应用PCR_RFLP及PCR_TGGE技术监测农田土壤微生物短期动态变化
农田生态系统微生物多样性研究方法及应用
收稿日期：2008-05-13基金项目：中国科学院创新项目（KZCX2-YW-407）；中国科学院野外台站基金项目和国家科技支撑计划课题（2006BAD05B01作者简介：毕明丽（1984－），女，在读硕士，从事土壤肥力与养分循环研究。
E-mail:bi-yours@ *通讯作者：E-mail:wtyu@农田生态系统微生物多样性研究方法及应用毕明丽，宇万太*（中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳110016）摘要：微生物在农田生态系统中占据着很重要的作用，其结构和功能的多样性及变化在一定程度上反映了农田生态系统的基本状态，因此非常有必要应用有效的方法来研究农田微生物的多样性、分布及行为等。
但是通过传统的微生物培养和鉴定方法得到的微生物信息很片面，不足以代表微生物在农田生态系统中的真实情况。
而近几十年来兴起的微生物研究新方法突破了传统方法的限制，极大地促进了微生物学的发展。
本文介绍了现在常用的微生物多样性研究方法及其在农田生态系统中的应用现状。
关键词：微生物多样性；研究方法；分子生物学；农田生态系统中图分类号：S153.6文献标识码：A文章编号：0564-3945(2009)06-1460-07Vol.40,No.6Dec.,2009土壤通报Chinese Journal of Soil Science第40卷第6期2009年12月微生物是农田生态系统的重要组成部分，在动植物残体分解、养分循环、氮的固定、土壤结构与肥力保持和病虫害防治等方面都起着很重要的作用[1]，微生物的多样性和群落结构在一定程度上反映了农田生态系统的基本状况，保持微生物的生态过程和多样性是农业生产赖以生存的基础。
通过研究农田生态系统中微生物的分布和多样性，探讨农田生态系统的影响因素及其作用机理，可以为今后制定农业管理计划提供科学依据，具有很重要的理论和实践意义。
农田生态系统中微生物种类极其丰富，文献记载1g 农田土壤中就含有几百万细菌、数十万真菌孢子、数万个原生动物和藻类[2]，它们在农田生态系统中起着至关重要的作用。
水稻根际土壤及根组织内外固氮微生物的遗传多样性分析
农业生物技术学报
2007 年
如测序、变性梯度凝胶电泳 （DGGE）(Lovell , 2000)、限制性片段长度多态性 （RFLP）（Poly ., 2001） 和荧光末端标记的限制性片段长度多态性 （TRFLP）(Moeseneder , 2001, Tan , 2003) 均可在很大程度上克服传统方法的不足。所有固氮 微生物中都含有编码铁蛋白的 基因。Young
GA3') 扩增长度为 361 bp 的基因片段，引物来自
基因的编码序列
（GeneBank 登入号 M20568)。25 滋L 反应体系中含
有 1 倍的 PCR 缓冲液，1 倍 Qsolution，200 滋mol/L
dNTP, 各 16.5 滋mol/L 引物, 0.5 U DNA 聚合酶
( ng 的 DNA 模 板 。
) was assessed by a PCRRFLP
approach on the gene directly amplified from DNA extracted from washed rice roots and rhizospheric soil. Restriction digestion
许多重要的作物例如水稻,小麦, 玉米，甘蔗等 在自然土壤中无人为接种的情况下，能借助生物固 氮取得其生长对氮的需求 （Boddey, 1995; Stefan
.,2005）。近年来还发现一些内生菌能定植在水稻 和牧草的根部 (Hurek ., 1994; Engelhard , 2000)，在 它 们 的通 气 组织 内 也 存在 固 氮微 生 物
摘要：利用 PCRRFLP 检测水稻（
）根际土壤及根组织内外固氮微生物的 基因，对 54 个阳性克隆的
PCR—DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用
生态机制和土壤胁迫对 群落的影响。多样性包括 种类数量
及其分布。
２ 土壤微生物多样性研究方法
由于土壤微生物种类繁 多、 数量 巨大 ， 】加上 其微小 的
个体 ， 给土壤微生物 的研究带来很大 的困难。 目前土壤微生
肥力演变、 植物养分有效化 和土壤 结构的形成与改 良、 有毒
物质降解及净化等方面起着重要作用 。数量庞大、 种类 繁多
作者简介： 高淑静 （９８一）女 ， １７ ， 硕士生 ， 主要从事黄瓜根际微生物多样性方面的研究。
维普资讯
生 物信 息 学
Ｃｉ ｕ ａｏ Ｂｏ ｆｍ ｔｓ ｈ ａ ｏｒ ｌ ｆ ｉｎ ｒａｃ ｎ Ｊ ｎ ｉｏ ｉ
专 论 与 综 述
Ｐ Ｒ—Ｄ Ｇ Ｃ Ｇ Ｅ技术在土壤微 生物 多样性研究 中的应用
高 淑静 ， 吴凤芝
（ 东北农业 大学园艺学院， 哈尔滨 １ ００ ５ ３） ０
１ 土壤 微生物 多样性 的概念
土壤微生物多样性 指生命体在遗传 、 种类和生态系统
层次 上的变化 。它代表着微生物群落 的稳定性， 也反映土壤
收稿 日期 －０６— ４ ６修 回日期：Ｏ６—１ —１ ＇ ０ ０ —１； ２ ２Ｏ １ ６ 基金项 目： 国家 自然科学基金项 目（ ｏ３５ １６ ） Ｎ ．０７２ ４
微生物。
态过于简单 ， 并不能提供太多 的信息 。 而且 自 然界 中有 ８％ ５
一
９ ．％的微生 物至今 还不可纯 培养口 ， 给客观认 识环 ９９ ］这
境 中的微生物存在状况造成 了严重障碍。１８ 年 ， ａ ［等 ９６ Ｐｃ ４ ｅ 首先用核酸测序技术研究微生物生态和进化 ， 将分子生物学 技术 应用 于微生物生态学 的研究 ， 开辟了认识环境中微 生物
PCR-DGGE技术在环境微生物研究中的应用
PCR-DGGE技术在环境微生物研究中的应用摘要：PCR-DGGE技术目前已被广泛应用于环境微生物领域。
介绍了PCR-DGGE技术的原理及其优点，概述了PCR-DGGE技术在环境工程废水微生物处理中的应用，分析了PCR-DGGE技术用于生物处理系统中微生物群落多样性和动态性研究的现状，并展望了其应用前景。
关键词：PCR-DGGE技术；微生物；应用变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是目前研究微生物群落结构主要分子生物学方法之一[1]。
该技术系由Fischer和Lerman于1979年最先提出一种用于检测DNA突变电泳技术，该技术使传统琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分辨精确度提高至一个核苷酸残基差异水平。
Muyzer等在1993年首次将DGGE电泳检测技术应用于微生物群落结构研究，并指出该技术在揭示自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显优势。
