表达量极显著升高(P<0.01),在分化第3天时显著升高(P<0.05)㊂与N C组相比,m i R-140-5p m i m i c s组脂滴数量明显增加,m i R-140-5p m i m i c s组成脂标志基因C/E B Pδ与P P A Rγ相对表达量均极显著升高(P<0.01)㊂靶基因预测结果表明,m i R-140-5p与P C A F存在预期结合位点;保守性分析结果表明,靶基因P C A F结合位点序列在不同物种间具有高度保守性㊂与N C组相比, m i m i c s组m i R-140-5p和P C A F相对表达量均极显著升高(P<0.01),i n h i b i t o r组m i R-140-5p极显著降低(P<0.01)㊁P C A F显著降低(P<0.05),P C A F蛋白表达量显著升高(P<0.05)㊂与P E G F P-N1组相比,P E G F P-N1-P C A F组脂滴数量增多,P C A F㊁P P A Rγ基因相对表达量和C/E B Pβ㊁C/E B Pδ蛋白水平极显著升高(P<0.01), P P A Rγ蛋白水平显著升高(P<0.05)㊂P C A Fs i R N A1㊁s i R N A2与s i R N A3均极显著抑制P C A F蛋白的表达(P<0.01),s i R N A3的效果最显著,因此选择s i R N A3进行后续试验㊂与N C组相比,P C A Fs i R N A3组3T3-L1细胞中脂滴数量较少,P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因相对表达量和C/E B Pβ蛋白水平均极显著下降(P<0.01)㊂双荧光素酶报告试验结果显示,m i R-140-5p与P C A F基因之间无靶标关系㊂ʌ结论ɔ内源性m i R-140-5p在3T3-L1细胞分化过程中表达升高,m i R-140-5p可能通过间接上调P C A F基因表达促进3T3-L1细胞成脂分化㊂关键词:m i R-140-5p;P300/C B P相关因子;3T3-L1细胞;成脂分化中图分类号:Q254文献标识码:AD o i:10.16431/j.c n k i.1671-7236.2022.07.021开放科学(资源服务)标识码(O S I D):收稿日期:2021-12-31基金项目:山西省留学人员科技活动择优资助项目;山西省优秀人才科技创新项目(201805D211012)联系方式:原佳慧,E-m a i l:187********@163.c o m㊂通信作者王海东,E-m a i l:w a n g h a i d o n g@s x a u.e d u.c n2362中国畜牧兽医49卷M e c h a n i s mo fm i R-140-5p o nA d i p o g e n i cD i f f e r e n t i a t i o no f P r e a d i p o c y t e s3T3-L1 Y U A NJ i a h u i,Z H A N GP e n g x i a n g,J I S h u s e n,L UJ i a y i n,L U O X i a o m a o,Y A N Y i,WA N G H a i d o n g(C o l l e g e o f A n i m a lM e d i c i n e,S h a n x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,S h a n x i P r o v i n c e,T a i g u030801,C h i n a)A b s t r a c t:ʌO b j e c t i v eɔT h ea i m o f t h i ss t u d y w a st o i n v e s t i g a t et h ef u n c t i o na n d m e c h a n i s m o f m i R-140-5p i nt h ed i f f e r e n t i a t i o n o f p r e a d i p o c y t e s3T3-L1.ʌM e t h o dɔW h e nt h ec o n v e r g e n c e d e g r e eo f3T3-L1c e l l sr e a c h e d100%,t h ea d i p o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n w a s i n d u c e d.T h ec e l l so f d i f f e r e n t i a t i o nd a y―1(t h ed a y b e f o r ed i f f e r e n t i a t i o ni n d u c t i o n),d a y s0,1,2,3,5a n d7w e r e c o l l e c t e d,a n d t h e e x p r e s s i o n o fm i R-140-5p w a s d e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R.m i R-140-5p m i m i c s a n dN Cw e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s t o i n d u c e a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n.O i l r e d Os t a i n i n g w a su s e dt oo b s e r v e t h e f o r m a t i o no f l i p i dd r o p l e t s.R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R w a s u s e dt o d e t e c tt h er e l a t i v ee x p r e s s i o n so fa d i p o g e n i c m a r k e r g e n e s C A A T e n h a n c e rb i n d i n g p r o t e i nβ(C/EB Pβ),C A A Te n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i nδ(C/E B Pδ)a n d p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r-a c t i v a t e d r e c e p t o rγ(P P A Rγ).T h et a r g e t g e n eo f m i R-140-5p w a s p r e d i c t e db y m i R a n d na n d T a r g e t S c a no n l i n ew e b s i t e s,t h e s e q u e n c e c o n s e r v a t i o no f t h e b i n d i n g s i t e s e q u e n c e o f P300/C B P-r e l a t e d f a c t o r(P C A F)3'-U T Rs e q u e n c ea n d m i R-140-5p i nd i f f e r e n ts p e c i e ss u c ha s m i c ea n d h u m a n sw a sa n a l y z e db y c o m p a r i n g t h es e q u e n c ed i f f e r e n c e s.m i R-140-5p m i m i c s,i n h i b i t o ra n d N Cw e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s a n d t h e c e l l sw e r e i n d u c e d t o d i f f e r e n t i a t e i n t o a d i p o c y t e s. T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o fm i R-140-5p a n dP C A Fw a s d e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R,a n d t h e p r o t e i n l e v e l o fP C A F w a sd e t e c t e db y W e s t e r nb l o t t i n g.P E G F P-N1-P C A Fa n dP E G F P-N1 w e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s.O i l r e dOs t a i n i n g w a su s e d t oo b s e r v e t h e f o r m a t i o no f l i p i d d r o p l e t s.R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R w a s u s e dt o d e t e c tt h er e l a t i v ee x p r e s s i o n o f P C A F, C/E B Pδa n d P P A Rγg e n e s.W e s t e r n b l o t t i n g w a s u s e d t o d e t e c tt h e e x p r e s s i o nl e v e l s o f C/E B Pβ,C/E B Pδa n dP P A Rγp r o t e i n s.T h r e eP C A Fs i R N A s(s i R N A1,s i R N A2a n ds i R N A3) a n d s i R N A N C w e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s.T h e p r o t e i nl e v e l o fP C A F w a sd e t e c t e db y W e s t e r nb l o t t i n g t os c r e e nt h eb e s tP C A Fs i R N A.O p t i m a lP C A Fs i R N Aa n ds i R N A N C w e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s,a n dt h ef o r m a t i o no fl i p i dd r o p l e t s w a so b s e r v e d b y o i lr e d O s t a i n i n g.T h e r e l a t i v ee x p r e s s i o no f P C A F,C/E B Pβ,C/E B Pδa n d P P A Rγg e n e sw e r ed e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R,a n d t h e e x p r e s s i o no fC/E B Pβa n dP P A Rγp r o t e i nw e r ed e t e c t e d b y W e s t e r n b l o t t i n g.m i R-140-5p m i m i c s,N C,P G L0-P C A F3'-U T R v e c t o ra n d P G L O e m p t y v e c t o rw e r e c o-t r a n s f e c t e d i n t o293Tc e l l s,r e s p e c t i v e l y.T h e t a r g e t i n g r e l a t i o n s h i p b e t w e e n m i R-140-5p a n d P C A F g e n ew a s d e t e c t e db y d o u b l e l u c i f e r a s e r e p o r t t e s t.