单克隆抗体制备标准化操作方案
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。
二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。
将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。
三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。
四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。
例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。
单克隆抗体制备技术
单克隆抗体制备技术单克隆抗体制备标准化操作方案（McAb—sop）第一章：小鼠免疫第二章：细胞融合第三章: 细胞建株第四章：细胞株鉴定第五章：腹水制备第六章：抗体纯化和鉴定(略）第一章. 小鼠免疫（BALB/c）小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证.一.小鼠免疫分两程方案：根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:1.短程免疫方案:第一次: 1d 100ug（可溶性Ag)+等体积完全佐剂。
腹腔注射。
0.4ml/只第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂腹腔注射。
0.4ml/只第三次: 12d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第四次：15d 20ug IV 0。
3ml/只第17 d~24d内融合2长程免疫方案:第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂腹腔注射（IP）0。
4ml/只第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂IP 0。
4ml/只第三次：21d 100ug IP或IV 0.4ml/只第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只第30d~37d内融合。
注意:a。
在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1：32000,方可做融合。
b。
免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量.二．小鼠免疫质控标准1．免疫鼠血清滴度短程≥1:8000，长程≥1：32000；2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。
免疫鼠选择：免疫种类为：balb/c小鼠；性别。
雌性佳；大小:6—7周龄：体重：20g;健壮。
活泼。
第二章．细胞融合一．融合前准备1．脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏,并制成单个脾细胞悬液,每只鼠的脾细胞约1～3亿.在制备过程中严格保证无菌。
制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。
1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。
2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。
3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。
4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。
克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。
5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。
6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。
单抗制备工艺
单克隆抗体制备主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、单抗的鉴定及制备等。
1 动物免疫根据抗原的特性选择合适的免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。
常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。
（1）初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般1.5ml,间隔3周。
（2）第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周。
（3）第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周。
（4）加强免疫，剂量50ug，腹腔注射。
（5）3天后，取脾融合。
2细胞融合（1）饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞的准备：①用6-10 周龄的BALB/c小鼠。
②拉颈处死，浸泡于75%的酒精，消毒3min,用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。
用吸管注入6ml培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。
③放入10ml离心管，1200rpm离心5min.④用20%小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1*105/ml.加入96孔板，100ul/孔。
放入37度孵箱培养。
（2）骨髓瘤细胞的准备①于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养②融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。
③1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。
④加入30ml不完全培养基，离心洗涤一次。
然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。
⑤取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台酚蓝染液作活细胞计数后备用。
（3）脾细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。
同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项制备步骤如下：1.免疫原选择：选择具有免疫原性的抗原作为单克隆抗体制备的靶点。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等。
2.动物模型选择：根据免疫原的性质选择适合的动物模型，如小鼠、兔子等。
应考虑动物模型对免疫原的免疫响应情况以及制备成功的单克隆抗体的应用价值。
3.免疫原注射：将免疫原注射到动物模型体内，通常通过多次注射来诱导免疫反应。
在注射前，可以选择适当的佐剂来增强免疫原的免疫原性，如完全弗氏佐剂或委氏佐剂。
4.混合细胞瘤的制备：在免疫原注射后，等待免疫反应充分发生。
细胞瘤可用于细胞融合，产生融合细胞并筛选单克隆抗体。
常用的细胞瘤包括SP2/0和NS-15.细胞融合：将免疫小鼠脾细胞和癌细胞融合成杂交瘤细胞。
融合的常见方法有聚乙二醇融合法和电融合法。