DGGE技术能快速、准确鉴定自然环境或人工环境中微生物种群，并能揭示复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位和表达调控的评价分析，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域。
1 PCR-DGGE技术原理DGGE技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对DNA进行电泳，该凝胶电泳时能够有区别地解链PCR扩增产物。
在进行变性梯度凝胶电泳时，长度相同而在碱基序列上存在差异的DNA双链的解链需要不同的变性剂浓度。
序列不同的DNA片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。
起初双链DNA以现状向正极移动，随着变性剂浓度的增加，DNA中具有低G+C含量的序列的部分被打开，而高G+C含量的部分仍保持双链。
DNA双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环节（即DNA部分熔化）。
其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降，以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。
PCR—DGGE技术在土壤微生物多态性研究中的应用
１ 传 统 的 研 究 方 法 及 其 缺 陷
１ １ 分离培 养 法 ．
中的磷脂化合物 马上消失。生物中的磷脂类化合物 能显示 出快速 转换率 ， 而且生物 可以把相 对稳定 的磷
脂类化合物与它们 的生物量相联系。磷脂类化合物 的这些特性和磷脂类化合物与生物的密切关系， 可用 过一般的生物化学性状 ， 或者特定的表型来分析 ， 局 作土壤中微生物群落结构指纹分析 …， 为土壤微生 限于从固体培养基上分离微生物。随着人们对土壤 物群落结构的研究提供了一个简便 、 准确的方法。脂 微生物的不断研究 ， 发现常规的用培养基分离培养方 肪酸甲脂分析方法（ａｙａｉ ｍ ｔ ｌ ｔ ｓ Ａ Ｅ ） ｆ ｔ ｃ ｅ ｙ ｓｒ Ｆ Ｍ ｓ 中 ｔ ｄ ｈ ｅ ｅ 法很难全面地估价微生物群落多样性。 比如在实验 应用 较 多 的 有 Ｐ Ｌ—Ｆ ＭＥ Ｐ ｏｐｏｐｄｌ ｋｄ— Ａ Ｓ（ ｈｓｈｌ ｉ ｉ ｅ ｉ ｎ 室 用营 养丰 富 的牛 肉汁 蛋 白胨 来 测定 土壤 活 细 菌 的 Ａ ｓ 和 Ｌ—Ｆ ＭＥ Ｅｔ ｓｎ ｅ Ａ Ｓ（ ｓ ｒｌｋｄ—Ｆ ＭＥ ） 。 ｅ ｉ Ａ ｓ 总数 ， 大量的贫营养微生物不适宜生长 ， 测定结果误 Ｆ ＭＥ ） Ｅ ｏ ｍｕｉ ｙ—ｌ ｌ ｈｓ ｏ ｃ ｏｌ （ Ｌ Ｐ 是 ｖ ｏｇａｐ ｉｎ 差大。所以， 传统的平板培养方法只能反映极少数微 Ｃｍ ｎｔ ｅｅ ｐｙｉｌ ｉ ｌ ｒｆｉｇ Ｃ Ｐ ） 由 传统方法之一是对微生物进行分离培养 ， 然后通 ａ ａｄ ｎ ｉ ｌ ａ ｌ ｓ 微生物 生物的信息 ， 不能充分研究、 了解土壤微生物生态功 Ｇ ｒｎ ｄＭｌ 提出的另一种酶分析方法，
步被分子 生物学方法所替代 。本文在阐述 Ｐ Ｒ—Ｄ Ｇ Ｃ Ｇ Ｅ方法原理 的基 础上 ， 分析 了其 在微 生物多样 性研究 中的
DGGE技术在土壤微生物群落研究中的应用
黑龙江农业科学2010(7):5~8Heilong jiang Ag ricultural Sciences生物技术DGGE 技术在土壤微生物群落研究中的应用宋 洋,李柱刚(黑龙江省农业科学院生物技术研究所/黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室,黑龙江哈尔滨150086)摘要:现代分子生物学的变性梯度凝胶电泳(Denatur ing G radient Gel Electr qphoresis,DGG E)技术是土壤微生物群落研究的有效工具,它直接分离土壤微生物的DN A 片段,比传统的培养方法更具明显的优势,已成为研究土壤微生物的重要手段之一。
对DG GE 技术的原理及其在土壤微生物群落研究中的应用情况、优点和局限性进行了介绍。
关键词:DG GE;土壤微生物;群落结构中图分类号:Q 938 1+5 文献标识码:A 文章编号:1002 2767(2010)07 0005 04收稿日期:2010 03 22基金项目:黑龙江省科技厅国际合作重点资助项目(WB 07A10)第一作者简介:宋洋(1981 ),女,黑龙江省哈尔滨市人,硕士,研究实习员,主要从事微生物菌群分析和分子育种研究。
E mail:achievement81@yahoo com cn 。
通讯作者:李柱刚(1972 ),男,黑龙江省庆安县人,博士,研究员,从事植物分子育种研究。
E mai l:lizhugang@163 com 。
土壤中微生物群落结构对农业的健康、持续发展具有重要作用。
它们积极参与土壤物质转化过程,在土壤形成、肥力演变、植物养分有效化和土壤结构形成与改良、有毒物质纯化及净化方面起着重要作用[1]。
由于土壤微生物的重要性,有关土壤微生物的群落结构及多样性研究受到广泛重视[2]。
但研究结果表明,土壤微生物中可用常规方法分离培养的微生物只占0 1%~1 0%[3]。
因此,传统的微生物培养及鉴定方法不足以反映土壤环境中微生物的真实情况,需要现代分子生物学技术进行补充,如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、单链构象多态性分析(SSCP)等技术,这些技术可以根据微生物的DNA 序列遗传多态性,揭示出其群落结构及其多态性。
PCR-TGGE在土壤微生物中的应用
1、PCR-TGGE 结合对土壤样品进行研究
TGGE 应用于微生物分子生态学的初期,通常是结合PCR与 TGGE技术对环境土壤样品进行分析,以了解环境中的微生 物群落的结构及其变化。
Felske等扩增16SrDNA的V6～V8区,将得到的产物进行 TGGE分析,并根据TGGE图谱上带型及条带亮度估计草地 土壤样品中各类细菌16SrDNA的比例[11]。Smit结合TGGE 分析小麦根际土壤真菌的组成、多样性和种群动态,获得了 很好的带型和重复性。
2、标记技术与PCR-TGGE 结合对土壤样品进行研究
TGGE与标记技术的结合分析,是在对PCR扩增产物进行梯度 凝胶电泳后,以TGGE 图谱上的条带为原始模板,制备带有标 记的核苷酸探针,与已知纯培养物的相应基因扩增产物进行杂 交,分析确定TGGE图谱上特定条带的微生物种类。 Heuer等以TGGE图谱上回收的条带为原始模板,制备带有 地标记的16SrDNAV6～V8( F984GC-R1057)可变区核苷酸 探针,分别与等量的来自于克隆和细菌纯培养物的16S rDNA 进行杂交,鉴定转基因马铃薯根围土壤样品群落指纹图中与 分离到的菌株相对应的条带。
PCR-TGGE 技术的优点
TGGE 技术可直接对提取的土壤样品总DNA 进行微生物多 样性分析, 其优点是:PCR-TGGE技术的优点是可靠、重现 性好、方便快捷,适合于大量样品快速分析。可用于不同微 生物群落之间的差异分析,也可进行同一种微生物群落随时 间和环境变化演替规律的研究,是微生物群落遗传多样性和 动态分析的有力工具。