ʌR e s u l tɔI nt h e p r o c e s so f i n d u c i n g a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n o f3T3-L1c e l l s,c o m p a r e d w i t h t h e d a y b e f o r ei n d u c i n g d i f f e r e n t i a t i o n,t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no fm i R-140-5p w a s e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e do n t h e d a y1a n d d a y2o f a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n(P<0.01)a n dw a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d o n t h e d a y 3d a y o fd i f f e r e n t i a t i o n(P<0.05).C o m p a r e d w i t h N C g r o u p,t h en u m b e ro f l i p i dd r o p l e t s i n m i R-140-5p m i m i c s g r o u p w a s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y,a n d t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f l i p i dm a r k e r g e n e s C/E B Pδa n d P P A Rγi n m i R-140-5p m i m i c s g r o u p w e r ee x t r e m e l y i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y (P<0.01).T h e r e s u l t o f t a r g e t g e n e p r e d i c t i o n s h o w e d t h a tm i R-140-5p h a d t h e e x p e c t e d b i n d i n g s i t ew i t hP C A F.T h er e s u l t so fc o n s e r v a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a t t h eb i n d i n g s i t es e q u e n c eo f t a r g e t g e n e P C A F w a sh i g h l y c o n s e r v e da m o n g d i f f e r e n t s p e c i e s.C o m p a r e dw i t h N C g r o u p,t h e7期原佳慧等:m i R-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究r e l a t i v e e x p r e s s i o n s o fm i R-140-5p a n d P C A F g e n e i nm i m i c s g r o u p w e r e e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d(P<0.01),w h i l e t h o s e i n i n h i b i t o r g r o u p w e r e e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P<0.01),P C A F w a ss i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P<0.05),a n dt h ee x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05).C o m p a r e dw i t hP E G F P-N1g r o u p,t h e n u m b e r o f l i p i dd r o p l e t s i nP E G F P-N1-P C A F g r o u p w a s i n c r e a s e d,a n d t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f P C A F a n d P P A Rγg e n e sa n dt h el e v e l so fC/E B Pβ,C/E B Pδp r o t e i n w e r ee x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.01),P P A Rγp r o t e i n w a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05).P C A F s i R N A1,s i R N A2a n d s i R N A3a l l e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n(P<0.01),a n d s i R N A3h a d t h em o s t s i g n i f i c a n t e f f e c t,s o s i R N A3w a s s e l e c t e d f o r t h e f o l l o w-u p t e s t.C o m p a r e d w i t hN C g r o u p,t h e n u m b e r o f l i p i d d r o p l e t s i n3T3-L1c e l l s i nP C A Fs i R N A3g r o u p w a s l e s s,t h e e x p r e s s i o no f P C A F,C/E B Pβ,C/E B Pδa n d P P A Rγg e n e s a n d t h e l e v e l o f C/E B Pβp r o t e i nw e r e e x t r e m e l y d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.01).T h e r e s u l t so f d o u b l e l u c i f e r a s e r e p o r t t e s t s h o w e d t h a t t h e r e w a sn ot a r g e tr e l a t i o n s h i p b e t w e e n m i R-140-5p a n d P C A F g e n e.ʌC o n c l u s i o nɔT h e e x p e r i m e n t p r o v e dt h a tt h ee x p r e s s i o n o fe n d o g e n o u s m i R-140-5p w a si n c r e a s e d d u r i n g t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f3T3-L1c e l l s.m i R-140-5p m i g h t p r o m o t e t h e a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n o f3T3-L1c e l l s b y i n d i r e c t l y u p-r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o no f P C A F g e n e.K e y w o r d s:m i R140-5p;P300/C B P-r e l a t e d f a c t o r s;3T3-L1c e l l s;a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n肌内脂肪是反映动物肉品质的重要指标,其含量直接影响动物肉的风味㊁嫩度㊁多汁性及大理石花纹的分布[1]㊂脂肪组织是动物体内重要的分泌组织,脂肪细胞会分泌瘦素㊁脂联素等[2-3]㊂哺乳动物脂肪组织主要分为白色脂肪组织㊁棕色脂肪组织和米色脂肪组织㊂3种脂肪组织来源不同,功能也各不相同㊂白色脂肪组织内含有较多的甘油三酯,可以储存机体多余的能量㊂由于白色脂肪细胞中线粒体含量较低,所以其虽储存能量能力较强,但脂肪消耗能量的能力较差[4-5]㊂因此,脂肪干细胞的形成及代谢过程的直接或间接调控因子已成为研究热点㊂多种m i R N A可直接或间接参与脂肪细胞分化的转录与翻译过程,且其可通过与下游靶基因结合的方式参与调控脂肪干细胞的分化及发育[6]㊂研究表明,内源性m i R-140-5p在小鼠骨髓基质细胞(S T2)分化过程中表达较高,m i R-140-5p可靶向转化生长因子β受体Ⅰ(T G F B R1)调节脂肪细胞分化[7],m i R-140-5p能够靶向且正调控长链非编码R N A核副斑点装配转录物1(L n o R N A N E A T1)促进脂肪衍生干细胞(A D S C s)成脂分化[8]㊂此外,研究表明,C C A A T增强子结合蛋白家族(C/E B P s)与m i R-140-5p的近端启动子结合正调控m i R-140-5p 的表达[7],表明m i R-140-5p与C/E B P s可能是正反馈模式,m i R-140-5p可能在脂肪分化过程中发挥着重要的作用㊂通过查找m i R B a s e等网站发现了可能靶向m i R-140-5p的基因,一部分已经被验证参与脂肪干细胞的分化过程,其中P300/C B P相关因子(P C A F)又名K A T2B,是组蛋白乙酰转移酶,具有乙酰转移活性,能通过乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因的转录调控[9]㊂P300/C B P与细胞周期调控㊁细胞凋亡和癌症的发生有着直接的关系[10]㊂研究表明,P C A F基因在3T3-L1细胞成脂分化过程中具有重要作用[11],同时关于P C A F基因在成脂分化方面相关文献较少,P C A F基因影响成脂分化的具体机制还不清晰㊂过氧化物酶体增殖物激活受体(P P A R)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员㊂P P A R可分为α㊁β(或δ)和γ3种类型,其中P P A Rγ主要表达于脂肪组织及免疫系统,与脂肪细胞分化㊁机体免疫及胰岛素抵抗关系密切,是一种可由多种脂肪酸及其衍生物激活的核转录因子[12]㊂P P A Rγ参与脂肪细胞分化,并与肥胖密切相关,是公认的脂肪分化的标志因子[13]㊂C/E B P s家族是碱性亮氨酸拉链蛋白家族的一个亚家族,具有多种功能,在细胞增殖㊁分化㊁信号传导㊁肿瘤发生及机体的免疫㊁应激反应㊁能量代谢㊁血液生成等方面发挥着重要的作用[14-15]㊂目前发现的C/E B P s家族有C/E B Pα㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pγ㊁C/E B Pδ㊁C/E B Pε㊁C/E B Pζ6类,且C/E B P s家族是第一个被证明在脂肪细胞分化过程中起重要作用的家族[16]㊂研究表明,在前脂肪细胞3T3-L1分化过程中C/E B Pβ的表达在脂肪分化初期瞬时增强,而后C/E B Pα与P P A Rγ转3362中国畜牧兽医49卷录激活[17]㊂基于P P A R s与C/E B P s家族互相影响且在细胞成脂分化中起到重要的作用,本试验选择C/E B Pβ㊁C/E B Pδ与P P A Rγ作为3T3-L1细胞成脂分化机制的下游基因进行深入研究,探索m i R-140-5p对3T3-L1细胞成脂分化的调控作用㊂1材料与方法1.1材料高糖D M E M购自上海帝博思生物科技有限公司;胎牛血清(F B S)购自S c i e n c e l l公司;P r o m e g a D u a l-L u c i f e r a s e R e p o r t e rA s s a y S y s t e m E1910购自A b c a m公司;L i p o f e c t a m i n e 2000转染试剂㊁质粒中提试剂盒均购自T h e r m o公司;P G L O载体㊁P G L O-P C A F3'-U T R载体㊁P E G F P-N1载体㊁P E G F P-N1-P C A F载体均购自武汉淼灵生物科技有限公司;R N A i s oP l u s,P r i m e S c r i p t T M R TR e a g e n t K i t㊁S Y B R P r i m i xE x T a qⅡ均购自T a K a R a公司;B C A蛋白浓度检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司;P r i m e S c r i p t T M R T R e a g e n tK i tw i t h g D N A E r a s e r㊁A d i p o g e n e s i s A s s a y试剂盒均购自A b c a m公司;P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ抗体购自P r o t e i n t e c hG r o u p公司;限制性内切酶X h oⅠ㊁K p nⅠ㊁N h eⅠ均购自N E B公司;大肠杆菌D H5α感受态细胞购自深圳康体生命科技有限公司㊂1.2分子材料的设计及合成1.2.1 m i R-140-5p模拟物㊁抑制物的合成根据m i R B a s e网站m i R-140-5p全序列(登录号: K T921569.1),由吉玛基因公司设计并合成m i R-140-5p 的模拟物㊁抑制物及对照序列(m i R-140-5p m i m i c s㊁i n h i b i t o r㊁N C)(表1)㊂表1模拟物㊁抑制物及s i R N A信息T a b l e1m i m i c s,i n h i b i t o r a n d s i R N Ai n f o r m a t i o n名称N a m e序列S e q u e n c e s(5'ң3') m i R-140-5p m i m i c s S:C A G U G G U U U U A C C C U A U G G U A GA:A C C A U A G G G U A A A A C C A C U G U U m i R-140-5p i n h i b i t o r S:C U A C C A U A G G G U A A A A C C A C U G s i R N A1S:G C A G A G G A G U C C U G U A A A U T TA:A U U U A C A G G A C U C C U C U G C T T s i R N A2S:G U G U A C U U C U A C C U A U U C A T TA:U G A A U A G G U A G A A G U A C A C T T s i R N A3S:G G U U G U G C U A C U G C A A U G U T TA:A C A U U G C A G U A G