第八章现代生物学资料

¡SPR 生物传感器不需要借助任何标记即可用 于分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子、蛋 白质-核酸和蛋白质-脂的相互作用。
2 SPR 仪结构
¡ 在 1990 年 BIAcore 公司首先利用 SPR 原理制 作了商品化的生物传感器，是 SPR 生物传感 器的主要生产厂家。BIAcore 的 SPR 生物传 感器系统核心部分是传感片、SPR 光学测定 系统和微射流卡盘（图 为常用 SPR 仪实物 图）。
¡信号检测：激光共聚焦检测 、电荷藕合 器件（CCD）检测
¡数据处理：应用一定的计算机软件对检 测中的扫描图进行处理，形成数据，得 出结论。
6蛋白质芯片的特点
快速、定量分析大量蛋白质； 使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标
本即可进行分析和检测； 采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好； 所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，

DNA结合结构域
A
转录激活结构域
B
活性转录因子
C
2 酵母双杂交的组成
¡酵母双杂交系统由三个部分组成：ห้องสมุดไป่ตู้BD 融合的蛋白表达载体，被其表达的
蛋白称诱饵蛋白（bait）； AD 融合的蛋白表达载体，被其表达的
蛋白称为靶蛋白（prey）； 有一个或多个报告基因的宿主菌株。
3 应用
¡酵母双杂交技术主要应用在以下几方面：
III. 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面， 而其编码基因作为病毒基因组中的一部分 可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导 出来。
¡目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系 统有：
丝状噬菌体展示系统
λ 噬菌体展示系统
T4 噬菌体展示系统
T7 噬菌体展示系统
¡其中，T7 噬菌体系统可以高、中、低拷贝展 示不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展 示系统。
研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低 耗、快速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前 新药开发工作的重中之重。蛋白质芯片高通量、并 行性的特点，大大地加快了化合物的筛选速度。
蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。
利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达就 可以确定被检药物对人体是否有毒副作用，或达到 多大剂量才会引起毒副作用。
检验一对功能已知蛋白间的相互作用； 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域； 途径； 分析新基因的生物学功能。
第三节 表面展示技术
¡运用 DNA 重组技术在噬菌体、细菌、真菌、 病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已 在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技 术等方面得到了广泛应用。
图 典型的蛋白质微阵列芯片
2 蛋白质芯片的分类
¡ 根据用途的不同蛋白质芯片可分：
蛋白检测芯片
蛋白功能芯片
¡ 蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性 的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片 段抗体、受体等固定在载体上，制备检 测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、 目标多肽和蛋白等。
¡蛋白功能芯片：将天然蛋白、酶或酶底物固 定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活 性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行 蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白DNA-RNA结合以及蛋白-酶反应的研究。
概念
¡ 表面展示技术是利用基因工程手段将外 源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸 片段克隆到特定的表达载体中，使其表 达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以 融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌 体表面。
一、噬菌体展示技术
¡噬菌体展示技术（phage display techniques，PDT） 是将外源肽或蛋白质与特 定噬菌体衣壳蛋白融合并 展示于噬菌体表面的技术 （如右图所示）。1985 年 Smith 等首次应用了该 技术。
¡ 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之 表达于噬菌体颗粒的表面，就形成了噬菌体抗 体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克 隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬 菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库（phage antibody library）。
3 噬菌体展示技术的局限性
(1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬 菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌 过程，这就大大限制了所建库的容量和分子 的多样性。
2 应用
（1）噬菌体展示技术与蛋白质工程
将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到 噬菌体（2）噬菌体展示技术与抗体工程
噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入 第三次革命。噬菌体展示技术的成功应 用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆 抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲 和力和特异性都令人满意的并且修饰过 的抗体。