PCR-TGGE 技术的局限性
TGGE技术也存 在一 定局限性。Muyzer等指出 TGGE 检测的 DNA片段长度范围以 200bp~ 900bp 为好, 超出此范围的片段 难以检测; PCR 扩增所需 G/C 碱基对含量至少40%;TGGE 仪 器所允许的温度范围为 15℃~ 80℃, 较大片段DNA 的Tm 值因 为接近80℃而使检测难度提高; 若电泳条件不适宜, 不能完全 保证将有序列差异的DNA片段分开, 从而出现序列不同的 DNA迁移在同一位置的现象。此外, 在TGGE 检测的基础上往 往需结合杂交技术或核酸测序分析才能得到更详尽的信息。
PCR_DGGE技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用
第23卷第8期2003年8月生 态 学 报A CTA ECOLO G I CA S I N I CA V o l .23,N o.8A ug .,2003PCR -D GGE 技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用罗海峰,齐鸿雁,薛 凯,张洪勋(中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究室,北京 100085)基金项目:国家“十五”科技攻关重点项目(2001BA 903B )收稿日期:2003201213;修订日期:2003204201作者简介:罗海峰(1975～),男,陕西凤翔人,博士生,主要从事环境微生物分子生态学研究。
E 2m ail :luo 2222@ho tm ail .comFoundation ite m :T he N ati onal Key Science and T echno logy P ro ject (N o .2001BA 903B )Rece ived date :2003201213;Accepted date :2003204201Biography :LUO H ai 2Feng ,Ph .D .candidate ,m ain research field :mo lecular eco logy of environm ental m icro 2o rganis m .摘要:变性梯度凝胶电泳技术(D GGE )在微生物生态学领域有着广泛的应用。
研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组DNA ,并以此基因组DNA 为模板,选择特异性引物F 357GC 和R 518对16S rRNA 基因的V 3区进行扩增,长约230bp 的PCR 产物经变性梯度凝胶电泳(D GGE )进行分离后,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。
结果说明,D GGE 能够对土壤样品中的不同微生物的16S rRNA 基因的V 3区的DNA 扩增片断进行分离,为这些DNA 片断的定性和鉴定提供了条件。
T-RFLP技术在土壤微生物群落结构研究中的应用
目
1
录
RFLP简介
2
RFLP研究的发展
3
T-RFLP技术在土壤微生物群落结构中的应用
RFLP（限制性片段长度多态性标记）
• Restriction Fragment Length Polymorphism
• 原理：
RFLP是由于染色体上单核苷酸突变或插入及缺失突 变导致限制性酶切位点的增加或减少，从而导致 DNA酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是 应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。
T-RFLP在土壤微生物群落结构研究中的重要性
传统调查一直是建立在分离和培养的基础上。这种方法不但
费时费力，而且不够准确。这反映在如下几个方而:
1) 微生物群落组成极度复杂，采用传统方法工作量巨大。 2) 反应结果的阳性阴性有时不好判断，容易产生偏差，导 致鉴定错误。 3) 培养的方法对菌有选择性。 4) 环境中的绝大多数微生物是不可培养的。
标记没有发育阶段或器官的特异性，不受环境条件及基 因互作的影响。
RFLP研究的发展
基因组DNA 酶 切 对 象 RFLP
PCR产物
PCR-RFLP
末端荧光标记 的PCR产物
T-RFLP
PCR-RFLP
聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析
• 是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技术。 当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有 特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。
这在实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限，主要ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ决
于亲本材料的来源。正常情况下用6到8种酶来筛选多态性。不 同的酶产生的多态性大不相同。
PCR_DGGE技术及其在微生物生态学中的应用
PCR -DGGE 技术及其在微生物生态学中的应用张宝涛1,王立群13,伍宁丰2,石鹏君3(1.东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030;2.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;3.中国农业科学院饲料研究所,北京100081)摘要:现代分子生物学技术PCR -DGGE 是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究生态系统中微生物多样性和群落动态性。
本文简要介绍了PCR -DGGE 技术原理及其在微生物生态学领域的应用,并对该技术的局限性进行了评价。
关键词:PCR -DGGE ,微生物生态学,现代分子生物学技术,微生物多样性,微生物群落动态性中图分类号:Q93811 文献标识码:A 文章编号:1672-5565(2006)-03-132-04收稿日期:2005-10-24;修回日期:2005-10-29作者简介:张宝涛(1980-),男,山东人,硕士研究生,主要从事环境微生物和应用微生物的研究.E -mail :jonbob @ 3通讯作者:王立群,男,黑龙江省人,教授,主要从事应用微生物学研究。