C A C A A C C T T N C S:U U C U C C G A A C G U G U C A C G U T TA:A C G U G A C A C G U U C G G A G A A T T1.2.2 s i R N A设计及合成根据G e n B a n k中P C A F基因完整C D S区序列(登录号:NM_ 001190846.1),由吉玛基因公司设计并合成P C A F 基因的3条s i R N A(s i R N A1㊁s i R N A2㊁s i R N A3) (表1)㊂1.2.3载体构建根据G e n B a n k中P C A F基因完整C D S区序列(登录号:N M_001190846.1),采用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计P C A F过表达引物,以3T3-L1细胞c D N A为模板进行P C R扩增㊂P C R反应体系50μL:c D N A5μL,2ˑT a q M a s t e r M i x 25μL,上㊁下游引物各1.5μL,d d H2O17μL㊂P C R 扩增程序:95ħ预变性3m i n;95ħ变性30s,60ħ退火30s,72ħ延伸15s,共35个循环;72ħ终延伸5m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后胶回收,与P E G F P-N1空载体同时使用限制性内切酶X h oⅠ㊁K p nⅠ双酶切,将二者双酶切产物连接,连接产物转入大肠杆菌D H5α感受态细胞中,对转化后的大肠杆菌进行摇菌㊁涂板㊁挑单克隆菌㊁摇菌,将得到的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序成功后对菌液进行质粒提取,重组质粒命名为P E G F P-N1-P C A F㊂根据m i R D B网站得到P C A F基因的3'-U T R序列,采用P r i m e r P r e m i e r5.0软件设计P C A F3'-U T R引物(表2),其中包含m i R-140-5p与P C A F基因预测结合位点,使用上述方法构建P G L O-P C A F3'-U T R 载体㊂43627期原佳慧等:m i R-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究1.2.4引物设计及合成根据m i R B a s e㊁G e n B a n k 中m i R-140-5p㊁P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因序列,利用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计实时荧光定量P C R引物,引物信息见表2㊂引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂表2引物信息T a b l e2P r i m e r i n f o r m a t i o n引物P r i m e r s序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物长度P r o d u c ts i z e/b p退火温度A n n e a l i n gt e m p r e t u r e/ħG e n e B a n k登录号G e n e B a n ka c c e s s i o nN o.m i R-140-5p F:G A G T G T C A G T G G T T T T A C C C T2260K T921569.1 R:G C A G G G T C C G A G G T A T T CU6F:C G C T T C G G C A G C A C A T A T A C8760N C_030814.1 R:T T C A C G A A T T T G C G T G T C A TP P A RγF:G G G C C A A G G A T T C A T G A C C A28860NM_001308354.1 R:A T C T T C T G G A G C A C C T T G G CC/E B PβF:G A A G A C G G T G G A C A A G C T G A16560NM_001287739.1 R:T G C T C C A C C T T C T T C T G C A GC/E B PδF:C A T C G A C T T C A G C G C C T A C A10360NM_007679.4 R:C G C T T T G T G G T T G C T G T T G AP C A F F:A C A G C A C C C T C A A G A A C A T C14360NM_001190846.1R:G C G T T C A C T C A T G G T T T T C A G P C A F3'-U T R F:T A G T T G T T T A A A C G A G C T C G G C G-G C T G C T A T G A C T C C T A A G 20060NM_001190846.1R:C A G G T C G A C T C T A G A C T C G A G C T-A A C A C C T T T G T G G C C T G1.3m i R-140-5p对3T3-L1细胞成脂分化的影响1.3.13T3-L1细胞转染及分化3T3-L1细胞解冻后用含10%胎牛血清的D M E M高糖培养基培养,按照2ˑ105/m L接种到6孔板中,待汇合度达到70%左右时进行细胞转染㊂用250μL D M E M 培养基(不含血清和双抗)分别稀释m i R-140-5p m i m i c s(m i m i c s)㊁N C和L i p o f e c t a m i n e 2000转染试剂,室温静置5m i n,将N C与m i R-140-5p m i m i c s 分别与转染试剂混匀后静置20m i n;静置期间,将6孔板里的旧培养基弃掉,用P B S清洗细胞2次,加入800μL新鲜D M E M培养基(不含血清和双抗);静置结束后将500μL转染混合液均匀滴加到培养板中,轻轻晃动培养板使溶液混合均匀;培养箱中静置6h,更换为含10%胎牛血清的D M E M培养基(不含双抗)继续培养㊂待细胞汇合度达70%时进行诱导分化,将完全培养基换为诱导培养基(将胰岛素㊁I B MX㊁地塞米松试剂按照说明书1000倍稀释, 1m L完全培养基加入1μL各试剂配制诱导培养基),诱导3d后换为分化培养基(将胰岛素试剂按照说明书1000倍稀释,1m L完全培养基加入1μL 配制分化培养基)继续培养,2d换1次分化液㊂1.3.2油红O染色鉴定在诱导分化第7天进行油红O染色㊂将3T3-L1细胞每孔加入100μL 稀释的脂滴分析固定剂,并孵育15m i n;用100μL 洗涤液洗2次,每次5m i n;干燥培养板;将75μL油红O工作液添加到所有孔中,包括不含细胞的空白孔,并孵育20m i n;移除所有油红O溶液,用蒸馏水清洗细胞数次,至蒸馏水清澈;用100μL洗涤液洗2次,每次5m i n㊂显微镜下观察并拍照㊂1.3.3实时荧光定量P C R检测基因的表达在诱导分化的第―1(分化前1d)㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天收集3T3-L1细胞,用于实时荧光定量P C R检测m i R-140-5p m R N A相对表达量;在诱导分化第7天收集细胞进行C/E B Pβ㊁C/E B Pδ和P P A Rγm R N A相对表达量检测㊂用T R I z o l提取诱导分化第―1㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天的3T3-L1细胞㊁转染m i R-140-5p m i m i c s和N C组诱导分化7d的3T3-L1细胞总R N A并反转录合成c D N A㊂P C R反应体系10μL: 2ˑT a q M a s t e rM i x5μL,上㊁下游引物各0.4μL, c D N A200n g,d d H2O补足10μL㊂P C R反应程序:5362中国畜牧兽医49卷95ħ预变性30s;95ħ变性10s,60ħ退火30s, 72ħ延伸15s,共40个循环;72ħ延伸5m i n㊂1.4m i R-140-5p靶基因筛选及靶基因序列保守性分析采用m i R a n d n(h t t p:ʊm i r d b.o r g/)和T a r g e t S c a n(h t t p:ʊw w w.t a r g e t s c a n.o r g/v e r t_ 70/)2个m i R N A数据库预测m i R-140-5p的靶基因,在数据库中挑选与脂肪分化相关的靶基因作为潜在靶基因㊂通过在m i R B a s e(h t t p s:ʊw w w. m i r b a s e.o r g/)数据库得到小鼠㊁人㊁黑猩猩㊁恒河猴㊁松鼠㊁大鼠㊁兔子㊁猪㊁牛㊁猫㊁犬㊁棕蝠㊁大象㊁负鼠㊁金刚鹦鹉和鸡的m i R-140-5p及其靶基因结合位点序列,通过比对各物种m i R N A序列,分析其结合位点序列的保守性㊂1.5m i R-140-5p对其预测靶基因表达的影响1.5.13T3-L1细胞培养㊁细胞转染及细胞分化将m i R-140-5p m i m i c s(m i m i c s)㊁m i R-140-5p i n h i b i t o r(i n h i b i t o r)与N C按照1.3.1方法转染到3T3-L1细胞中,细胞培养与诱导分化方式同1.3.1㊂1.5.2实时荧光定量P C R检测靶基因的表达在诱导的第2天收集1.5.1各组细胞进行实时荧光定量P C R㊂试验方法同1.3.3,检测m i m i c s㊁i n h i b i t o r与m i m i c sN C组的m i R-140-5p的靶基因m R N A相对表达水平㊂1.5.3 W e s t e r n b l o t t i n g检测蛋白的表达在诱导的第2天收集1.5.1各组细胞进行W e s t e r nb l o t t i n g 检测㊂用蛋白裂解液收集m i m i c s㊁i n h i b i t o r与m i m i c s N C组的细胞后,冰上裂解40m i n,13000r/m i n离心15m i n,吸取上清液,检测蛋白浓度后进行S D S-P A G E凝胶电泳,经过转膜㊁室温封闭1h㊁孵育一抗(4ħ孵育过夜)㊁洗膜㊁孵育二抗(37ħ孵育1h)㊁洗膜后,涂抹发光液后在凝胶成像系统中曝光㊂检测m i R-140-5p靶基因的蛋白表达水平㊂1.6过表达或敲低P C A F对3T3-L1细胞成脂分化的影响1.6.13T3-L1细胞培养㊁细胞转染及细胞分化将P E G F P-N1-P C A F载体㊁P E G F P-N1载体㊁N C㊁P C A F s i R N A1㊁P C A F s i R N A2和P C A F s i R N A3㊁P C A F N C与P C A Fs i R N A3按照1.3.1的方法转染到3T3-L1细胞,细胞培养与诱导分化方式同1.3.1㊂在诱导第2天时收集各组细胞进行实时荧光定量P C R和W e s t e r nb l o t t i n g检测,在诱导分化第7天进行油红O染色鉴定㊂1.6.2油红O染色试验方法同1.3.2,观察P E G F P-N1-P C A F与P E G F P-N1组及P C A Fs i R N A 与N C组细胞中脂滴的染色情况㊂1.6.3实时荧光定量P C R检测基因的表达试验方法同1.3.3,检测P E G F P-N1-P C A F㊁P E G F P-N1组细胞P C A F㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因的相对表达水平;检测P C A Fs i R N A㊁N C组P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因的相对表达水平㊂1.6.4 W e s t e r nb l o t t i n g检测蛋白的表达试验方法同1.5.3,检测P E G F P-N1-P C A F㊁P E G F P-N1组细胞C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ与G A P D H蛋白表达水平;检测P C A Fs i R N A1㊁P C A Fs i R N A2㊁P C A Fs i R N A3和N C组细胞中P C A F蛋白表达水平;检测P C A F s i R N A组与N C组C/E B Pβ㊁P P A Rγ与G A P D H蛋白表达水平㊂1.7m i R-140-5p与P C A F靶向关系验证将293T细胞分为m i m i c s+P C A F3'-U T R㊁N C+ P C A F3'-U T R㊁m i m i c s+P G L O空载(m i m i c s+ v e h i c l e)和空白+P C A F3'-U T R(B l a n k+3'-U T R P C A F)4组,待293T细胞汇合度达到70%~80%进行转染,用125μLD M E M培养基(不含血清和双抗)分别稀释P C A F3'-U T R质粒㊁m i m i c s,用250μL D M E M培养基稀释L i p o2000转染试剂(6μL/孔),室温静置5m i n,将质粒和m i m i c s与转染试剂分别混匀再静置20m i n,按照1.3.1的方法进行转染,培养72h后收集细胞,用于双荧光素酶报告试验检测㊂试验前需按照P r o m e g a D u a l-L u c i f e r a s e R e p o r t e rA s s a y S y s t e mE1910试剂盒说明书制备裂解液1ˑP L B㊁L A RⅡ㊁S t o p&G l o试剂㊁1ˑS t o p&G l oR a e g e n t㊂除去培养基,用P B S清洗细胞后,将1ˑP L B加入到培养孔中㊂在室温轻缓晃动培养板15m i n,将裂解液转移到检测板中,加入20μL P L B裂解液/孔,加入100μLL A