6.肿瘤细胞筛选：将融合细胞播种在含有选择剂的培养基上，通过选择剂来杀死未融合细胞和不产生抗体的融合细胞，留下产生单克隆抗体的细胞。
7.单克隆抗体筛选：对产生的单克隆细胞进行筛选，常用的方法有ELISA和细胞免疫荧光检测。
8.单克隆抗体培养：将筛选出的单克隆细胞进行扩增培养，获得大量的细胞。
9.单克隆抗体纯化：将培养得到的细胞培养上清进行蛋白A/G亲和层析柱纯化，获得纯化的单克隆抗体。
10. 单克隆抗体鉴定：通过Western blot、免疫组化或其它适当的方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。
注意事项如下：1.免疫原的选择应根据具体实验要求合理选择，确保其免疫原性和制备成功的单克隆抗体的应用价值。
2.在注射免疫原前，应充分考虑动物模型对所选择免疫原的免疫响应情况，并进行充分的预备实验和试验。
3.免疫小鼠注射免疫原时，需要严格控制免疫原注射的剂量和频率，以避免过度免疫导致不良反应。
4.细胞融合时，应根据实验要求选择合适的融合方法，并注意细胞融合的时间和条件，以获得高效的细胞融合率。
5.单克隆抗体筛选和鉴定时，应使用多种合适的方法进行综合评估，确保获得特异性和亲和力较高的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备标准流程
单克隆抗体旳制备流程（一）动物旳选择与免疫1．动物旳选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝旳活动范畴小，体弱，食量及排污较小，一般环境干净旳实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术旳实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适旳免疫方案对于细胞融合杂交旳成功，获得高质量旳McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原旳特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不适宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是某些弱抗原）旳免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原旳免疫原性，另一方面可减少抗原旳使用量。
②变化抗原注入旳途径，基本免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体旳免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原旳反映性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得较好旳免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时规定抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓取脾融合（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系旳选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散旳细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可增进这些细胞生长繁殖，所加入旳这种细胞数被称为饲养细胞。
单克隆抗体的制备方法
三、操作流程
（一）脾细胞
1．材料
(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。
(2) 1640培养液
(3) 2.5％FCS－1640营养液
2．操作方法
(1) 拉颈或用CO2处死小白鼠。
(2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X？ - —Ag8·6·5·3（简称653）；④FO
以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
(8)重复⑹、⑺步骤。
(9)计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
（二）骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。
选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度, 最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。
骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。
由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤。取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。
单克隆抗体研制的详细步骤
单克隆抗体研制的详细步骤一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
因为常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来很多麻烦。
所以，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这个目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不但带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促动了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
单克隆抗体制备简要流程
单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6月）准备抗原动物免疫选择免疫动物Elisa测抗血清细胞融合（融合剂:PEJ）HAT培养基筛选杂交瘤细胞筛选阳性细胞（三天内做完流式）阳性克隆并扩大培养细胞冻存扩大培养收集上清单克隆抗体纯化保存1、抗原提纯与动物免疫：选择BALB/c健康小鼠。
如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。
免疫3～4只小鼠，间隔一般2～3周，末次免疫后3～4天，分离脾细胞。
2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞3、细胞融合将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。
其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。
注意：细胞比例、培养液成分、反应时间4、有限稀释法筛选阳性株筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至个细胞/孔）细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。
首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
5、单克隆抗体的制备与保存筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。
选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。
通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，冻存。
6、单克隆抗体的纯化硫酸铵沉淀法。