E -mail :W angliqun2@Application of PCR -D GGE in microbial ecologyZH ANG Bao -tao 1,W ANGLi -qun13,W U Ning -feng 2,SHI Peng -jun3(1.College o f life science ,Northeast Agricultural univer sity ,Harbin 150030China ;2.Biotechnology Research Institute Chinese Academy o f agricultural Sciences.Beijing 100081China ;3.Feed Research Institute ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China )Abstract :As a m odern m olecular technology ,PCR -DGGE is a power ful tool for the analysis of microbial communities ,which can be used to study the diversity and dynamics of microbial communities.The principle and the application of PCR -DGGE in microbial ecology is briefly in 2troduced ,while the limitations of this technique are evaluated in this paper.K ey Words :PCR -DGGE ;microbial ecology ;m odern m olecular technology 在微生物生态研究中,准确地分析测定微生物群体的类型和数量是非常重要的,因为微生物个体微小,结构简单,缺乏明显的外部特征,且难以依据生理生化特征进行分类鉴定。
PCR-DGGE技术在泥土微生物多样性研究中的应用
PCR-DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用1 研究背景土壤是微生物生命活动的重要场所，作为土壤的重要组成部分，微生物对土壤肥力的形成与植物营养的转化起着积极的作用。
土壤中微生物种类、数量的变化及分布，既反应了土壤各因素对微生物种类及分布的影响和作用，也反应了微生物对土壤肥力、物质循环及能量转化的影响和作用，直接影响着土壤的肥力状况，揭示了土壤发育现状及趋势。
土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，研究土壤里的微生物群落结构演替规律、微生物种群动态变化对于丰富现有微生物菌种资源，保持地球微生物物种的多样性及土壤的可持续利用都具有重要意义，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。
定量和定性的描述土壤微生物多样性是微生物生态学的难题之一。
长期以来，囿于研究方法的限制，人们多采用常规的分离纯化培养技术来研究土壤里复杂的微生物多样性，但是这些方法都存在着诸多不可避免的缺陷性，只能够培养出自然界里0．1％～1 0％的微生物，因此有关土壤微生物的多样性研究进展不大。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，DNA指纹图谱技术被不断应用于土壤微生物多样性的检测，使得人们从基因遗传水平上去更深入、更广泛地认识土壤中微生物的多样性成为可能。
变性梯度凝胶电泳技术(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是由Fischer和lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。
1993年MuZyer等首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。
由于DGGE具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点，短短的10年内，已经成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具，被广泛用于土壤特殊微生物生理类群，自然环境条件下土壤微生物多样性变化，污染土壤，不同种植制度下的土壤以及转基因植物、微生物介入的土壤微生物多样性等方面的研究。
应用pcr钢rf lp技术能够检测基因的突变型与野生型
应用pcr钢rf lp技术能够检测基因的突变型与野生型基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础，结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途径，并取得了令人瞩目的成果.基因突变是癌基因激活，抗癌基因失活及遗传病发生的根本原因，从广义的角度来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它仍所涉及的范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常的涉及的范围较少，它是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因分析的主要研究内容.不同类型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。
PCR在突变基因检测时的应用利用核酸探针及Southern印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满足这际工作的需要，自从PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织亦可经PCR扩增而进行中种检测，加上PCR技术与探针杂交技术，RFLP技术及PCR直接测序的结合，改换方法得以迅速发展和推广，大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因的研究进展.一、点突变的PCR直接检出(一)用PCR直接检测缺失:当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物，然后进行PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外检测仪下检测有无特异性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无DNA 片段的缺失.1.一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚，其缺失部位亦较为固定，即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR，然后琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际应用中，为了避光因某些原因引起的扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应用PCR技术进行X地贫Bartα基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时，常用一对引物扩增缺失区域，同时同一对β基因引物扩增β基因的一个片段，然后电泳检测.