RⅡ,检测样本荧火虫荧光素酶活性;加入100μLS t o p&G l o试剂,检测样本海肾荧光素酶活性㊂1.8数据统计分析用2-әәC t法计算各基因相对表达量,采用I m a g e J1.48软件计算蛋白灰度值,用G r a p h P a d P r i s m8.0软件绘图,用S P S S26.0软件进行单因素方差分析,组间差异采用t检验,结果用平均值ʃ标准差表示㊂P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著㊂2结果2.1m i R-140-5p对3T3-L1细胞成脂分化的影响在3T3-L1细胞分化过程中,m i R-140-5p的表63627期原佳慧等:m i R -140-5p 对前脂肪细胞3T 3-L 1成脂分化的机制研究达量有明显变化趋势㊂与诱导分化前1d (-1d)相比,在细胞汇合至100%时m i R -140-5p 表达水平极显著上升(P <0.01),在添加诱导培养基第1天时,m i R -140-5p 表达水平极显著上升(P <0.01),而后在分化过程中下降,分化至第3天m i R -140-5p 表达水平显著上升(P <0.05),分化至第5天后m i R -140-5p表达水平已降低到未分化之前的水平(图1A )㊂油红O 染色发现,m i m i c s 组脂滴明显多于N C 组(图1B )㊂与N C 组相比,m i m i c s 组成脂标志性基因C /E B P δ㊁P P A R γ转录水平极显著升高(P <0.01),C /E B P β基因的转录水平有升高趋势,但差异不显著(P >0.05)(图1C ~1E )㊂①A ,3T 3-L 1细胞分化第-1㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天m i R -140-5p 表达水平;B ,m i R -140-5p NC 组与m i m i c s 组油红O 染色结果(40ˑ);C ~E ,C /E B P β㊁C /E B P δ㊁P P A R γm R N A 相对表达量㊂②与―1d 相比,#,差异显著(P <0.05);##,差异极显著(P <0.01);无#,差异不显著(P >0.05)㊂③与N C /P E G F P -N 1组相比,*,差异显著(P <0.05);**,差异极显著(P <0.01);无*,差异不显著(P >0.05)㊂下同①A ,T h e e x p r e s s i o n l e v e l o fm i R -140-5p o n -1,0,1,2,3,5a n d7d a y so f 3T 3-L 1c e l l d i f f e r e n t i a t i o n ;B ,O i l r e dOs t a i n i n gr e s u l t s o fm i R -140-5p N C g r o u p a n dm i m i c s g r o u p (40ˑ);C ~E ,T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f C /E B P β,C /E B P δa n d P P A R γg e n e s ,r e l a t i v e l y .②C o m p a r e dw i t h ―1d ,#,S i g n i f i c a n td i f f e r e n c e (P <0.05);##,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e (P <0.01);N o#,N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05).③C o m p a r e dw i t hN C /P E G F P -N 1g r o u p ,*,S i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);**,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01);N o *,N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05).T h e s a m e a sb e l o w 图1 过表达m i R -140-5p 对3T 3-L 1细胞成脂分化的影响F i g .1 T h e e f f e c t s o f o v e r e x p r e s s i o no fm i R -140-5p on3T 3-L 1c e l l s d i f f e r e n t i a t i o n 2.2 m i R -140-5p 靶基因预测及PC A F 序列保守性分析利用T a r g e t S c a n 网站预测发现,m i R -140-5p与P C A F3'-U T R 区含有预测结合位点,在674-681b p 处(图2A )㊂预测结合位点在小鼠㊁人㊁黑猩猩㊁恒河猴㊁松鼠㊁大鼠㊁兔子㊁猪㊁牛㊁猫㊁犬㊁棕蝠㊁大象㊁负鼠㊁金刚鹦鹉和鸡物种间的保守性比对发现,在不同物种间此结合位点保守性较高(图2B )㊂7362中 国 畜 牧 兽 医49卷A ,m i R -140-5p 和P C A F3'-U T R 区的预测结合位点;B ,PC A F3'-U T R 区序列保守性分析A ,P r e d i c t e db i n d i n g s i t e o fm i R -140-5p a n dP C A F3'-U T Rr e g i o n ;B ,C o n s e r v a t i v e a n a l y s i s o f P C A F3'-U T Rr e g i o n s e qu e n c e 图2 m i R -140-5p 靶基因预测及PC A F3'-U T R 区序列保守性分析F i g .2 P r e d i c t i o no fm i R -140-5p t a r g e t g e n e a n d c o n s e r v a t i o na n a l y s i s o fP C A F3'-U T Rr e g i o n s e qu e n c e 2.3 m i R -140-5p 对PC A F 表达的影响 由图3可知,与N C 组相比,m i m i c s 组m i R -140-5p㊁P C A F 的表达量均极显著增加(P <0.01),i n h i b i t o r 组m i R -140-5p 的表达量极显著降低(P <0.01)㊁P C A F 的表达量显著降低(P <0.05)㊂由图4可知,与N C 组相比,m i m i c s 组P C A F 蛋白的表达量显著增加(P <0.05),i n h i b i t o r 组P C A F 蛋白的表达量无显著变化(P >0.05)㊂图3 各组m i R -140-5p(A )与P C A F (B )基因的相对表达量F i g .3 T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n s o fm i R -140-5p (A )a n d P C A F (B )g e n e i n e a c h g r o u p83627期原佳慧等:m i R -140-5p 对前脂肪细胞3T 3-L 1成脂分化的机制研究图4 各组P C A F 蛋白表达量F i g .4 T h e e x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n i n e a c h g r o u p2.4 过表达P C A F 对3T 3-L 1细胞成脂分化的影响由图5可知,与P E G F P -N 1组相比,P E G F P -N 1-P C A F 组细胞脂滴明显增加㊂由图6可知,与P E G F P -N 1组相比,P C A F ㊁P P A R γ基因相对表达量均极显著增加(P <0.01),C /E B P δ基因相对表达量有上升趋势,但差异不显著(P >0.05)㊂由图7可知,与P E G F P -N 1组相比,P E G F P -N 1-P C A F 组C /E B P β㊁C /E B P δ蛋白表达水平极显著上升(P <0.01),P P A R γ蛋白表达水平显著上升(P <0.05)㊂图5 油红O 染色结果(40ˑ)F i g .5 O i lOs t a i n i n g re s u l t s (40ˑ)图6 各组P C A F (A )㊁C /E B P δ(B )和P P A R γ(C )基因相对表达量F i g .6 R e l a t i v e e x p r e s s i o no f P C A F (A ),C /E B P δ(B )a n d P P A R γ(C )g e n e s i n e a c h g r o u p9362中 国 畜 牧 兽 医49卷A ,C /EB P β㊁C /E B P δ和P P A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 条带;B ~D ,C /E B P β㊁C /E B P δ和P P A R γ蛋白灰度值A ,W e s t e r n b l o t t i n g b a n d o fC /E B P β,C /E B P δa n d P P A R γp r o t e i n s ;B -D ,G r a y v a l u e so f C /E B P β,C /E B P δa n d P P A R γp r o t e i n s ,r e s p e c t i v e l y图7 各组C /E B P β㊁C /E B P δ和P P A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 结果F i g .7 W e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s o fC /E B P β,C /E B P δa n dP P A R γp r o t e i n s i n e a c h g r o u p 2.5 敲低P C A F 基因对3T 3-L 1细胞成脂分化的影响由图8可知,与N C 组相比,3条s i R N A 均极显著抑制P C A F 蛋白的表达水平(P <0.01),由于s i R N A 3组P C A F 蛋白水平降低最显著,所以选用s i R N A 3进行后续P C A F 敲低试验㊂由图9可知,s i R N A 3组脂滴明显少于N C 照组㊂与N C 组相比,s i R N A 3组C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ基因相对表达量均极显著下降(P <0.01)(图10);与N C 组相比,s i R N A 3组C /E B P β蛋白表达水平极显著降低(P <0.01),P P A R γ蛋白表达水平无显著变化(P >0.05)(图11)㊂A ㊁B ,在3T 3-L 1细胞中分别转染3条P C A Fs i R N A 后P C A F 蛋白的表达水平Aa n dB ,T h e e x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n i n3T 3-L 1c e l l s a f t e r t h r e eP C A Fs i R N A s t r a n s f e c t i o n r e s p e c t i v e l y 图8 s i R N A 敲低效果对比F i g .8 C o m p a r i s o no f s i R N Ak n o w i n g do w n e f f e c t s 04627期原佳慧等:m i R -140-5p 对前脂肪细胞3T 3-L 1成脂分化的机制研究图9 油红O 染色结果(40ˑ)F i g .9 O i lOs t a i n i n g re s u l t s (40ˑ)图10 各组P C A F (A )㊁C /E B P β(B )㊁C /E B P δ(C )和P P A R γ(D )基因相对表达量F i g .10 R e l a t i v e e x p r e s s i o no f P C A F (A ),C /E B P β(B ),C /E B P δ(C )a n d P P A R γ(D )g e n e s 2.5 m i R -140-5p 与PC A F 基因靶向关系验证双荧光素酶报告试验结果显示,与B l a n k+P C A F3'-U T R ㊁m i m i c s +v e h i c l e 和N C+P C A F3'-U T R 相比较,m i m i c s +P C A F3'-U T R 组中双荧光素酶活性均无显著差异(P >0.05)(图12),说明m i R -140-5p 与PC A F 基因无靶标关系㊂1462中 国 畜 牧 兽 医49卷A ,C /EB P β和P P A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 条带;B ㊁C ,C /E B P β和P P A R γ蛋白灰度值A ,W e s t e r nb l o t t i n g b a n do fC /E B P βa n dP P A R γp r o t e i n ;Ba n dC ,G r a y v a l u e s o fC /E B P βa n dP P A R γp r o t e i n 图11 各组C /E B P β和PP A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 结果F i g .11 W e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s o fC /E B P βan dP P A R γp r o t e i n s i n e a c h g r o up 图12 各组双荧光素酶相对活性F i g .12 R e l a t i v e a c t i v i t y o f