1 原理
待分析物 （芯片上）
高能激光
不同m/z的离子
发现捕获 新蛋白
与基因库中图谱比对
仪 器 场 中 飞 行
质谱图
电 脑 处 理 显示蛋白信息
2 组成
SELDI-TOFMS
蛋白质芯片 飞行质谱仪 分析软件
3 应用
¡ 结合生物信息学的分析方法从大量的蛋白质和 多肽中筛选出潜在的生物标记物，建立高特异 性和敏感性的蛋白质指纹图谱模型。
1 原理
g3 signal
¡ 具体来讲噬菌体展示s技fiI 术scF就v 是将待筛选
基因插入噬菌体信号肽序列No与tI 主要衣壳 E-tag
蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）之 pCANTAB 5E-scFv
Amber stop
Ap
5243 bp
间，构成融合蛋白噬菌体库fd。gen表e3 达的融
合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影
第八章 现代生物学技术在蛋
白质工程中的应用
传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳 技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、 酶联免疫吸附测定（ELISA）
新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片 技术、蛋白指纹图谱技术；研究蛋白质相互作 用的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术； 用于功能蛋白质筛选的表面展示技术
(2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的 表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、 转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需 于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表 达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物 毒素分子，很难得到有效表达和展示。
二、核糖体展示技术与 mRNA 展示技术
¡ 核糖体展示（Ribosome display）技术与 mRNA 展示技术由于在体外无细胞翻译体系 中进行，用 mRNA 的可复制性，使靶基因 （蛋白）得到有效富集而且能够增加表达的蛋白质 溶解度。
第一节 蛋白质分析鉴定技术
一、蛋白质芯片技术
¡ 蛋白质芯片（protein chip）技术是为满 足人们对蛋白质的高通量、大信息量、 平行分析研究而产生的。蛋白质芯片的 产生将基因组学平台和蛋白质组学平台 很好地连接起来。
1 蛋白质芯片的概念
¡蛋白质芯片（protein chip）也叫蛋白质 微阵列（protein microarray)，是将大量 蛋白质有规则地固定到某种介质载体上， 利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白 质与其他小分子之间的相互作用检测分 析蛋白质的一种芯片（如图）。
表面等离子体(SP) 的概念，即是指金属表面沿着金 属和介质界面传播的电子疏密波。
在金属表面, 电子横向(垂直于表面) 运动，受到表面 的阻挡,因此在表面上形成了电子浓度的梯度分布， 进而引起电子振荡，这种振荡即是电子疏密波。
¡SPR 生物传感器广泛的用于各类生物体系的 测定，包括各类小分子化合物（分子量可小 至100 Da）、多肽、蛋白质、寡核苷酸甚至 脂分子、病毒和细胞。
3 SPR 仪的应用
¡抗体/抗原结合动力学 ¡抗原表位/抗体对位的鉴定 ¡临床免疫学中应用 SPR 技术进行免疫诊
断
二、酵母双杂交技术
¡ 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细 胞内研究方法，在蛋白质相互作用研究 方面得到了广泛应用并取得了许多有价 值的重要发现。
1 原理
¡ 1989 年建立 了第一个基于 酵母的细胞内 检测蛋白间相 互作用的遗传 系统，右图显 示了酵母双杂 交系统原理。
（2）临床方面的应用
蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤 其是在疾病的诊断和疗效判定，即生物学标志物 的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值 和前景。如应用于自身性免疫疾病的诊断 ，肿 瘤的早期诊断等。由于蛋白质芯片是在分子水平 进行诊断和预测的，因而它提供了一种更准确的 方法。
（3）新药研制方面的应用
洗脱
¡ 噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高 通量筛选的方法。其建立基于三个原则：
I. 在衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ） 的 N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表 达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰 噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白 的天然构象，并能被相应的抗体或受体所 识别 。
II. 利用固定于固相支持物的靶分子，采用适 当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体， 筛选出目的噬菌体；
3 蛋白质芯片的制备
固相载体的选 择和处理
蛋白质靶标的 处理
将蛋白质靶标点在 固相载体上
蛋白质芯片的封闭
Cavin M等制作出高密度蛋白质微阵列
4 蛋白质芯片中探针的标记
¡探针类型：蛋白质、酶或其它配基 ¡标记物类型：荧光染料、酶，此外还有
红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白 （GFP）
5 蛋白质芯片信号的检测及数据处理
实用性强，其不足在于稳定性及操作复杂等因 素限制。
7蛋白质芯片的应用
（1）基础研究方面的应用
蛋白质—DNA相互作用研究:用生物化学表面 芯片（PS20），以 DNA 作诱饵，结合特异蛋 白质，用质谱法检测，筛查转录因子。
蛋白质-mRNA 相互作用研究:通过mRNA 转 录与 RNA 结合蛋白质的内在联系建立了一种 高通量的方法，用于鉴定在结构上和功能上有 关的 mRNA 转录。