若同时即有α和β基因的特异性扩增产物，则说明α基因的扩增产物则说明模板DNA中有α 基因的缺失，为Bart胎儿水肿综合征.2.多对引物的多重PCR检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质性，即在不同患者其缺失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一PCR体系扩增多个外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如，则可判定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行的检测途径，目前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在DMD/BMD缺失型突变的检测中，用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出，另外还有人用9对物进行两组多重PCR，大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突变.3.用PCR技术进行杂合性丢失的检测：有报道，PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检测.(二)单个碱量置换的PCR直接检出1.直接检测限制性内切酶切点的变化-PCR产物酶解分析PCR产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变--包括所增加的酶切位点及原有的酶切点消失的单碱是量置换性点突变.当某一点突变引起DNA片段中酶切位点发生改变时，则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段，然后用相应的内切酶进行处理，电泳检测，与正常的无改变的段进行对片分析即可确定有无酶切位点的改变.比如状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变的改，正常情况下靶DNA 的扩增产物为294bp，经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段，但镰状细胞贫血的突变使该切点消失，OxaNI消化后仍为294bp的片段，而杂合子则是有294、191和103 三个片段。
PCR技术在环境监测中的应用
PCR技术在环境监测中的应用作者：李惠民， LI Hui-min作者单位：商洛职业技术学院,陕西,商洛,726000刊名：商洛师范专科学校学报英文刊名：JOURNAL OF SHANGLUO TEACHERS COLLEGE年，卷(期)：2005,19(4)被引用次数：1次1.Fricher E J;Murrin K;Fricher C R The use of PCR for the detection of bactena and viruses 2000(02)2.Marx F E Animproved test System for PCR-based specifc detection of Echinococcus multilocularis eggs 19953.Gajardo R Polymerase chain reaction amplication and typing of Rotavirus in environmental samples 19954.Shu-Chen Hsu PCR primers designed from malic acid dehydrogenase gene and their use for detection of Escherichia coli in water and milk samples[外文期刊] 20015.Turner S J Detection of sewage-derived Escherichia coli in rural stream using multiplex PCR and automated DNA detection 19976.Rochelle P A Comparison of primers and optimization of PCR conditions for detection of Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia in water.Appl[外文期刊] 1997(1)7.陈维田;J Burnett;陆勇军空调冷却塔水与空气军团菌的PCR方法快速检测[期刊论文]-环境科学 2000(04)8.杨庆宇;周琪PCR-DGGE分析脱苯脱酚生物塔中的生物多样性[期刊论文]-污染防治技术 2004(01)9.岳春梅分子生物学技术在环境微生物监测中的应用[期刊论文]-微生物学通报 2000(02)10.腾应重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析[期刊论文]-土壤学报 2004(03)11.文其乙;刘秀梵多重聚合酶链反应检测污水中产气荚膜梭菌[期刊论文]-扬州大学学报(自然科学版) 2001(04)12.Niederhauser C Use of Polymerase chain reaction for detection of listeria monooytogenes in food 1992(05)13.Hallier-Soulier S;Guillot E Immunomagnetic separation-PCR for ultra-sensitive and specific detection of Cryptosporidium parvum oocysts form drinking water samples 2000(02)14.Llop;Pablo;Caruso A simple extraction procedure for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plant material by polymerase chain reaction[外文期刊] 1999(01)15.Zehr J P;McReynolds L A Use of degenerate oligonucleotides for amplification of the mifH gene from the marine cyanobacterium trichodesmium thiebautii 1989(10)1.丁清波.戴浩.吴敬波.方东明.Ding Qingbo.Dai Hao.Wu Jingbo.Fang Dongming FQ-PCR技术在饮用水微生物监测中的应用[期刊论文]-黑龙江环境通报2009,33(4)2.李庆义.刘小真.LI Qing-yi.LIU Xiao-zhen PCR技术在环境监测中的应用态势[期刊论文]-江西科学2008,26(3)3.曹蓉.李希明.宋永亭.高光军PCR技术对水中病原体的检测[期刊论文]-中国环境监测2004,20(1)4.李丽芳.商慧敏.宋微波利用RAPD技术对海洋纤毛虫,弗州拟尾丝虫四种群的研究[期刊论文]-高技术通讯2003,13(1)。