d u a l l u c i f e r a s e i n e a c h g r o u p3 讨 论脂肪代谢及分化与动物的生长发育息息相关,m i R N A 在脂肪分化过程中的作用与功能具有重要意义㊂研究表明,在S T 2细胞成脂分化过程中,在细胞汇合至100%的第2天添加诱导分化液,m i R -140-5p 的表达水平在诱导分化前1d 升高,在诱导分化后第1天达到最高值[7]㊂本研究在细胞汇合至100%当天添加诱导分化液,结果显示,3T 3-L 1细胞在诱导分化当天m i R -140-5p 表达水平极显著升高,在诱导后第1天m i R -140-5p 表达量达到峰值,与S T 2细胞的研究结果基本一致㊂其原因可能在于:当细胞汇合100%时,3T 3-L 1细胞达到了细胞接触抑制时期,这时期为前体脂肪细胞分化第一阶段(克隆增殖阶段),且细胞在接触抑制后很快进入第二阶段(终末分化阶段),为了避免错过分化第一阶段,所以本研究中诱导分化时间选择在这一时期㊂但本试验结果显示,在诱导分化后第1天m i R -140-5p 水平达到峰值,与上述文献一致,这个峰值可能代表着细胞进入了分化的第二阶段,而造成细胞分化第一阶段到第二阶段的原因可能是添加诱导分化试剂引起的㊂m i R -140-5p 在细胞分化第一阶段与第二阶段均显著增高,这说明m i R -140-5p 在3T 3-L 1细胞分化过程中扮演重要角色㊂本研究通过过表达m i R -140-5p ,发现m i R -140-5p 能够促进3T 3-L 1细胞的成脂分化,并且上调成脂分化相关基因P P A R γ㊁C /E B P β和C/E B P δ的表达㊂为了探究m i R -140-5p 的成脂调控作用,利用T a r ge t S c a n 与m i R B a s e 等靶基因预测网站预测m i R -140-5p 的下游靶基因,从中选择与脂肪分化相关的P C A F 基因作为研究对象㊂有研究表明,P C A F 基因在3T 3-L 1细胞分化中发挥重要作用[11]㊂本研究结果证明,与N C 组相比,m i R -140-5p mi m i c s 组P C A F 基因的表达量上调,m i R -140-5pi n h i b i t o r 组P C A F 基因表达量下降,说明m i R -140-5p 可影响P C A F 基因的表达㊂与转染空载体对照组相比,P C A F 基因高表达后脂滴明显增多,且C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ的转录与蛋白表达水平均上升;相反,敲低P C A F 抑制3T 3-L 1细胞分化为脂滴,且C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ的转录与蛋白表达水平均不同程度地下降,说明P C A F 是通过正调控C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ基因促进3T 3-L 1细胞成脂分化的㊂尽管组蛋白乙酰化对脂肪细胞分化调控的研究较少,但目前的文章显示组蛋白乙酰化修饰水平与成脂分化水平呈正相关[18]㊂J i n 等[19]研究发现,P C A F 通过调节P P A R γ的表达来促进脂肪的发生,并通过影响P r d m 16的2462。
3T3-L1前脂肪细胞与肥胖的相关性研究进展
中 国 民 族 民 间 医 药
・
论 著
Ｆｅ （ ｒａ ｉ ｓ
２０ ・
Ｃ ｉｅｅ ｊｕ ｌｏ ｔｎ ｍ ｄｃｎ ｎ１ｅ ｎ ｐ ａｔ ｃ ｈｎ ｓ ｏ ｍａ ｆ ｅ ｏ ｅ ｉｉｅ ａ （ ｔ ｏ ｈ ｒ ａ ｙ ｈ ｈ ｎ
的吸光值 ，这样就 町以快 速地 刘 化后 的脂肪 细胞胞 浆 内 分
２ ３ ＂ Ｕ 前 脂 肪 细 胞 的鉴 定 ＂ １ ３一 ２ １ 形 态 学 鉴 定 ．
３ ３一 １ Ｔ Ｌ 前脂肪细胞可 以通 过形态学观 察来进行 鉴定 ， 接 种 １ｈ ５ 左右基 本上 可以完 全贴壁 生长 ，在倒 置相 差显微 镜 下观察该细胞 形态类似 于成纤 维细胞 ，呈梭形 或多角形 ， 细胞核 圆形 ，位 于细胞质 中央 ［５。 ４ ， ３ ３ ３一 １ Ｔ Ｌ 前脂 肪细胞 经诱 导分 化之 后 ，相差 显微 镜下 可见细胞 由多角 形或 长梭形逐 渐变成 圆形 或椭 圆形 ，细胞 浆 内可见折 光性 强的脂 滴 ，细胞核 呈 圆形 、位 于细 胞的一
１７ ９ ５．５ （１ ）：１ ９—２ ７
３一 酸甘油脱氯酶 （ Ｐ Ｈ）是脂肪 细胞 产生甘 油 一 磷 ＧＤ ３
一
［ Ｎａ ｂ Ｊ ３ ｔ ｉ Ｍ，Ｋｍ Ｙ Ａ ｉ ｅｔ ｄ ｅ ｎｉｉ ｎ ｅ ｅ ｘ ｒ ｓ ｎ ｊ ］ １ ｍ ｉ Ｃ ｄｐ ｙ ｉ ｒ ｌｔ ｎａｄｇｎ ｐｅ ｉ Ｊ ，Ｊ ｏ ｅ ｆ ｅ ａｏ ｅ ｓｏ
（ ． ｎ ｏ ）、３一异 丁基 一１ ０２ｍ ｌ ／Ｌ 一甲基黄 嘌呤 （Ｂ ＩＭＸ）０５ ． ｎｏ ｍｌ ／Ｌ，亦可以使 ３ ３一Ｌ 小 鼠前脂肪细胞在 诱导分 化 ２ Ｔ １ 周时分化 比例达 到 ９ ％ 以上 。 目前 ，一般认 为血 清利于 细 ０
3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化方法优化的初步探讨
3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化方法优化的初步探讨赵蕾;郑美丽;杨梅;钟久昌;杨新春【摘要】目的观察不同诱导剂对3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化的作用.方法在经典鸡尾酒诱导剂成分基础上,根据不同诱导剂成分,将3T3-L1前体脂肪细胞分为4组:(1)对照组;(2)罗格列酮干预组;(3)吲哚美辛干预组;(4)罗格列酮和吲哚美辛联合干预组.在诱导前体脂肪细胞分化过程中,通过显微镜观察细胞形态学变化、油红O染色以及检测胞内和胞外三酰甘油含量,评价各组成脂效率.结果罗格列酮和吲哚美辛单独干预组及联合干预组前体脂肪细胞诱导过程中更早出现脂滴,且形成的脂滴也较对照组多,而油红O染色进一步证实以上结果.采用Image Pro Plus 6.0软件统计经油红O染色后的脂滴,单个脂滴的平均直径、平均面积以及最大直径,罗格列酮干预组和联合干预组均大于对照组,而吲哚美辛干预组与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).三酰甘油含量检测,胞外三酰甘油含量4组比较,差异无统计学意义,但胞内三酰甘油含量联合干预组高于对照组[(0.77±0.07) mmol/g vs (0.19±0.02) mmol/g,P＜0.05].结论优化经典鸡尾酒诱导方法,在原成分基础上加用过氧化物酶体增生因子活化γ型受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ)激动剂罗格列酮,可显著提高3T3-L1前体脂肪细胞的诱导效率.【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2019(040)002【总页数】6页(P226-231)【关键词】前体脂肪细胞;3T3-L1;分化【作者】赵蕾;郑美丽;杨梅;钟久昌;杨新春【作者单位】首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心北京市高血压重点实验室,北京100020;首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心北京市高血压重点实验室,北京100020;首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心北京市高血压重点实验室,北京100020;首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心北京市高血压重点实验室,北京100020;首都医科大学附属北京朝阳医院心脏中心北京市高血压重点实验室,北京100020【正文语种】中文肥胖是一项世界性健康难题，往往导致内分泌系统和心血管系统疾病的发生。
替米沙坦上调3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的机制
替米沙坦上调3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的机制郑振伟【摘要】目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)在替米沙坦调节脂肪细胞脂联素表达中的作用.方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,采用替米沙坦(10μmol/L)和,或PPARγ阻断剂GW9662(30 μmol/L)干预313-L1脂肪细胞,采用实时定量RT-PCR和Westem blot方法检测313一L1脂肪细胞的脂联素表达水平.结果与空白对照组相比,经GW9662干预后313-L1脂肪细胞脂联素mRNA 表达水平明显降低(P<0.05);替米沙坦组脂联素mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.05);替米沙坦+GW9662组(替米沙坦+GW组)脂联素mRNA和蛋白表达水平有增高趋势,但与空白组相比无统计学差异(P>0.05).结论PPARγ活性在替米沙坦上调313-L1脂肪细胞脂联素表达过程中可能起着一定程度的作用.【期刊名称】《实用医药杂志》【年(卷),期】2010(027)005【总页数】3页(P454-456)【关键词】替米沙坦;脂联素;过氧化物酶体增殖物活化受体γ【作者】郑振伟【作者单位】450052,河南,郑州,153医院急诊科【正文语种】中文【中图分类】R962血管紧张素受体阻断剂（angiotensin receptor blockers，ARBs）目前已广泛用于高血压病的治疗。
近年来相关研究显示替米沙坦等ARBs除具有拮抗肾素-血管紧张素系统的作用外，还可以通过上调脂联素表达来调节糖脂代谢[1-6]。
而糖脂代谢和动脉粥样硬化密切相关[7]。
目前研究发现替米沙坦上调脂联素的表达可能与激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）有关[8，9]，但是具体的机制尚不清楚。
基于此，笔者通过观察替米沙坦和PPARγ阻断剂GW9662对体外培养3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响，探讨PPARγ在替米沙坦上调脂联素表达中的作用。
脂糖纤
脂糖纤脂类、碳水化合物、膳食纤维石元刚第三军医大学营养与食品卫生学教研室（第三军医大学·重庆·）一、脂肪脂类（lipids)是由碳、氢、氧三种元素组成。
营养学上重要的脂类主要有甘油三酯（triglycerides)、磷脂（phospholipids)和固醇类（sterods）物质。
脂类不仅是人体必需的三大产能营养素之一也是构成人体细胞的重要成分。
（一）分类脂肪(甘油三酯):也称为中性脂肪由三个脂肪酸分子与一个甘油分子酯化合而成。
膳食中甘油三酯来源于动物和植物脂肪如猪油、牛油、菜油、豆油、麻油。
占食物脂类％。
类脂固醇类胆固醇、植物固醇(占食物脂类％)磷脂磷酸甘油脂卵磷脂、脑磷脂神经鞘脂神经鞘磷脂甘油脂肪酸甘油三酯胆碱卵磷脂胆固醇白三烯A前列腺素E乙醇胺丝氨酸脂肪分布在皮下、腹腔和肌肉纤维之间等脂肪组织及心、肾等内脏周围包膜中称“储存脂”。
当机体需要时可动用其而释放能量并随膳食、能量消耗情况而变化较大因此又称为“可变脂”。
类脂是组成细胞质膜、核膜等膜结构的主要成分也是机体各器官组织尤其是大脑神经组织称“基本脂”其含量一般不随机体营养状况变动,因此又称为“固定脂”。
（二）脂类生理功能储存和提供能量一般合理膳食的总能量有～由脂肪提供。
支持和保护内脏、维持体温恒定机体组织和细胞的构成成分提供机体必需脂肪酸使机体更有效的利用碳水化合物和节约蛋白质内分泌作用如瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子、纤维蛋白溶酶原激活因子抑制物、血管紧张素原、雌激素、胰岛素样生长因子、白细胞介素、等。
营养学方面的作用延长胃排空时间增加饱腹感…刺激产生肠抑胃素增加食品风味、感观性状提供和促进脂溶性维生素吸收（三）脂类消化吸收脂肪的消化主要在小肠在胃里几乎不能被消化。
脂肪进入小肠后在胰脂酶(胰腺分泌的消化脂肪的酶)与胆汁的作用下将甘油三酯先分解成甘油二酯及一分子游离脂肪酸。
脂肪必需先分解为脂肪酸及甘油三酯才能被小肠吸收。
脂肪酸命名（四）脂肪酸脂肪酸的化学式为RCOOH其中R为碳原子所组成的烷基链。
3T3L1 preadipocyte
DMEM containing 1% PS, 10% FBS, and PBE
24h
We first determined the maximal concentration of PBE to be added to mature 3T3-L1 adipocytes based on MTT and LDH assays.
2012
Brown Remodeling of White Adipose Tissue by SirT1-Dependent Deacetylation of Pparγ
We treated 3T3-L1 cells overnight with resveratrol (10 μM), troglitazone (10 μM), rosiglitazone (5 μM), nicotinamide (20 mM), or GW9662 (10 μM). Activating SirT1 with resveratrol or Pparγ with troglitazone increased Ucp1 while the SirT1 inhibitor nicotinamide mimicked the Pparγ antagonist GW9662 to repress it.
(A) Expression of white genes in 3T3-L1 adipocytes treated with 50 μM resveratrol or vehicle (Veh) overnight on differentiation day 7. *: P<0.05, **: P<0.01 vs. vehicle (n=3).