单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入7mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入3mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入2mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
单克隆抗体制备标准化操作方案
单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop)第一章: 小鼠免疫第二章: 滋养细胞的制备第三章: 细胞融合第四章: 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞 (ELISA法) 第五章: 杂交瘤细胞的亚克隆培养第六章: 杂交瘤细胞系的冻存与复苏第七章：腹水制备第八章：附件第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。
好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。
小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。
但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。
上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。
常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。
（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。
单克隆抗体制备规范操作
单克隆抗体制备规范操作融合准备工作：融合前3天小鼠追加免疫，用灭菌的2兆水稀释抗原，足掌免疫100微克抗原/鼠，50微克/脚，50微升/脚，注意追加免疫后3-6天内融合，因为此时抗体效价较高。
融合所有用到的实验材料和工具(剪过枪头和分装液体盒)进行高压灭菌，并对小鼠骨髓瘤细胞进行传代处理(要求传入新的培养瓶中，密度达到60-70%，并且选择不同的浓度梯度以确保第二天的融合时有最佳状态的细胞)。
融合操作步骤：实验前，将PEG和100ml R-1640培养液放入37℃水浴锅中孵育。
眼球采血处死小鼠（回收血液制备阳性血清用于下一步的ELISA筛选），75%的酒精浸泡消毒，取出小鼠股内侧沟淋巴结，随后把淋巴结放入4℃R-1640培养液（含2×双抗）（准备3个培养皿，一用来剪除淋巴结上的结缔和脂肪组织；二是用来清洗淋巴结；三是用来剪碎和撕碎淋巴结的，制备免疫小鼠的淋巴细胞）。
把含有淋巴细胞或脾细胞的悬液经过有棉花（好的脱脂棉）的吸管过滤，除去残渣，分离细胞。
过滤好的细胞2000r/min，10min。
制备足够多的骨髓瘤细胞（Ag8.8），1500r/min，10min，（每次用4℃R-1640培养液漂洗骨髓瘤细胞，洗3次以上，目的去除培养骨髓瘤细胞的培养液中的的血清，因为血清中的蛋白成分有抑制融合的作用）。
淋巴细胞和骨髓瘤细胞同时洗涤3次以上，要求2000r/min，10min，用10ml 4℃R-1640不完全培养液悬浮骨髓瘤细胞，第4次洗涤前全取淋巴细胞，按照淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：1的数量比（淋巴细胞：骨髓瘤细胞=1：5的体积比）取骨髓瘤细胞，将两种细胞混匀，加入37℃R-1640不完全培养液至50ml，2000r/min，5min，弃除上清液。
（注意：每次离心完毕要求尽量将上清液吸干净）加入预热的1ml PEG融合剂，加入过程中注意缓慢加入（速度：保持一滴一滴地滴入），并且边加边用吸管头轻轻拨动细胞团。
单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN
无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常用的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。
擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。
取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。
每次采血量0.1ml。
方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升，加在盛有97.5微升的PBS缓冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。
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单克隆抗体制备标准化操作方案抗体, 单克隆, 方案, 制备, 标准化第一章: 小鼠免疫第二章: 滋养细胞的制备第三章: 细胞融合第四章: 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞 (ELISA法)第五章: 杂交瘤细胞的亚克隆培养第六章: 杂交瘤细胞系的冻存与复苏第七章：腹水制备第八章：附件第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。
好的免疫果:血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。
小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。
但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。
上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。
常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。
（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。
为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后10天左右应从尾部取血，检查抗体滴度。
另外，还有脾内注射法和体外培养法。
第二章饲养细胞的制备体外培养细胞时，一般单个或极少数分散状态细胞是不能存活的（或生长不良）必需加入一定量的其他细胞达一定的密度才能生长得好，加入的细胞称为饲养细胞。
用细胞融合术建立杂交瘤细胞时，饲养细胞的加入是不可缺少的，常用的有正常小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞，也有人用经过照射或丝裂霉素处理的纤维母细胞，如3T3或Putler等。
一、实验材料1.1 RPMI-1640完全培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.3。
1.2 HAT培养液或HT培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.4和2.5。
1.3 实验动物： Balb/c或昆明种健康小鼠（雌雄均可）1只，6～10周龄，体重18～ 22克，本院动物中心繁殖和饲养。
每只小鼠可取得3～5×106 的滋养细胞，可供铺6块板用，应在融合或克隆前1～2天制备。
1.4 离心机一台，血细胞计数板，无菌塑料离心管，96孔细胞培养板。
小鼠解剖台板或平皿；无菌眼科剪刀、镊子各数把；大镊子一个；止血钳两个。
一次性5ml注射器2套。
二、实验方法2.1 将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精5分钟，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。