实时荧光定量PCR技术在农业生产中的应用
实时荧光定量PCR技术在农业生产中的应用随着科技的不断进步，各行各业均受益于现代技术的发展。
在农业生产中，因为需求的不断变化和市场的变化，追求高产高效、高质高效已经成为当下农业发展中非常重要的问题。
而实时荧光定量PCR技术作为一种新型的分子生物学方法，近年来开始在农业生产中广泛应用。
什么是实时荧光定量PCR技术？实时荧光定量PCR技术（qPCR）也叫荧光定量PCR技术，是PCR技术的一种变体，也是PCR技术的热点和前沿方向之一。
简单来说，qPCR技术是通过扩增靶标序列，利用荧光探针进行实时定量检测，从而判断靶标物的存在量。
这种技术主要依赖于荧光标记技术和光学检测技术，能够实现高通量检测，快速、准确地检测目标物质的存在量和变化趋势。
1. 植物新品种的筛选在植物育种中，一般通过种子的大量筛选来选择优良品种。
然而，基因的表达和调控更是植物新品种育种的关键要素。
而利用qPCR技术可以更高效、快速地筛选出高产、耐病、抗旱和适应性强的新品种。
2. 植物疾病诊断qPCR技术可以检测到微生物、病毒、真菌等引起植物疾病的病原体和病因，从而可以对植物疾病进行快速诊断。
临床检验表明，在检测结果的准确性、灵敏性和特异性方面，qPCR技术要明显优于传统的菌落计数法和生物学检测法。
3. 食品安全检测食品的安全与人们的健康密切相关。
qPCR技术可以实现对食品中的微生物、病毒、病原体等进行快速检测，从而确定食品是否符合国家标准。
总结实时荧光定量PCR技术具有高效性、准确性和灵敏性等优点，在农业生产中的应用前景广阔。
通过这一技术可以更快速、更精准地解决生产中的各种问题，从而提高农业生产效率和品质，为农业生产带来新的发展机遇。
农业行业中农业生物检测技术的使用方法
农业行业中农业生物检测技术的使用方法随着科技的不断进步和农业的现代化发展，农业生物检测技术在农业行业中的应用也越来越广泛。
农业生物检测技术可以帮助农民、农场主和农业科研机构监测和诊断农作物和农业生产环境中存在的问题，从而提高农业生产的效率和质量。
下面将介绍农业生物检测技术的使用方法。
一、农作物病害检测技术的使用方法农作物病害是导致农作物减产和质量下降的主要原因之一。
通过农业生物检测技术，可以快速、准确地检测农作物的病害，并及时采取措施进行治疗。
农业生物检测技术通常包括PCR技术、ELISA技术和基因测序技术等。
首先，通过PCR技术可以检测农作物中的一系列病原体DNA或RNA。
PCR技术是一种快速、高效、敏感的检测方法，可以检测农作物中的细菌、病毒和真菌等病原体。
该技术需要提取农作物样品中的DNA或RNA，并用特定的引物进行扩增反应。
通过PCR扩增产物的检测，可以确定农作物是否感染了特定的病原体。
PCR技术在农业中的应用十分广泛，可以帮助农民针对特定病害采取有针对性的防治措施。
其次，ELISA技术是一种免疫学检测技术，通过检测农作物中的特定抗原或抗体，来确定农作物是否感染了特定的病原体。
该技术需要提取农作物样品中的相关物质，并利用特定的抗原或抗体与其反应。
通过测量反应的光学密度，可以确定农作物是否感染了特定的病原体。
ELISA技术在农业中的应用也十分广泛，可以快速地检测农作物中的病原体感染情况，以便及时采取防治措施。
最后，基因测序技术是一种高通量测序技术，通过对农作物基因组进行测序，可以帮助科研人员了解农作物基因组的组成和功能，从而研究农作物的抗病性和适应性等性状。
基因测序技术在农业科研中起到了重要的作用，不仅可以提供农作物育种的理论依据，还可以引导农业生产和抗病防治。
二、农产品质量检测技术的使用方法农产品质量检测是确保农产品质量安全的重要措施之一。
通过农业生物检测技术，可以对农产品中的有害物质进行快速检测和准确测量，保障农产品的质量与安全。
农作物病虫害的分子诊断技术
农作物病虫害的分子诊断技术农业是人类社会的重要支柱之一，而农作物病虫害是农业生产中常见的问题。
病虫害的爆发不仅会导致产量的锐减，还会对农业生态系统造成不可逆转的损害。
因此，及时准确地诊断并控制农作物病虫害，对于保障粮食生产和农业可持续发展至关重要。
幸运的是，随着分子生物学和生物技术的发展，分子诊断技术在农作物病虫害管理中发挥了重要作用。
一、PCR技术在农作物病虫害分子诊断中的应用聚合酶链反应（PCR）是一种基于DNA复制的技术，通过特异性引物扩增目标DNA片段，从而实现对农作物病虫害的分子诊断。
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高效性的优点，可以准确地检测并鉴定一些常见的农作物病虫害病原体。
例如，对于玉米病原菌镰刀菌的检测，可以设计特异性引物扩增镰刀菌的基因序列，从而对病原菌进行准确、快速的诊断。
此外，PCR技术还可以用于农作物抗病基因的鉴定，帮助选育抗病品种，提高农作物的抗病能力。
二、DNA芯片技术在农作物病虫害分子诊断中的应用DNA芯片技术是一种高通量的分子生物学技术，常用于同时检测多个基因或多个样品。
在农作物病虫害分子诊断中，DNA芯片技术可以用于大规模的病原体鉴定和分类。
通过将多个病原体的DNA片段固定在芯片上，并使用病原体特异性的探针进行杂交，可以快速、准确地检测并区分多个病原体。
利用DNA芯片技术，病原体的鉴定时间大大缩短，从而提高了农作物病虫害防控的效率。
三、基因编辑技术在农作物病虫害分子诊断中的应用近年来，基因编辑技术在农业领域的应用越来越广泛。
基因编辑技术可以精确地修改植物抗病基因的序列，从而增强植物的抗病能力。
在农作物病虫害分子诊断中，基因编辑技术可以用于鉴定和研究与农作物病虫害相关的基因。
例如，在抵抗水稻白叶枯病的研究中，利用CRISPR-Cas9系统对水稻相关基因进行编辑，可以验证其与病原体互作的作用机制，为进一步研究提供重要依据。
总结起来，分子诊断技术在农作物病虫害的防控中发挥着重要的作用。
《2024年鹿血的PCR-RFLP鉴定方法研究》范文
《鹿血的PCR-RFLP鉴定方法研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，遗传标记技术在生命科学研究、疾病诊断和动物品种改良等方面具有重要应用价值。
其中，多态性分子标记是进行种质鉴定和品种选育的关键工具之一。
近年来，对于中药材中成分的来源、品种真伪以及遗传稳定性的研究日益受到关注。
鹿血作为一种具有重要药用价值的天然资源，其品质的准确鉴定显得尤为重要。
本研究旨在探讨PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性）鉴定方法在鹿血中的应用，为鹿血品质的遗传学研究提供理论依据和鉴定方法。