3T3-L1前脂肪细胞在功能性成分评价中的应用
3T3-L1前脂肪细胞在功能性成分评价中的应用蔡教英;刘姚;王文君;杨武英【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2011(032)021【摘要】脂肪细胞的增殖与分化异常是导致人类肥胖、心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等的发生的主要原因,而3T3-L1前脂肪细胞是国际上公认的研究脂肪代谢的细胞模型,因此脂肪细胞的增殖与分化已成为研究的热点。
本文主要论述3T3-L1前脂肪细胞的体外培养、增殖与分化及调控及其在功能性成分的评价中的应用,以期为预防和治疗肥胖及糖尿病等并发症提供一定的理论参考。
【总页数】5页(P301-305)【作者】蔡教英;刘姚;王文君;杨武英【作者单位】江西农业大学江西省天然产物开发与利用高校重点实验室,江西南昌330045;江西农业大学江西省天然产物开发与利用高校重点实验室,江西南昌330045;江西农业大学江西省天然产物开发与利用高校重点实验室,江西南昌330045;江西农业大学江西省天然产物开发与利用高校重点实验室,江西南昌330045【正文语种】中文【中图分类】TS202.3【相关文献】1.性激素对3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞胰岛素敏感性的影响 [J], 吴静;王宏伟;温宇;胡秀芬2.醛固酮对3T3-L1前脂肪细胞与脂肪细胞内脂素表达和分泌的影响 [J], 王川;张少玲;严励;程桦3.五甲基槲皮素对3T3-L1前脂肪细胞分化及对脂肪细胞PPAR-γ和脂联素mRNA表达的影响 [J], 陈雷;丁一;胡燕;金满文4.新橙皮苷对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及其作用机制 [J], 郭莉霞;孔淑贞;殷钟意;郑旭煦5.GOD-POD法在3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗评价中的应用 [J], 朱晓云;王朋倩;韩曼;刘喜明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
茶多酚与茶黄素对前旨肪细胞3T3-L1增殖与分化的影响
茶多酚与茶黄素对前旨肪细胞3T3-L1增殖与分化的影响孙世利;凌彩金;刘军;潘顺顺;苗爱清;李家贤;庞式;赖兆祥;黄华林【摘要】利用MTT法检测了经不同浓度茶多酚和茶黄素复合物处理24h后的3T3-L1细胞的存活率,倒置显微镜观察细胞的外观形态,油红O染色法检测细胞的分化程度,并检测了分化成熟的3T3-LI细胞内的甘油三酯含量、结果表明:经茶多酚与茶黄素处理后,3T3-L1细胞的存活率明显下降,且以60μg/mL的浓度处理时,细胞存活率最低；贴壁细胞数量明显减少,贴壁细胞变大变圆；茶多酚与茶黄素明显抑制了3T3-L1前脂肪细胞的分化,分化细胞内甘油三酯的含量明显降低.表明茶多酚与茶黄索对前脂肪细胞3T3-L1的增殖和分化具有较好的抑制作用.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)012【总页数】3页(P137-139)【关键词】茶多酚;茶黄素;前脂肪细胞;增殖;分化【作者】孙世利;凌彩金;刘军;潘顺顺;苗爱清;李家贤;庞式;赖兆祥;黄华林【作者单位】广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640;广东省农科院茶叶研究所,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】Q254;S571.1随着社会经济的发展，人们物质生活水平的不断提高，肥胖症的发病率越来越高，我国城市有10%～15%的人患有肥胖症，且有逐年增多和年轻化的倾向。
随着肥胖发病率的迅速增加，与肥胖相关的疾病也呈增长趋势，如糖尿病、心血管疾病、高血压、胆石症和某些癌症等[1]。
茶叶起源于我国，目前茶叶饮料已经在全世界范围内流行。
葛根素改善3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取和胰岛素抵抗
世界科学技术一中医药现代化★中药研究葛根素改善3T3-L1脂舫細施葡萄藉板取和胰岛素抵抗*杨维波m*，韩福祥、刘振明、董红昌、张建华2(1.山东省阳信县中医医院阳信251800 ; 2.北京大学第一医院核医学科北京100034)摘要：目的：探讨葛根素对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR)模型葡萄糖利用和IR的影响及其作用机制。
方法：诱导分化3T3-L1前脂肪细胞为成熟脂肪细胞；用地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细 胞胰岛素抵抗模型。
成功建立模型后，将实验分为5组进行，分别为空白组、模型组、葛根素10 mg.C组、葛根 素100 mg.L-1组、葛根素200 mg.!/1组;其中，空白组不建模，模型组建模但不用药物干预，各葛根素组为在建立 模型后，给予不同浓度的葛根素干预。
用葛根素干预24小时后，以葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定细胞培养 基中葡萄糖浓度，四甲基偶氛峻蓝[3-(4,5-dimehyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，MTl'J比色 法检测细胞增值活力；然后分别用Real time PCR、Western Blot方法检测细胞葡萄糖转运蛋白4 (glucose transporter type4, GLUT4)、鱗脂醜肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)、腺香酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、过氧化物酶体增 殖物激活受体y(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARy)mRNA基因和蛋白表达。
结果：葛根 素干预后，细胞培养基中葡萄糖來度均较模型组降低(P< 0.01) ;GLUT4、PI3K、AKT、AMPK、PPAR7 mRNA水平 及蛋白表达较模型组均增加(P< 0.05)。
高温对3T3-L1前体脂肪细胞凋亡和脂肪沉积的影响
摘 要： 本试验旨在研究高温对 ３Ｔ３⁃Ｌ１ 前体脂肪细胞凋亡和脂肪沉积的影响。 选择 ３Ｔ３⁃Ｌ１ 前体脂肪细胞为研究材料，分别以 ３７．０ 和 ４１．５ ℃ 处理细胞，４ ｄ 后观察细胞凋亡情况，分化处理 ６ ｄ 后，油红 Ｏ 染色观察脂滴的数量，采用实时荧光定量 ＰＣＲ（ ｑＲＴ⁃ＰＣＲ） 技术测定热休克蛋白 家族基因热休克蛋白 ６０（ ＨＳＰ６０） 、热休克蛋白 ７０（ ＨＳＰ７０） 、热休克蛋白 ９０（ ＨＳＰ９０） ，细胞凋亡 相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－３（ Ｃａｓｐａｓｅ⁃３） 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－９（ Ｃａｓｐａｓｅ⁃９） 、 Ｂ 细胞淋巴瘤－２（ Ｂｃｌ⁃２） 和 Ｂｃｌ⁃２ 相关 Ｘ 蛋白（ Ｂａｘ） ，脂肪合成相关基因过氧化物酶体增殖剂激 活受体 γ（ ＰＰＡＲγ） 、脂肪酸合成酶（ ＦＡＳ） 、乙酰辅酶 Ａ 羧化酶（ ＡＣＣ） 、脂肪酸结合蛋白 ２（ ＡＰ２） 、 ＣＣＡＡＴ 增强子结合蛋 α（ ＣＥＢＰα） 和脂肪分解相关基因激素敏感脂酶（ ＨＳＬ） 、脂肪甘油三酯脂 酶（ ＡＴＧＬ） 的 ｍＲＮＡ 表达量。 结果显示：高温处理后，ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０ 的 ｍＲＮＡ 表达量 极显著上调（ Ｐ＜０．０１ 或 Ｐ ＜０．００１） ，同时 Ｃａｓｐａｓｅ⁃３、Ｃａｓｐａｓｅ⁃９ ｍＲＮＡ 表达量也极显著上调（ Ｐ ＜ ０．０１） ，而 Ｂｃｌ⁃２ ／ Ｂａｘ ｍＲＮＡ 比值极显著降低（ Ｐ＜０．００１） 。 细胞内脂滴大量聚集，油红 Ｏ 染色脂 滴着色明显，进一步的研究显示，ＰＰＡＲγ、ＦＡＳ、ＡＣＣ、ＡＰ２ 和 ＣＥＢＰα 的 ｍＲＮＡ 表达量也极显著 上调（ Ｐ＜０．０１或 Ｐ＜０．００１） ，ＡＴＧＬ 和 ＨＳＬ 的 ｍＲＮＡ 表达量极显著下调（ Ｐ＜０．００１） 。 上述结果说 明高温会引起 ３Ｔ３⁃Ｌ１ 前体脂肪细胞的凋亡，促进脂肪酸的合成，抑制脂肪酸的分解，进而增加 ３Ｔ３⁃Ｌ１ 前体脂肪细胞的脂质累积。 关键词： 高温；３Ｔ３⁃Ｌ１ 前体脂肪细胞；凋亡；脂肪合成；脂肪分解 中图分类号：Ｑ９５２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（ ２０２１） ０６⁃３４８７⁃１０
黄连素对脂肪细胞脂联素分泌的影响及分子机制
·124·□经验交流/Exchange of Experience黄连素对脂肪细胞脂联素分泌的影响及分子机制夏文燕 蓝金花 许 荣 吕维名（赣南医学院第一附属医院，江西赣州 341300）摘要：目的 探讨黄连素对3T3-L1脂肪细胞脂联素的影响及作用机制。
方法 将诱导出的3T3-L1脂肪细胞分为三组，分别为对照组、高糖组（25.5 mmol/L）、黄连素组（黄连素20 umol/L+高糖25.5 mmol/L）。
应用Western blot 测定内质网应激蛋白PERK、eIF2a 蛋白水平变化及脂联素蛋白表达水平。
结果 与对照组比较，高糖组脂联素蛋白表达水平下降（P ＜0.05），PERK、eIF2a 蛋白水平升高；黄连素组脂联素蛋白表达水平有一定升高，PERK、eIF2a 蛋白表述水平降低，与高糖组比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。
结论 黄连素可能通过抑制高糖诱发的内质网应激PERK/eIF2a 通路，促进脂联素蛋白分泌水平。