2.2 用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流。
然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
2.3 用注射器吸取5ml RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，晃动小鼠或反复抽吸几次。
用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。
如此反复操作3～4次。
2.4 1000rpm离心10min，弃上清。
2.5 用20～50ml完全培养液重悬细胞，100μl/孔滴加到培养板，置培养箱备用。
2.6 观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强。
第三章细胞融合细胞融合是人工定向制造新细胞品系的重要手段，也是制造单克隆细胞系的关键技术。
在保证有良好的亲本细胞、稳定和良好的培养体系的条件下，细胞融合的成败和融合率则取决于融合剂和操作技巧。
细胞融合的助融剂和助融手段主要有三种；生物学方法：用仙台病毒或鸡新城疫病毒作助融剂。
物理学方法：用电融合仪发出的脉冲电流使相邻的两细胞穿孔而融合。
化学方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融剂。
PEG作助融剂是比较方便简单的操作方法，具体方法如下：一、实验材料1.1 眼科镊子、剪刀数把、固定板。
1.2 37℃温水。
1.3 酒精灯、离心管架、离心管、离心机、5-10ml吸管、1ml吸管、滴管、计数池、平皿数个。
二、实验试剂2.1 融合剂：50%PEG W=3000PEG3000 1gRPMI1640 1ml8-10磅灭菌2.2 基础培养液（RPMI1640）RPMI1640 一包 (10.4g)L-G （L-谷氨酰胺） 0.3gHEPES 3.0g碳酸氢钠 3.0g庆大霉素一支三蒸水加至 1000ml2.3 1640完全培养液基础培养液 180ml胎牛血清 20ml2.4 HT培养液（终浓度H为1×10-4M，T为1.6×10-5M）基础培养液 197.5mlHT浓缩液（100×） 2.5ml胎牛血清 50ml一次融合约配250毫升2.5 HAT培养液（终浓度A为4×10-7M）基础培养液 197.5mlHAT浓缩液（100×） 2.5ml胎牛血清 50ml2.6 细胞冻存液1640完全培养液 70mlDMSO 10ml胎牛血清 20ml2.7 3%醋酸溶液30%乙酸 10mldH2O 90ml三、实验步骤3.1 脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75%酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500~2000rpm 离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×108个细胞待用。
3.2 骨髓瘤细胞制备：取3瓶生长状态良好的（活细胞数>95%）骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500~2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，RPMI1640稀释10倍，计数，取2×107个细胞待用。
3.3 细胞混合：脾细胞:骨髓瘤=5：1，混合，1500~2000rpm离心5分钟。
注意：由于细胞融合是个随机过程，母细胞比例不一，会影响融合产物；或是两种母细胞融合而成的杂交细胞，或是一种细胞自身融合产物。
多数实验者采用骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，甚至是1：1。
减少脾细胞用量目的是降低脾细胞自身融合的机率。
3.4 细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，3.5 细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入HAT培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中。
10ml吸管滴加1滴（配8ml/板），排枪滴加80~100微升（配10ml/板），37℃，CO2培养箱培养、观察。
3.6 细胞培养、换液：细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、每孔杂交细胞瘤个数、块数、培养液有无污染、饲养细胞的状况。
培养3~5天HAT 培养液换液一次，10天换HT培养液培养至20天，换1640完全培养液。
四．HAT选择培养液的作用在细胞融合时，可以出现：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，脾细胞之间的融合，骨髓瘤之间融合，此外还有大量的未融合细胞。
如何除去大量未融合及自身融合的细胞呢？下面简介HAT液作用。
谷氨酰胺（L-Glutamine），尿核苷单磷酸都是正常细胞及肿瘤细胞用来合成DNA的重要成分（主要途径），但是这条途径可以被氨基喋呤（Aminopterin）切断。
另外还有一条应急途径即细胞内的HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转化酶）利用（H）和TK（胸腺嘧啶激酶）利用（T）合成DNA。
骨髓瘤细胞株是经过8-偶氮鸟嘌呤筛选出来的，不含HGPRT，因此不能借用应急途径合成DNA，只能靠主要途径合成DNA。
骨髓瘤细胞在HAT液中，因缺少HGPRT和TK，不能利用H·T 合成DNA，主要途径又被氨基喋呤阻断，因此细胞死亡。
免疫鼠脾细胞，虽含有HGPRT但不适应体外培养，一般十天左右自然灭亡。
杂交细胞，在融合时脾细胞的HGPRT被带入，通过应急途径利用H·T合成DNA，并继承骨髓瘤细胞体外繁殖的特性，所以能存活。
一般融合后常用含20%胎牛血清培养液，通过筛选，亚克隆选出有关杂交细胞后，则可换成含10%胎牛血清培养液。
对已确定的杂交瘤株，则可换成含5%胎牛血清的培养液培养。
第四章筛选分泌抗体的杂交瘤细胞融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体活性。
许多方法都可以用来筛选，但应注意到筛选单克隆抗体时的一些特点；首先，培养上清中的抗体含量低于高效抗血清的抗体含量。
其次，与普通抗血清不同，单克隆抗体不能多价地识别抗原。
所以用来筛选单克隆抗体的方法应照顾到单克隆抗体的特点，而且要准确、迅速和方便。
此外应根据所需要抗体的特点，选择不同类型的方法。
一般常用的有：免疫荧光、放射免疫（RIA）、组织化学法和酶联免疫分析（ELISA）法等。
最经常用方法是ELISA法。
在收集上清时，应在上次换液后3-4天进行，以便抗体积累。
上清可不经稀释或1：5~1：10稀释后再测抗体活性，用稀释抗体进行筛选时可以筛掉弱阳性的抗体，也可以去掉因高本底所造成的假阳性。
融合后第一次筛选出的阳性克隆可能因阴性克隆或其他阳性克隆的过度生长而丢失，故应尽早亚克隆。
第一次筛选后也可能没筛选到阳性抗体，这可能由于分泌阳性抗体的细胞为数尚少，应重复测定活性2-3次。
现将ELISA法检测杂交瘤细胞抗体的方法介绍如下：（一）实验试剂6．终止液（2M H2SO4 ）取浓H2SO4 27.62ml，缓缓加入到473ml的蒸馏水中，混匀即可。
注意在加入硫酸的过程中，不要加得太快，以免过热。
8．辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（已商品化）。
（二）实验步骤1．抗原包被：纯抗原浓度一般为1~2μg/ml，用包被液稀释后取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。