二、研究内容（一）研究背景与目的本部分介绍鹿血的市场现状、遗传多态性的研究意义和当前该领域的研究进展。
明确本研究的目的：通过PCR-RFLP技术对鹿血进行遗传鉴定，为鹿血品质的准确鉴定提供科学依据。
（二）材料与方法1. 实验材料：采集不同来源的鹿血样品，并选择适当的分子标记基因序列。
2. 实验方法：采用PCR技术对基因片段进行扩增，利用RFLP技术对扩增产物进行酶切分析，观察酶切后片段长度的变化，分析其多态性。
（三）实验过程1. 基因组DNA提取：从鹿血样品中提取基因组DNA。
2. PCR扩增：以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，获得特定基因片段。
3. RFLP分析：将PCR产物进行酶切分析，观察酶切后片段长度的变化。
4. 数据处理与分析：对酶切后的片段长度进行统计，分析其多态性。
三、实验结果与分析（一）PCR扩增结果通过PCR扩增，成功获得了特定基因片段。
扩增产物经电泳检测，可见清晰、单一的条带，表明PCR扩增成功。
（二）RFLP分析结果对PCR产物进行酶切分析，观察酶切后片段长度的变化。
结果表明，不同来源的鹿血样品在酶切后产生了不同的片段长度变化，表明其具有多态性。
（三）数据分析与结果解读对酶切后的片段长度进行统计，分析其多态性。
结果表明，不同来源的鹿血样品在特定基因位点上存在显著差异，这为鹿血的品种鉴定和品质评估提供了有力依据。
稻田土壤固氮微生物的多态性研究方法进展
稻田土壤固氮微生物的多态性研究方法进展
罗青;宋亚娜;郑伟文
【期刊名称】《福建农业学报》
【年(卷),期】2005(020)0z1
【摘要】稻田土壤固氮微生物群落的地理分布和多样性,为生物固氮在农业实践中的高效应用提供了有力证据.实验室中传统的微生物分离、培养和分类方法,在反映土壤微生物的基因信息上有很大的局限,因此目前逐渐地被分子生物学的方法替代.PCR(聚合酶链式反应)-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术能够很好地分离PCR产物中的具体基因,为在时间与空间上追踪优势菌株提供了新的方法.该文以PCR-DGGE技术为主,阐述了利用分子生物学技术研究稻田土壤固氮微生物多样性的基本原理及研究进展.
【总页数】5页(P149-153)
【作者】罗青;宋亚娜;郑伟文
【作者单位】福建省农业科学院生物技术研究所,福建,福州,350003;福建农林大学生命科学学院,福建,福州,350002;福建省农业科学院生物技术研究所,福建,福州,350003;福建省农业科学院生物技术研究所,福建,福州,350003
【正文语种】中文
【中图分类】S154;Q7
【相关文献】
1.稻田土壤固氮微生物的多态性研究方法进展 [J], 罗青;宋亚娜;郑伟文
2.秸秆还田与施肥对稻田土壤微生物生物量及固氮菌群落结构的影响 [J], 刘骁蒨;涂仕华;孙锡发;辜运富;张先琴;张小平
3.PCR-DGGE法研究福建省稻田土壤微生物地区多态性 [J], 罗青;宋亚娜;郑伟文
4.微生物影响稻田土壤中砷转化研究进展 [J], 黄思映;杨旭;钱久李;黎华寿
5.根际固氮微生物功能基因组及微生物肥料研究进展 [J], 燕永亮;李力;李俊
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
南京农业大学学报2005,28(3):53~57J ournal of N anj i ng A gricult ural Uni ver sity应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测农田土壤微生物短期动态变化赵勇1,3,李武2,周志华2,潘迎捷3,赵立平2*(11南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095;21上海交通大学生命科学技术学院,上海200240;31上海水产大学食品学院,上海200090)摘要:在一块农田里于一个月内连续采集5次土样,提取土样微生物总DNA,应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测土壤微生物的动态变化。
结果表明,细菌16S rDNA和真菌18S r DNA的PCR-RFLP图谱在5个采样时间点上基本一致;细菌的PCR-TGGE图谱平均有40条带,其相似性在90%以上,真菌的平均有20条带,其相似性在70%以上。
说明这块农田土壤细菌区系短期内变化不大,而真菌区系存在较小幅度的动态变化,并且细菌多样性远远高于真菌多样性。
比较两种分子生物学方法的结果表明,PCR-TGGE技术比PCR-RFLP技术更能精确地反映土壤微生物的动态变化,并且能同时快速地对多个样品进行有效区分。
关键词:土壤微生物;动态变化;土壤DNA提取;PCR扩增;RFLP分析;TGG E分析中图分类号:Q938文献标识码:A文章编号:10002030(2005)03005305Preli m i nary study on s hort-ter m dyna m ics of agricultural soilm icrobi al co mm unity by PCR-RFLP and PCR-TGGE techni quesZ HAO Yong1,3,L IW u2,ZHOU Zh-i hua2,P AN Y ing-jie3,Z HAO L-i ping2*(11Co llege of L ife Sciences,N anji ng A g ricu ltura lU n i versity,N anji ng210095,Chi na;21Schoo l o f L ife Sc i ences and B i o techno l ogy,Shanghai Jiaotong U n i versity,Shangha i200240,China;31Co llege of Food Sc i ences,Shangha i F ishe ries U niversity,Shangha i200090,Chi na)Abstrac t:W e st udied the sho rt-te r m dyna m ics of agr i cultural so ilm icrob i a l comm un it y by PCR-RFLP and PCR-TGGE techn i ques. T he results show ed t hat t he PCR-RFLP patte rns of bac teria l16S rDNA and fungal18S rDNA w ere si m ilar a m ong5so il sa m ples wh ich we re conti nua lly samp l ed from a fie l d i n one m ont h,the si m ilar ity o f bacter i a l