关键词：黄连素；脂联素；内质网应激Effects and Molecular Mechanisms of Berberine on Adiponectin Secretion in AdipocytesXIA Wenyan LAN Jinhua XU Rong LV Weiming（The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou，Jiangxi 341300，China）Abstract：Objective To investigate the effect of berberine on adiponectin in 3T3-L1 adipocytes and its mechanism. Methods 3T3-L1 adipocytes were divided into three groups： control group，high glucose group （25.5 mmol/L）and berberine group（berberine 20 umol/L + high glucose 25.5 mmol/L）. The protein levels of PERK，eIF2a and adiponectin were measured by Western blot. Results Compared with the control group，the expression of adiponectin protein in high glucose group was decreased（P ＜0.05），and the protein levels of PERK and eIF2a were increased in the high glucose group；in the berberine group，the expression level of adiponectin protein was increased，and the expression level of PERK and eIF2a protein was decreased in the berberine group，the difference was statistically significant（P ＜0.05）. Conclusion Berberine may promote adiponectin protein secretion by inhibiting PERK/eIF2a pathway induced by high glucose.Keywords：berberine；adiponectin；endoplasmic reticulum stress作者简介：夏文燕，硕士研究生，主治医师，研究方向：内分泌与代谢学。
3t3-l1脂肪细胞的培养
诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。
DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。
可用2年。
Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。
4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。
诱导操作注意事项：1、一共需诱导3次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够48h，若时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于48h。
2、诱导操作需注意：以6孔板为例，每孔3ml培液，一个6孔板需18ml培液，则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18ul（储存液），DEX7.2ul储存液，胰岛素108ul（储存液）。
脂肪膜细胞相关蛋白对3T3-L1脂肪细胞糖代谢及细胞分化的影响
脂肪膜细胞相关蛋白对3T3-L1脂肪细胞糖代谢及细胞分化的影响王玮; 王振苗; 黄兴全; 姜兰叶; 李秀芬【期刊名称】《《河北医药》》【年(卷),期】2019(041)016【总页数】4页(P2452-2454,2458)【关键词】脂肪膜细胞相关蛋白; 糖代谢; 细胞分化; 脂肪细胞【作者】王玮; 王振苗; 黄兴全; 姜兰叶; 李秀芬【作者单位】075100 河北省张家口市河北北方学院附属第二医院内分泌科; 075100 河北省张家口市河北北方学院附属第二医院药剂科【正文语种】中文【中图分类】R349.1当今社会肥胖人数显著增加，对于脂肪细胞功能的研究也越来越受到人们的关注。
已经证实，肥胖是多种疾病的独立危险因素，过度的脂肪沉积导致的肥胖是现阶段全球范围内亟待解决的健康问题。
研究已证实糖脂代谢紊乱与妊娠期糖尿病的发生、发展过程密切相关[1，2]。
能量摄取和消耗失衡是导致肥胖的根本原因，脂肪组织发挥着重要作用，具体表现为脂肪细胞体积的增大、数量的增多，或两种改变同时发生，从而导致机体脂肪组织堆积，引发肥胖。
有研究表明，肥胖与糖尿病关系密切，其中15%～20%最终发展为糖尿病，反之，也有67%的2型糖尿病患者超重，46%被认定为肥胖[3-6]。
肥胖是能量代谢失衡的结果[7]，当能量摄入超过消耗时，脂肪细胞内脂质堆积，脂肪组织扩张导致脂肪细胞肥大，血供减少，进而引起脂肪细胞内各细胞器功能障碍，线粒体的氧化应激反应和内质网应激导致脂肪细胞因子功能失常[8，9]。
脂肪细胞膜相关蛋白(adipocyte plasma membrane associated protein, APMAP)是由415个氨基酸组成的跨膜蛋白，其胞外域较大，由 355个氨基酸构成;胞内域含41个氨基酸，并且含有19个氨基酸构成的疏水区域形成跨膜结构[10]。
APMAP最初是在 3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中被发现，并且在脂肪细胞分化的过程中从内质网向细胞膜转移，可能参与了成熟脂肪细胞与环境之间的物质交换[11]。
dgat1蛋白结构域
dgat1蛋白结构域
dgat1蛋白是甘油-3-磷酸酯酶1（Diacylglycerol O-acyltransferase 1）的缩写。
它是一种酶，参与甘油三酯合成的最后一步，即将两个脂肪酸酯化到甘油骨架上，形成三酯。
dgat1蛋白结构域是指该蛋白分子中具有特定功能和结构的区域。
根据研究，dgat1蛋白包含多个结构域，其中最为重要的是DGAT 结构域。
DGAT结构域是一个高度保守的结构域，与三酰甘油合成酶家族中的其他成员共享相似的结构和功能。
这个结构域主要负责催化反应，将甘油和两个脂肪酸合成三酰甘油。
dgat1蛋白还含有一些其他功能域，如跨膜结构域和磷酸化位点。
跨膜结构域使得dgat1蛋白能够嵌入细胞膜中，与细胞内外环境进行相互作用。
磷酸化位点则是细胞内信号转导过程的重要调控部分，可以通过磷酸化修饰来调节dgat1蛋白的活性和功能。
dgat1蛋白结构域主要包括DGAT结构域、跨膜结构域和磷酸化位点等。
这些结构域共同参与dgat1蛋白的功能和调控，对甘油三酯的合成起到重要的作用。
3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段抵抗素表达的变化
3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段抵抗素表达的变化杨再刚;李华;徐浩文;张鹏【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2007(011)015【摘要】目的:抵抗素具有直接对抗胰岛素作用,观察3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段过程中抵抗素mRNA和蛋白表达的变化.方法:实验于2006-03/10在郑州大学第一附属医院完成.3T3-L1前脂肪细胞由武汉同济医院儿科馈赠.①将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养瓶,加入含体积分数为0.1小牛血清的高糖DMEM培养液,在37℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养.待细胞融合2 d后,加入体积分数为0.1小牛血清的高糖DMEM培养液培养(含0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5 mg/L胰岛素、1 μmo l/L地塞米松),诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成熟.②分别于诱导分化的第2,4,6,8天采集细胞,采用反转录-聚合酶链反应检测脂肪细胞抵抗素mRNA的表达,以免疫印迹分析方法检测脂肪细胞抵抗素蛋白的表达.结果:①3T3-L1前脂肪细胞分化的形态学变化:诱导分化前细胞呈梭形,胞浆中无脂滴,表现为成纤维细胞样的前脂肪细胞形态,待完全汇合后处于生长停滞期;诱导分化第2天细胞变圆;第4天时细胞变大,变圆,胞浆有少量脂滴出现;第6天脂滴明显增多;至第8天更多的脂滴积累,形成典型的"戒环"样结构.②抵抗素mRNA在3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段表达的变化:3T3-L1脂肪细胞抵抗素mRNA在分化的第2,4,6,8天吸光度值分别为0.16±0.03,0.37±0.07,0.63±0.11和0.96±0.17,相邻两时间点比较抵抗素mRNA的表达差异均有显著性意义(P均＜0.01).③抵抗素蛋白在3T3-L1脂肪细胞分化不同阶段表达的变化:3T3-L1脂肪细胞抵抗素蛋白在分化的第2,4,6,8天吸光度值分别为28 942.5±1 392.7,59 326.7±2 954.3,107 821.6±4 325.1和173 656.5±8 356.7,相邻两时间点比较抵抗素蛋白的表达差异均有显著性意义(P 均＜0.01).结论:抵抗素mRNA及蛋白在脂肪细胞分化成熟过程中表达逐渐升高.【总页数】4页(P2900-2903)【作者】杨再刚;李华;徐浩文;张鹏【作者单位】郑州大学第一附属医院老年病科,河南省郑州市,450052;郑州大学第一附属医院老年病科,河南省郑州市,450052;郑州大学第一附属医院老年病科,河南省郑州市,450052;郑州大学第一附属医院神经外科,河南省郑州市,450052【正文语种】中文【中图分类】R587.1【相关文献】1.3T3-L1前脂肪细胞分化过程中chemerin基因表达水平的变化 [J], 焦谊;王延蛟;李俊红;周众;韩春晨;孙丽丽;连政;张成;关亚群2.抵抗素在3T3-L1前脂细胞分化前后表达量的变化 [J], 赵嘉咏;王一飞;胡红梅;张美英3.抵抗素结合多肽对3T3-L1脂肪细胞分化、脂代谢及葡萄糖转运体4基因表达的影响 [J], 辜楠;郭锡熔;倪毓辉;王玢;张敏;刘峰;费莉;陈荣华4.3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miRNAs表达谱的变化 [J], 凌宏艳;庹勤慧;胡弼;欧和生;刘刚;奉水东;朱炳阳;何剑琴;廖端芳5.蛋白酪氨酸磷酸酶1B在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中表达的变化 [J], 陈月;邹大进;张征;王淼;吴捷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
灵芝醇提物对改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的作用
灵芝醇提物对改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的作用谭孟芳;康信聪;周佳丽;杨兰;刘东波【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2022(43)12【摘要】研究讨论灵芝醇提物对地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响。
采用地塞米松诱导脂肪细胞胰岛素抵抗模型,将细胞分成正常组、模型组、灵芝醇提物组、二甲双胍(阳性对照)组,检测各组的葡萄糖消耗量和甘油三酯含量,分析灵芝醇提物对胰岛素抵抗的影响。
建立模型的地塞米松处理组与正常组相比,1μmoL/L地塞米松处理72 h显著降低了3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量(P<0.05),且胰岛素抵抗状态在24 h内维持稳定,脂肪细胞胰岛素抵抗模型构建成功。
10、50、100 mg/L灵芝醇提物对细胞活力均无显著影响,灵芝醇提物处理细胞24 h能显著提高脂肪细胞的葡萄糖消耗量和细胞内甘油三酯的含量且呈剂量依赖性。
同时灵芝醇提物处理后显著增加了胰岛素受体底物1、葡萄糖转运体-4、磷脂酰肌醇-3-激酶p110亚基、磷脂酰肌醇-3-激酶p85亚基、磷酸化蛋白激酶、磷酸化糖原合酶激酶3β蛋白的表达。
结果表明灵芝醇提物通过IRS1/PI3K/AKT 信号途径改善地塞米松诱导的脂肪细胞胰岛素抵抗。
【总页数】8页(P22-29)【作者】谭孟芳;康信聪;周佳丽;杨兰;刘东波【作者单位】湖南农业大学园艺学院;国家中医药管理局亚健康干预技术实验室;湖南作物种质创新与资源利用重点实验室;植物功能成分利用省部共建协同创新中心【正文语种】中文【中图分类】R58【相关文献】1.家蚕醇提物逆转脂肪细胞胰岛素抵抗作用的研究2.荭草素抑制3T3-L1前脂肪细胞分化及其改善胰岛素抵抗的作用研究3.Vaspin通过胰岛素信号通路改善地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗4.小麦烷基间苯二酚对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗改善作用及机制5.小麦烷基间苯二酚对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗改善作用及机制因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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石元刚
第三军医大学营养与食品卫生学教研室 （第三军医大学 · 重庆 · 400038）
一、脂 肪
脂类（lipids)是由碳、氢、氧三种元素组成。 营养学上重要的脂类主要有甘油三酯
（triglycerides)、磷脂（phospholipids)和固 醇类（sterods）物质。
糖类 葡萄糖
蔗糖 果糖 乳糖
常 见 糖 类 G1
G1 100 65.0±6.3 23.0±4.6 46.0±3.2
糖类 麦芽糖 锦白糖
蜂蜜 巧克力
G1 105±5.7 83.8±12.1 73.5±13.3 49.0±8.0
常 见 食 物 G1
食物名称
G1
食物名称
G1
馒头
88.1
柑桔
43
土豆
66.4
❖ n-3脂肪酸 α-亚麻酸（C18 : 3W3,6,9） 二十碳五烯酸（C20 : 5W3,6,9,12,15） EPA 二十二碳六烯酸（C22 : 6W3,6,9,12,15,18）DHA
❖ n-6脂肪酸 亚油酸（C18:2W6,9） 花生四烯酸（C20 : 4W6,9,12,15） AA
多不饱和脂肪酸功能
降血脂：20世纪30年代就发现PUFA有降血脂而防 治心血管疾病功能。 形成类二十烷酸(如前列腺素、凝血烷、白三烯等 )，在调节细胞间生理的相互作用中起重要作用。 n-3 PUFA(如EPA、DHA)虽然促生长作用弱，但对 脑、视网膜、皮肤和肾功能健全十分重要。
切记：多不饱和脂肪酸摄入不是越多越好！！
（四）脂肪酸
脂肪酸命名
脂肪酸的化学式为R-COOH，其中R为碳原子所组 成的烷基链。
甲基
羧基
CH3—CH2 — CH2— CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—COOH
△编号系统 10 9
8
7 6 54 32 1
n或ω编号系统 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
脂肪酸分类 按碳链长短分：长(≥14)、中( 8 ～12)、短 (≤6)链脂肪酸 按饱和程度分：饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸。不 饱和脂肪酸按照双健的空间构型分为： 顺式、反式脂肪酸。
❖ 促进动脉硬化作用； ❖ 导致血栓形成； ❖ 影响生长发育：反式脂
肪酸可通过胎盘转运给 胎儿。对生长发育的影响包括：
1.使胎儿和新生儿比成人更容易患上必需脂肪缺乏 症，从而影响生长发育；
2.对中枢神经系统的发育产生不良影响，抑制前列 腺素的合成，从而干扰婴儿的生长发育。
（六）磷脂和胆固醇
磷脂功能
猕猴桃
52
大米饭
83.2
葡萄
43
烙饼
79.6
柚子
25
南瓜
75
苹果
36
苕粉
34.5
梨
36
荞表面
59.3
鲜桃
28
西瓜
72
扁豆
38
玉米面
66
绿豆
27
红薯（生）
54
面包
37
山药
51
可乐
40.3
酸奶
48
大豆
18.0
牛奶
27.6
花生
14.0
（五）碳水化合物的膳食考摄入量 与食物来源
（1）膳食参考摄入量 人体对碳水化合物的需要量，常以占总供
不饱和脂肪酸还可根据不饱和双键在碳链上出现的位 置，即在第几个碳原子开始出现不饱和双键分为ω-3， ω-6，ω-9三型(或称n-3，n-6，及n-9型)，其中尤以前 二者更为重要。
饱和脂肪酸 油酸 亚油酸
α-亚麻酸
多不饱和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acid;PUFA)
脂类不仅是人体必需的三大产能营养素之一，也 是构成人体细胞的重要成分。
（一）分 类
脂肪(甘油三酯) :也称为中性脂肪，由三个脂肪酸分 子与一个甘油分子酯化合而成。膳食中甘油三酯来 源于动物和植物脂肪，如猪油、牛油、菜油、豆油、 麻油。占食物脂类95％。
类脂
固醇类---胆固醇、植物固醇
(占食物脂类5％) 磷酸甘油脂--卵磷脂、脑磷脂
（二）碳水化合物的消化吸收
淀粉
—口腔中唾液淀粉酶约水解 40%
—胃中盐酸水解少量
—小肠中：胰淀粉酶约水解 50%，肠淀粉酶水解少量
麦芽糖
乳糖
蔗糖
—小肠中的麦芽糖酶 —小肠中乳糖酶 —小肠中蔗糖酶
葡萄糖
半乳糖
果糖
糖异生
由非碳水化合物转变为葡萄糖或糖原的过程，称 为～。非碳水化合物主要是乳酸、丙酮酸、甘油、丙酸盐 及糖氨基酸。糖异生的主要场所是肝脏。
（七）脂类食物来源及供给量
人类膳食脂肪主要来源于动物脂肪组织和肉类以 及植物种子。
动物脂肪相对含饱和脂肪酸(40％～60％)和单不 饱和脂肪酸(30％～50％)多，而多不饱和脂肪酸 含量较少。植物油主要含不饱和脂肪酸(80％～90 ％)。
亚油酸普遍存在于植物油中。在膳食中常见的亚 麻酸来源是豆油和菜籽油。
橄榄油被称为“植物油皇后”
茶油中MUFA含量也达80％以上，棕榈油中含量约40％ 以上。
（五）必需脂肪酸
概念： 人体内可以合成多种脂肪酸，它们可以由氨基
酸转变，也可以由糖类转变，但有的脂肪酸是人体 不可缺少而自身又不能合成的，必须通过食物供给， 称为必需脂肪酸(essential fatty acid, EFA) 。
生理意义 ❖ 保持饥饿时血糖的相对稳定 ❖ 促进肌乳酸的充分利用 ❖ 有利于肾脏排H+保Na+
（三）碳水化物的生理功能
储存和提供能量 构成机体组织及重要生命物质 碳水化合物对机体某些营养素的正常代谢
关系密切 保肝、解毒
（四）血糖生成指数
食物血糖生成指数，简称血糖指数，指餐 后不同食物血糖耐量曲线在基线内面积与标准 糖（葡萄糖）耐量面积之比，以百分比表示。
能量的百分比来表示。中国营养学会根据目前我 国膳食碳水化合物的实际摄入量和FAO/WHO的建 议，建议膳食碳水化合物的参考摄入量为占能量 摄入量的55%～65%（AI）。
（2）食物来源 膳食中淀粉的来源主要是粮谷类和薯类
食物。粮谷类一般含碳水化合物60%～80%， 薯类含量为15%～29%，豆类为40%～60%。
（一）分 类
分类(糖分子DP) 亚 组
组成
单糖
葡萄糖、半乳糖、果糖
双糖
蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖
糖（1～2）
糖醇
山梨醇、甘露糖醇、木糖醇
异麦芽低聚糖 麦芽糊精
寡糖（3～9） 其它寡糖
棉籽糖、水苏糖、低聚果糖
多糖（≥10）
淀粉 非淀粉多糖
支链淀粉、直链淀粉、变性淀粉
纤维素、半纤维素、果胶、亲水胶 质物（hydrocolloids)
常见食物中胆固醇的含量(mg/100g)
品名 火腿肠 腊肠 火腿 羊肝 羊肉(肥) 羊脑 牛肉(肥) 牛肉(瘦) 烤鸭 酸奶
胆固醇 57 88 98 349 148 2004 133 58 91 15
品名 猪肝 猪脑 猪舌 鸡蛋 鸡蛋黄 鹌鹑蛋 鸡肝 鸭蛋(咸) 鸡腿 豆奶粉
胆固醇 288 2571 158 585 2850 515 356 1576 91 90
人体的必需脂肪酸有两种，即ω-6型的亚油 酸和ω-3型的α-亚麻酸。
Hale Waihona Puke 必需脂肪酸的生理功能❖ 在体内参与磷脂合成，并以磷脂形式出现在线 粒体和细胞膜，即组织细胞的组成成分。
❖ 与脂质和胆固醇代谢有关 ❖ 合成前列腺素的前体。 ❖ 与生育有关。 ❖ 对x射线引起的皮肤损害有一定保护作用：
反式脂肪酸的危害
13~
25~30
18~
20~30
300
60~
20~30
300
（脂肪能量占总能量的百分比）
二、碳水化合 物
碳水化合物是由碳(C)、氢(H)和氧(O)组成的有 机化合物，它与蛋白质和脂肪合称为人体必需的 三种宏量营养素。
碳水化合物构成地球上绝大多数生物的原料，因 此碳水化合物也构成我们大部分食物的主要成分， 是人类最丰富的膳食能量来源，占总能量摄入量 的50％～70％。
中国营养学会推荐，成人的脂肪摄入量应控制在 总能量的20%-30%。必需脂肪酸的摄入量，一般 认为应不少于总能量的2%-3%，(婴儿需要量大于 成人，应达3%)。多不饱和脂肪酸也不是越多越 好，建议的比例不超过总能量10%。
近年引人注目的n-3多不饱和脂肪酸EPA、DHA的 需要量尚无定论，初步认为应占总能量供给量的 0.5％左右，即可满足儿童生长发育和怀孕、哺 乳期妇女的需要。
❖ 构成细胞膜的重要成分 ❖ 对脂肪的吸收和转运以及储存脂肪酸，特别是不
饱和脂肪酸起着重要作用 ❖ 是神经细胞的主要结构脂类，与脑功能密切有关
胆 固 醇
人体中胆固醇有两个来源: 一来自膳食, 即外源胆固醇； 二在人体肝脏内合成，即内源 胆固醇。 功能
①组成细胞膜结构重要成分。 ②是肝脏合成胆汁酸的原料，促进脂肪消化吸收。 ③生成某些重要的激素(如雄激素、肾上腺素、雌激 素等)及维生素D3。
④抗癌---维持“噬变异白细胞”生存。
❖ 危害 长期高胆固醇饮食导致的高胆固醇血症，进而并
发动脉粥样硬化与心脑血管疾病。
但胆固醇具有众多的生理功能，是重要的营养物质， 只有长期过多摄人、血中浓度过高时才有导致动脉粥样硬
化的危险，故应该一分为二进行分析，不应盲目摒 除胆固醇的正常摄入。我国建议胆固醇的每日摄 人量不要超过300mg。
磷脂
神经鞘脂--神经鞘磷脂
甘油
脂肪酸
甘油三酯
卵磷脂
胆碱
胆固醇 白三烯 A4
前列腺素 E2
乙醇胺 丝氨酸