community PCR-TGGE pa tterns w ere up to 90%,w it h40bands ave rage l y pe r samp l e,and that of funga l co mmunity w ere up t o70%,w ith20bands average l y per sa m ple.It de m onstrated that i n t h i s field so il bac terial co mmunity w as re l atively stab l e i n short-ter m per i od,wh ile fungal co mmun ity had so m e ex tent changes,and bacteria l d i versity w as far g rea ter t han that of f ung.i It a l so m an ifested tha t PCR-TGGE is super i or to PCR-R FLP f o r deta il dyna m i cs of so ilm icrobia l community,and it is a rapid m ethod to d i scri m i nate mu lti ple sa mp les si m ultaneousl y.K ey word s:so il m icroo rganis m s;dyna m i cs;so il DNA ex tracti on;PCR a m plifi cation;RFLP ana l ys i s;TGGE ana l ysis对于农田土壤微生物的研究,传统上是采用分离培养的方法,然而已往的研究表明,土壤中只有大约011%~1%的微生物是可培养的[1]。
因此,不经培养直接从土壤样品中提取微生物总DNA进行分析的分子生物学方法被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[2]。
M arti n-Laurent等[3]应用PCR-RFLP技术比较了3种不同土壤微生物的组成差异,Cheung等[4]应用PCR-TGGE技术研究了石油污染土壤中分枝杆菌(M y cobacterium)的多样性。
关于土壤微生物的分子生态学研究,国内起步较晚。
陈灏等[5]、罗海峰等[6]都应用PCR-DGGE技术对不同农田土壤微生物种类分布进行了初步研究。
而应用分子方法对农田土壤微生物动态变化的研究,国内未见报道。
本研究应用基于DNA的两种分子方法(PCR-RFLP及PCR-TGGE技术)监测了同收稿日期:20041024基金项目:上海市农委资助项目(2002442;2003152)作者简介:赵勇(1975),博士研究生。
*通讯作者C orres pondi ng au t hor:赵立平(1962),教授,博导,主要从事微生物基因组学与分子生态学研究m ai:l l p z hao@s jt u1edu1cn。
一块农田中土壤细菌区系和真菌区系在一个月内的动态变化,旨在为农田土壤微生物的分子生态学研究提供基础资料。
1 材料和方法111 土壤样品采集采样地点:上海交通大学闵行校区东区外围农田。
采样时间:2004年4月1日、8日、15日、22日、29日上午10:00(样品编号依次为1、2、3、4、5)。
采样期间,农田闲置,未耕种;采样时天气晴好,平均气温22e 。
采样方法:在农田4个角及中心共5个点采样,取0~10c m 表层土壤,过20目筛(孔径019mm ),将5个点的土样等量混匀后,在实验室内室温放置24h ,进行土壤总DNA 提取。
土壤性质:泥沙土,持水量为45%,p H 值为(518?012)。
112 土壤DNA 提取及纯化试验在室温条件下进行。
称取015g 土样,置于10m L 灭菌离心管中,加3mL TE NP buffer (50mmo l #L -1Tris ,20mm o l #L -1EDTA,100mm ol #L -1NaC ,l 0101g #m L -1P VPP ,p H 10),旋涡震荡10m i n ,12000r #m i n -1离心5m i n ,弃上清液。
在土壤颗粒沉淀中再加3mL TENP buffer ,按上述方法再洗涤2次,最后加3mL PBS buffer (8g NaC,l 012g KC ,l 1144g Na 2H PO 4,0124g KH 2PO 4,溶于1L 灭菌去离子水中,pH 714)洗涤1次。
在洗涤好的土样中加入0135g 灭菌玻璃珠(直径约1mm )和2mL DNA extracti o n buffer (100mm ol #L -1Tr i s ,100mm o l #L -1EDTA,200mmo l #L -1N aC,l 2%P VPP ,3%CTAB ,p H 910),高强度旋涡震荡10m i n ,再加入500L L 溶菌酶(100m g #mL-1),高强度旋涡震荡5m i n ,37e 水浴30m i n (每隔10m in 用手上下颠倒离心管3次)。
水浴结束后温和旋涡震荡5m i n ,再加入2mL SDS buffer (100mm o l #L -1Tris ,200mm ol #L -1NaC ,l 3%SDS ,p H 910),用手上下颠倒5m i n ,65e 水浴30m i n (每隔10m i n 用手上下颠倒离心管3次),8000r #m i n -1离心15m in ,收集中间的液相层。
剩余的残渣中再加1mL DNA extraction buffer 和1mL SDS bu ffer ,65e 水浴5m in ,8000r #m i n -1离心15m i n ,收集中间液相层。
按上述方法把残渣再抽提1次,收集的液相层与前两次的合并,12000r #m in -1离心5m i n ,收集上清液,用等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24B 1)抽提1次,15000r #m in -1离心20m i n ,收集上清液,并加入011倍体积的3m o l #L -1N a Ac (p H 512),用手颠倒混匀后,加入016倍体积异丙醇,室温沉淀DNA 1h,15000r #m i n -1离心20m i n ,弃上清液。
DNA 沉淀用70%乙醇洗涤1次,冷冻干燥后将粗DNA 溶于500L L 灭菌dd H 2O 中。
在粗DNA 溶液中加入等体积酚,颠倒混匀,15000r #m in -1离心20m i n ,收集上清液;加入等体积氯仿/异戊醇(体积比为24B 1),颠倒混匀,15000r #m i n -1离心20m i n ,收集上清液;加入011倍体积3m ol #L -1Na A c (pH512),颠倒混匀,加入016倍体积异丙醇沉淀DNA 1h ,15000r #m in -1离心20m i n ,弃上清液。
DNA 沉淀用70%乙醇洗涤1次,冷冻干燥后溶于100L L 灭菌dd H 2O 中。